PLoS ONE: MicroRNA-196a er en formodet Diagnostic Biomarkør og terapeutisk mål for larynx Cancer

Abstrakt

Baggrund

MicroRNA (miRNA) er en ny underklasse af små ikke-kodende RNA, der regulerer genekspression og har en central rolle i mange fysiologiske processer, herunder udvikling af cancer. Nylige rapporter afslørede rolle miRNA som ideelle biomarkører og terapeutiske mål på grund af deres vævs- eller sygdomsspecifikke natur. Hoved- og halskræft (HNC) er en væsentlig årsag til kræft-relaterede dødelighed og sygelighed, og larynx cancer har den højeste forekomst i det. Men de molekylære mekanismer involveret i larynx udvikling af kræft er fortsat at være kendt og meget følsomme biomarkører og nye lovende terapi er nødvendig.

Metode /vigtigste resultater

At udforske larynx cancer-specifikke miRNA, RNA fra 5 larynx kirurgiske enheder, heriblandt kræft og ikke-kræft væv blev hybridiseret til microarray transporterer 723 menneskelige miRNA. De resulterende differentielt udtrykte miRNA blev yderligere testet ved anvendelse af kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) på 43 larynx vævsprøver, herunder cancere, noncancerous modstykker, godartede sygdomme og præcancerøse dysplasier. Væsentlige udtryksmæssige forskelle mellem matchede par blev gengivet i miR-133b, miR-455-5p, og miR-196a, blandt hvilke miR-196a er den mest lovende kræft biomarkør som valideret af QRT-PCR-analyser på yderligere 84 vævsprøver. Deep sekventering analyse viste både kvantitativ og kvalitativ afvigelse miR-196a isomiR udtryk i larynx cancer. In situ bekræftede hybridisering larynxcancer-ekspression af miR-196a i både kræft og kræft stroma celler. Endelig hæmning af miR-196a modvirket kræft celle proliferation i både larynx cancer-afledte celler og mus xenograftmodel.

Konklusioner /Betydning

Vores undersøgelse forudsat de muligheder, miR-196a kan være meget anvendelige i diagnosticering og behandling larynxcancer

Henvisning:. Saito K, Inagaki K, Kamimoto T, Ito Y, Sugita T, Nakajo S, et al. (2013) MicroRNA-196a er en formodet Diagnostic Biomarkør og terapeutisk mål for larynxcancer. PLoS ONE 8 (8): e71480. doi: 10,1371 /journal.pone.0071480

Redaktør: Valerie W. Hu, The George Washington University, USA

Modtaget: 8. februar 2013; Accepteret: 28 Juni 2013; Udgivet: 14 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Saito et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. En del af dette arbejde blev understøttet af en Grant for Industrial Technology Research i den Nye Energi og Industrial Technology Development Organization (NEDO; https://www.nedo.go.jp/english/index.html). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Selv om nogle af forfatterne er ansat af kommercielle selskaber (Y. Ito, T. Sugita, og S. Nakajo af SRL, Inc., T. Ishikura, H. Hanaoka, og T. Onozaki af Life Technologies Japan), de har ingen konkurrerende interesser vedrørende dette arbejde. Disse ansættelser ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

I 2004 28,260 nye tilfælde af mundhulen og svælg kræft og 20,260 nye tilfælde af larynx cancer blev diagnosticeret i USA, hvilket resulterer i 7.230 og 3.830 dødsfald henholdsvis [1], [2]. Trods betydelige fremskridt i kirurgi og strålebehandling i de seneste årtier, har de 5-årige overlevelsesrater for hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) patienter blevet forbedret kun moderat delvis på grund af den relativt høje lokalt recidiv rate. På nuværende tidspunkt er locoregional HNC behandlet med en kombination af kirurgi og strålebehandling med eller uden kemoterapi, mens hver behandlingsform resulterer i katastrofale følger for tale og synkning funktion. Desuden kirurgiske procedurer i hoved og hals og mundhulen region almindeligvis medføre betydelige kosmetiske deformiteter. Selv med tilgange nævnt den kombinerede behandling, patienter med fremskreden HNC er således behov for hidtil ukendte og mindre invasive behandlinger for deres høje morbiditet sygdom. I denne undersøgelse, tænker betydelig heterogenitet HNSCC tumorer, har vi fokuseret på en enkelt veldefineret anatomiske placering, strubehovedet. Mens larynxcancer er meget helbredes enten ved kirurgisk fjernelse eller bestråling, når fundet og behandlet på den tidlige fase, fremskreden cancer forbliver meget mindre helbredes resulterer i nogen væsentlig forbedring af de samlede overlevelsesrater siden 1975 [3]. Således meget følsomme biomarkører opdage larynxcancer selv på det tidlige stadium uden kliniske symptomer, og markant effektive nye terapeutiske midler er nødvendigt yderligere at forbedre patientens resultater af larynx cancer. Endvidere til nuværende tilgange forudsige resultatet af HNSCC patienter omfatter undersøgelse under anvendelse klinisk-patologiske parametre som primær tumor, regional node, fjernt metastase (TNM) – fase, dybde af invasion, og differentiering kvalitet. Men disse parametre ikke præcist afspejler prognose af patienterne og yderligere prædiktorer og biomarkører vil være nyttigt for patientbehandlingen. Således molekylær- og cellebiologi er en lovende fagområde, der kan føre til opdagelsen af ​​hidtil ukendte biomarkører og nye terapeutiske mål.

microRNA (miRNA), der koder for et lille ikke-kodende RNA af -22 nucleotider, er nu anerkendt som en stor genfamilie udtrykt i planter, dyr og vira samt i encellede alger [4]. De fleste dyr miRNA er evolutionært bevaret og ofte findes i klynger [5]. Primære miRNA (pri-miRNA), der udgør hårnåle-strukturer er overvejende transskriberet af RNA-polymerase II og successivt behandlet af to RNase III-lignende enzymer, drosha i cellekernen og Dicer i cellecytoplasmaet, at generere modne miRNA [6] [7]. miRNA negativt regulere genekspression på posttranskriptionel niveau ved spaltning og /eller translationel undertrykkelse af deres mRNA-mål via interaktion under anvendelse perfekt baseparring i 5′-enden af ​​det modne miRNA, også betegnet frø region [8]. Nylige bioinformatik analyser rapporteret, at over 60% af protein-kodende gener har potentiale til at danne par med og blive kontrolleret af miRNA [9]. Yderligere undersøgelser har vist, at miRNA spiller meget vigtige roller i næsten alle aspekter af biologi, herunder metabolisme, celleproliferation, apoptose, udvikling og differentiering [10], [11].

I de senere år har der været en betydelig interesse i at forstå den rolle, miRNA i sygdomsprocesser og deres fejlregulering menes at fremme den maligne opførsel af tumorer [12]. Forbindelserne mellem afvigende ekspression af miRNA og patogenesen af ​​flere cancertyper [12] – [14] er dokumenteret

Det er også blevet rapporteret, at miRNA kunne være en ideel biomarkører til detektering kræft, fordi:. (I ) miRNA ekspression ofte dysreguleret i cancer [15], [16], (ii) ekspressionsmønstre for miRNA i human cancer synes at være vævsspecifik [17], og (iii) miRNA har usædvanlig høj stabilitet, selv i formalin-fikseret væv [18]. Endvidere har nyere omfattende miRNA forskningen også afsløret, at miRNA er lovende terapeutiske mål i kræft, herunder colon, bryst, mave og hepatocellulære maligniteter [19] – [26]

Alle disse spørgsmål er vigtige for at give en dybere. forståelse af de roller miRNA i HNSCC patogenese og som potentielle prognostiske og diagnostiske markører samt terapeutiske mål i HNSCC. I denne undersøgelse har vi profileret ekspressionen af ​​723 unikke humane miRNA i 3 larynx cancer 2 noncancerous larynx modstykker ved hjælp af oligonukleotid mikroanalyse med en hårnålestruktur inkorporeret på 5′-enden af ​​proben [27] fremstillet ved en ink-jet oligonucleotidsynteseapparat [28] (Agilent Menneskelig miRNA V2, Agilent Technologies) og identificeret flere miRNA, der kunne tjene som potentielle diagnostiske markører for sygdomme. Vi bekræftede endvidere udtryk for udvalgte miRNA hjælp QRT-PCR (TaqMan® miRNA analyser, Applied Biosystems) i 5 noncancerous modstykker, 14 polypper eller knuder, 12 dysplasier og 17 larynx kræft til at levere data tyder på, at ændrede ekspressionsniveauer af miRNA har en funktionel konsekvens i larynx cancer.

In situ

hybridisering (ISH) yderligere bevist markant differentieret udtryk for miRNA i kræft læsion i forhold til normalt pladeepitel.

Vi vurderet konsekvenserne af miR-196a hæmning

i yderligere

vitro

i

vivo

på væksten i HNSCC at vurdere potentialet af miRNA som en ny terapeutisk mål for HNC.

Materialer og metoder

Etik Statement

forsøgsprotokol med denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelsen for Keio University School of Medicine og Sano Kousei General Hospital. Alle vævsprøver blev taget med henblik på diagnostisk biopsi eller behandlinger fra de patienter, der blev opereret efter godkendelse af den undersøgelse, som den institutionelle gennemgang bord på Keio University School of Medicine og Sano Kousei General Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter

Dyrene blev plejet og anvendes i overensstemmelse med protokoller godkendt af Animal Care og brug Udvalg Keio University School of Medicine (Permit nummer til denne undersøgelse:. 10243- (0 )). Alle operation blev udført under tribromethanol anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Patienter og Prøver

En del af prøven blev behandlet for formalin-fikseret og paraffin-indstøbt (FFPE) procedure, efterfulgt af rutinemæssig patologisk analyser, medens den resterende væv blev mættet i RNA

senere

® (Ambion, Foster City, CA) og opbevaret ved -80 ° C indtil bearbejdning. Alle FFPE prøver blev revideret af erfarne patologer at bekræfte diagnoser. Patient karakteristika og patologisk iscenesættelse er sammenfattet i tabel 1.

Reagenser

Med mindre andet er angivet, rutinemæssige kemiske materialer blev opnået fra enten Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO) eller Wako ( Osaka, Japan). MIR-196a inhibitor (HSA-MIR-196a miRIDIAN Hairpin Inhibitor, IH-300.529-06) og inhibitor negativ kontrol (kontrol, miRIDIAN microRNA Inhibitor negativ kontrol nr. 1, IN-001.005-01) anvendt i denne undersøgelse blev indkøbt fra Dharmacon (Lafayette, CO). miRIDIAN Hairpin Inhibitor designet til at hæmme RISC funktionen af ​​målet miRNA med sin dobbeltstrenget region [29]. For

in situ

hybridisering (ISH) af MIR-196a, 3′-DIG-mærkede låst nukleinsyre-inkorporeret miRNA probe (miRCURY LNA ™ microRNA Detection Probe, Exiqon, Vedbæk, Danmark) blev anvendt i dette undersøgelse.

RNA-ekstraktion og microarray analyse af miRNA

Total RNA herunder lavmolekylære RNA fra vævsprøver og cancercellelinjer blev isoleret under anvendelse af Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) ifølge den producentens anvisninger. Kvaliteten af ​​RNA-prøver blev vurderet ved hjælp af en Agilent 2100 Bioanalyzer, og kun de prøver, der opfylder kriterierne i 28S /18S 1 og RNA Integritet Number (RIN) ≥ 7,5 blev anvendt til alle analyser

For. microarray analyse, vi brugte human miRNA microarray Kit V2 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), som indeholder 20-40 funktioner målrettet hver af 723 humane miRNA (Agilent design ID 019.118) [30], som kommenteret i Sanger miRBase, frigivelse 10.1 [31]. Mærkning og hybridisering af total RNA prøver blev udført ifølge producentens protokol. Et hundrede ng af total RNA blev anvendt som input i reaktionen mærkning, og hele reaktionen blev hybridiseret til hver opstilling i 20 timer ved 55 ° C. Resultaterne blev analyseret ved hjælp af Agilent GeneSpring GX7.3. Normale kontroller og kræft prøver blev sammenlignet ved anvendelse af Welch t-test (p 0,05) og differentielt udtrykte miRNA med mindst en 2-gange ændring i ekspression blev betragtet som potentielle biomarkører. Alle interne data for microarray analyse af miRNA blev deponeret i Gene Expression Omnibus (GEO) med et tiltrædelse antal GSE47610.

TaqMan® kvantitativ real-time PCR-analyse af miRNA

ekspressionsniveauer af hver miRNA blev bekræftet med TaqMan® Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) under anvendelse af individuelle, specifikke primere og prober ifølge producentens instruktioner (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kort fortalt blev 10 ng af totalt RNA revers transkriberet med miRNA-specifik stamme-loop-primere (Applied Biosystems), og PCR blev udført med det genererede RNA-specifikke cDNA i genspecifikke TaqMan® miRNA realtids-PCR assay løsning på en StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaktionen blev udført ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 45 cykler af 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 s. Alle prøver blev målt i tre eksemplarer, herunder kontroller uden skabelon. Normalisering blev udført med den lille nukleare RNA U6 (RNU6B; Applied Biosystems), og relative ekspression blev beregnet ved hjælp af sammenlignende Ct (cyklus tærskel) metode. Statistiske analyser blev udført ved anvendelse parret t-test til sammenligning af ekspressionsniveauer i matchede par og Tukey-Kramer test til sammenligning ekspressionsniveauerne mellem flere sygdomme og yderligere analyser blev udført ved parvis Mann-Whitneys U-test. Betydningen niveau blev sat til p. 0,05

Next Generation Sequencing af miRNA

Næste generation sekventering analyse blev udført ved hjælp af Applied Biosystems solid ™ -system og solid ™ Lille RNA Expression Kit ifølge sOLID ™ System 3 Brugervejledning (Applied Biosystems). Procentdelen af ​​små RNA pr totalt RNA masse blev beregnet ved Agilent 2100 Bioanalyzer. Den lille RNA indhold blev beriget ved hjælp flashPAGE ™ fraktionering (Ambion), hvis nødvendigt. De små RNA-arter (10-40 nt) blev derefter omdannet til cDNA-biblioteker under anvendelse af fast ™ små RNA Expression Kit (Applied Biosystems), efterfulgt af oprydning og udvælgelse størrelse ved PAGE omkring ~105-150 bp. Klonal amplifikation på perler med emulsion PCR blev udført ved den faste ™ ePCR kit. Tilberedte perler blev udsat for kvalitetskontrol køre og blev derefter sekventeret på fast ™ 3 Analyzer. I alt 11,6-35.900.000 sekvens læser blev opnået fra hvert bibliotek, og nedstrøms analyse blev udført ved hjælp af rørledning SOLID ™ System små RNA Analysis Pipeline Tool (corona RNA2MAP udgave 0,50). Alle aflæsninger blev kortlagt sekventielt imod (1) ribosomale RNA og transfer-RNA, (2) kendte referenceværdier sekvenser af miRNA i Sanger miRBase release 18, (3) hg19 humane henvisning genom samling (Genome reference Consortium GRCh37) samt human mitochondriegenom ( NC_001807.4). Summen af ​​antallet af korte læser at kortlagt til hver region af interesse blev normaliseret til den samlede henvisningen-kortlagt kort læser i hvert bibliotek prøve, og bruges som rå udtryk værdier af den tilsvarende region. Bevarelse og gentag oplysninger blev opnået ved hjælp af University of California Santa Cruz bord browser. Prøver analyseret omfatter 2 larynx kræftformer (T416, 66 yo mandlige, T3N0, T506, 74 yo mandlige, T3N2c) som avancerede kræft prøver og 3 larynx papillomer (T421, 33 yo mandlige, voksen debut, T484, 33 yo mandlige, voksen debut; T502, 38 yo mandlige, voksen debut) som prøver, der ikke kræft. Alle interne data for næste generations sekventering af miRNA blev deponeret i DDBJ Sequence Læs Arkiv (SRA) med et tiltrædelse antal PRJDB994.

In situ

hybridisering for miR-196a

in situ

detektion blev udført på serielle 4-um paraffinsnit herunder normal slimhinde og larynx cancer materiale af 74 yo mandlig patient, som gennemgik total laryngektomi for fuldstændig fjernelse af den avancerede T3 tumor. Snit blev afparaffiniseret og efterfølgende fordøjet med proteinase K (10 ug /ml) i 5 minutter ved 37 ° C. Efter proteinase K-fordøjelse, blev snittene fikseret i 4% paraformaldehyd, og objektglassene blev derefter hybridiseret med 4 pmol Exiqons miRCURY LNA detekteringsprobe komplementær til MIR-196a i hybridiseringspuffer (50% formamid, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM citronsyre (pH 6), 50 ug /ml heparin, og 500 pg /ml gær-RNA) natten over ved 50 ° C. En forvrænget og en RNU6B sonde (Exiqon) blev også anvendt som negative og positive kontroller, hhv. Derefter, efter inkubering med anti-DIG-AP Fab-fragmenter konjugeret til alkalisk phosphatase fortyndet 1:50 i blokeringsopløsning (Roche, Basel, Schweiz) i 3 timer ved stuetemperatur blev de hybridiserede prober detekteret ved anvendelse nitroblåt tetrazoliumchlorid /5- brom-4-chlor-3-indolylphosphat farve substrat (Roche) til objektglassene. Slides blev modfarvet med nuklear hurtig rød og analyseret ved hjælp af en Nikon ECLIPSE 55i mikroskop.

Cell Kultur og transfektion

Hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) cellelinjer, der er afledt af tungen (HSC- 2, HSC-3, HSC-4), gingiva (SAS), mundhulen (Ca9-22), larynx (JHU-011) og svælg (FaDu), blev alle holdt i RPMI-1640 medium suppleret med 10% varme -inactivated føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i 5% CO

2.

i transfektionsanalyser blev celler transficeret med enten mIR-196a inhibitor eller inhibitor negativ kontrol under anvendelse af Lipofectamine ™ 2000-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Inhibitoren negative kontrol var baseret på C. elegans miRNA og svarer til cel-MIR-239B. Styringen er blevet analyseret af BLAST mod alle menneskelige, mus og rotte genomiske sekvenser og miRNA-sekvenser i miRBase-database. Dette molekyle har identisk design og modifikationer, som miRIDIAN microRNA inhibitorer, der vides at målrette mRNA. Hvert eksperiment blev udført tre gange og uafhængigt mindst 3 gange.

cellelevedygtighed og cytotoksicitetsassay

JHU-011 celler blev udpladet i en 24-brønds plade med en tæthed på 2 x 10

4 celler /brønd og podes i 24 timer. Derefter blev cellerne transficeret som beskrevet ovenfor, og celleproliferation blev bestemt ved direkte celletælling på 0, 3 og 5 dage efter transfektion. Kort beskrevet blev celler trypsiniseret og farvet med 0,4% trypanblåt at måle omfanget af celledød ved hjælp grevinde ™ (Invitrogen). En nuklear kontrastfarvning hjælp Hoechst 33258 blev også udført for at visualisere de levedygtige celler ved 3 dage efter transfektion.

Desuden blev cellelevedygtighed og cytotoksicitet vurderet ved differentiel proteaseaktiviteter vha MultiTox-Fluor Multiplex cytotoksicitetsanalyse (Promega, Fitchburg, WI) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev cellerne podet ved en koncentration på 5 × 10

3 celler /brønd i en 96 brønds plade og transfektion procedurer blev udført 24 timer efter podning. Derefter blev den levende celle proteaseaktivitet og døde celler proteaseaktivitet målt ved 3 dage efter transfektion ved tilsætning af glycyl-phenylalanyl-aminofluorocoumarin (GF-AFC) eller bis-alanyl-alanyl-pnenylalanyl-rhodamin 110 (bis-AAF-R110) som peptidsubstrater henholdsvis. Celler blev inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C, og resulterende fluorescens blev målt (live-cell fluorescens 400

Ex /505

Em; dead-cellefluorescens 485

Ex /520

Em) for at opnå de relative fluorescensenheder (RFU).

Laryngeal Cancer xenograftmodeller

Eksperimenter blev udført på 6 uger gamle BALB /c nøgne mus nu /nu. Dyrene blev passet og anvendes i overensstemmelse med protokoller godkendt af Animal Care og brug Udvalg Keio University School of Medicine (Tokyo, Japan). Ti mus blev tilfældigt inddelt i 2 grupper på 5 mus. Behandlingseffektiviteten på begge tumorer og deres locoregional lymfeknudemetastase blev undersøgt i hver af de følgende 2 grupper: Gruppe 1, MIR-196a-inhibitor; Gruppe 2, inhibitor negativ kontrol (kontrol). Mus blev bedøvet ved intraperitoneal injektion af 5-7 mg tribromethanol. Orthotopisk xenotransplantattumorer blev etableret omkring halsen på niveau med strubehovedet ved subkutan injektion af 5 x 10

6 JHU-011-celler med en 25 gauge nål. Efter en uge blev tumorer målt i tre dimensioner ved hjælp af skydelære, og derefter enten MIR-196a inhibitor eller kontrol kombineret med AteloGene ™ (Koken, Tokyo, Japan) (1 nmol /200 pi) blev injiceret i det subkutane mellemrum omkring tumorerne. Yderligere behandlinger blev udført på 13 og 19 dage efter podning med tumorceller og periodisk måling af tumoren blev udført op til 12 uger efter injektion. Mus blev aflivet og tumormasser blev høstet, derefter skåret i 2 stykker. Halvdelen af ​​hver tumor blev fikseret i 10% neutral bufret formalin natten over, dehydreret med trin-for-trin ethanol og indlejret i paraffin. Resterende halvdel af tumoren blev mættet i RNA

senere

® (Ambion) og opbevaret ved -80 ° C. Bilaterale cervikale lymfeknuder blev høstet, snap-frosne og paraffin indlejret. Hematoxylin-Eosin-farvning blev udført på paraffinindlejrede prøver til histologiske analyser. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af t-test for at sammenligne den terapeutiske virkning af miR-196a-hæmmer mod larynxcancer

i

vitro

i

vivo

. Betydningen niveau blev sat til p. 0,05

Resultater

Microarray Screening af Altered miRNA Expression i larynxcancer

For at identificere miRNA dysreguleret i larynx kræftformer, vi først undersøgt udtryk profiler af 723 menneskelige modne miRNA i 5 larynx væv (3 larynx kræft og 2 tilstødende noncancerous larynx modstykker) ved hjælp af microarrays. Resultaterne viste, at 5 miRNA (MIR-130b-5p (tidligere betegnet MIR-130b *), MIR-196a, MIR-455-3p, MIR-455-5p, og MIR-801) eller 2 miRNA (MIR-133b og mIR-145) signifikant opreguleret eller nedreguleret, henholdsvis i larynx cancere (figur 1A). Interessant ekspressionsniveauer af enten lad-7 familie, MIR-15, MIR-16, eller MIR-17-92 klynge, der er kendt for at være forbundet med forskellige andre kræftformer, ikke var naturligvis forskellige mellem larynxcancer væv og andre noncancerous væv (figur 1B).

datasæt sammenlignes mellem kræft og tilstødende noncancerous modparter, plotte den overflod af en given miRNA i et datasæt mod den tilsvarende værdi i en anden datasæt både på log-skala. 723 humane miRNA blev inkluderet i Agilent microarray. Sammenligning (A) mellem normale kontroller og kræft prøver demonstrerede opregulering af 5 miRNA (MIR-130b-5p, miR-196a, miR-455-3p, miR-455-5p, og miR-801) og down- regulering af 2 miRNA (mIR-133b og miR-145). (B) Expression niveauer af lad-7 familie, miR-15, miR-16, eller miR-17-92 klynge, der er kendt for at være involveret i forskellige andre kræftformer, var ikke signifikant forskellig mellem normale kontroller og kræft (

øvre højre panel

lavere paneler

). Ekspressionsniveauer af 723 menneskelige miRNA er også vist (

øverste venstre panel

).

kvantitativ real-time PCR Validering af miRNA Expression i larynxcancer

Dernæst at bekræfte og validere resultaterne opnået fra vores microarray analyse, udførte vi kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) analyse (TaqMan® miRNA tests, Applied Biosystems) under anvendelse af 5 par primære larynx kræft og deres matchede noncancerous væv. Selvom microarray analyse viste opregulering af 5 miRNA og nedregulering af 2 miRNA, er MIR-801 nu for at være et fragment af U11 spliceosomal RNA og fjernes fra miRBase [31]. MIR-145 blev også udelukket fra yderligere undersøgelser, fordi det er blevet rapporteret at være hyppigt nedreguleret i kræftformer i flere organer, herunder prostatacancer [32], brystcancer [33], blærecancer [34], coloncancer [35 ], [36], ovariecancer [37], esophageal cancer [38], lungecancer [39], [40], nasopharyngeal cancer [41], gastrisk cancer [42], samt B-celle-maligniteter [43] og anses for at være ikke en ordentlig biomarkør for larynx cancer.

mIR-455-5p stedet for mIR-455-3p blev anvendt i yderligere studier, fordi miRNA 3p og 5p genereres fra hver side af den samme precursor dæmme at have lignende sekvenser og nylig rapport foreslog potentielle inddragelse af miR-455-5p i kræft progression [44]. Således blev QRT-PCR-analyse udført på resterende 4 miRNA (dvs. miR-130 B-5p, miR-196a, miR-455-5p, og miR-133b). Ekspressionsniveauer af disse miRNA blev sammenlignet mellem 5 cancervæv og deres tilstødende noncancerous væv. Resultaterne var i overensstemmelse med dem opnået fra microarray analyser, især når matchede prøver blev sammenlignet i de samme patienter (figur 2A og B). Højere ekspressionsniveauer af miR-130b-5p blev observeret i kræft væv sammenlignet med nabolandene kontroller i 4 af 5 par. Endvidere ekspressionsniveauer af MIR-196a og MIR-455-5p var signifikant højere i cancervæv sammenlignet med tilstødende kontroller (MIR-196a, p = 0,0460; MIR-455-5p, p = 0,0286) (Figur 2A), medens ekspressionsniveauet af mIR-133b var signifikant lavere hos tumor prøver sammenlignet med kontroller (p = 0,0274) (figur 2B).

relative udtryk for larynx cancerassocierede miRNA i 5 parrede prøver blev målt ved TaqMan® qRT- PCR-analyse og vist i

venstre paneler

. Ekspressionsniveauer i tilstødende noncancerous modparter (NCS) i hvert par er sat til at være en i

højre paneler

for klar visualisering af væsentlig fold forskel i hver miRNA. Data er udtrykt som middelværdier med standardafvigelser. (A) opregulering af 2 miRNA (miR-196a og miR-455-5p) blev bekræftet i kræft, når 5 kræftformer blev sammenlignet med deres nationale koordinatorer. *,

s

0,05. (B) miR-133b blev nedreguleret i kræft i alle 5 matchede par. blev observeret statistisk signifikante forskelle i ekspressionsniveauerne af miR-196a, miR-455-5p, og miR-133b mellem matchede par. *,

s

. 0,05

Således af disse 4 miRNA, 3 miRNA (dvs. miR-196a, miR-455-5p og miR-133b) viste signifikant forskellige ekspressionsniveauer i cancervæv sammenlignet med deres matchede kontrol væv og yderligere kvantificering af miRNA blev udført under anvendelse 48 larynx prøver. Disse prøver indeholdt 5 noncancerous modstykker, 14 godartede læsioner (polyp, knude, polypoid eller hyperkeratose), 12 dysplasier og 17 larynx kræftformer. Når 48 prøver blev undersøgt, ekspressionsniveauet af MIR-455-5p var signifikant højere i cancere sammenlignet med tilstødende noncancerous modparter og godartede larynx væv (p = 0,0113). Endvidere ekspressionsniveauet af MIR-196a var klart højere i cancervæv sammenlignet med noncancerous andre væv (tilstødende noncancerous modparter og benigne larynx væv, p = 0,0003; dysplasier, p = 0,0040) (figur 3A). Selvom MIR-133b viste signifikant lavere ekspressionsniveauer når cancer prøver blev sammenlignet med matchede noncancerous larynx væv (figur 2B), ekspressionsniveauet af denne miRNA var ikke signifikant lavere i tumor prøver sammenlignet med noncancerous andre væv (noncancerous modparter og godartede larynx væv, p = 0,8353; dysplasier, p = 0,2185) i undersøgelsen ved hjælp af flere prøver (figur 3B)

(A) Ekspressionsniveauer af mIR-455-5p og mIR-196a blev målt ved TaqMan® QRT-PCR. anvendelse af 48 vævsprøver. Tilstødende noncancerous væv (noncancerous modparter, NCS) er vist som åbne firkanter. blev observeret betydelig opregulering af miR-455-5p i kræftformer sammenlignet med nationale koordinatorer og godartede prøver. Ekspressionsniveauer af MIR-196a var signifikant højere i cancervæv sammenlignet med enten NCs og benigne prøver eller præcancerøse dysplasi prøver. Streger indikerer middelværdien for hver gruppe. *,

s

0,05. (B) Expression niveauer af miR-133b blev også undersøgt i flere prøver. Selvom relativt lavere ekspression blev observeret i cancere, var forskellene ikke statistisk signifikante sammenlignet med andre grupper. Streger indikerer middelværdien for hver gruppe. *,

s

. 0,05

Derfor yderligere at undersøge betydningen af ​​miR-196a som en lovende biomarkør for larynx cancer, QRT-PCR-analyse af miR-196a var udført på 84 histologisk verificerede prøver (15 noncancerous modstykker, 24 godartede sygdomme, 18 dysplasier, 27 larynx kræft) og 7 HNSCC cellelinjer. Undersøgelsen viste, at stigende tendens af MIR-196a ekspressionsniveauet blev observeret, når cancer prøver blev sammenlignet med noncancerous modstykker, godartede væv eller dysplasier (figur 4A). Ekspressionen af ​​MIR-196a i cancere var betydeligt højere end deres matchede parrede prøver (p = 0,005) og var også tydeligt i larynx cancer cellelinje JHU-011 celler (data ikke vist). Endvidere fandt vi, ekspressionen af ​​MIR-196a var signifikant højere i fremskreden cancer end tidlig cancer (p = 0,0045, figur 4B,

venstre panel

), og også i begyndelsen kræft end præcancer dysplasi (p = 0,0263; Figur 4B,

Right panel

). Sammen med disse resultater, kunne MIR-196a være en gunstig markør for larynx cancer.

(A) Betydningen af ​​MIR-196a som et lovende biomarkør for larynxcancer blev bekræftet ved TaqMan® QRT-PCR under anvendelse af 84 væv prøver. Assayet omfattede også 7 HNSCC cellelinier. Noncancerous modparter (NCS) er vist som åbne firkanter. Streger indikerer middelværdien for hver gruppe. (B) Ekspression niveau af MIR-196a var højere i avanceret (T3 og T4) cancere sammenlignet med tidlige cancere (T1 og T2) (

venstre panel Salg). Desuden blev der observeret væsentligt højere niveau af miR-196a udtryk i begyndelsen af ​​T1A kræft prøver sammenlignet med forstadier dysplasi prøver (

højre panel

). Streger indikerer middelværdien for hver gruppe. *,

s

. 0,05

Kvalitativ Forskel på miR-196a isomiRs afsløret af Deep Sequencing

Den seneste fremkomsten af ​​dybe sekventering teknologi afslørede, at der er normalt variationer i modne miRNA sekvenser opfundet med begrebet “isomiR” [45]. Sådanne variationer er primært forårsaget af et skift i spaltningssteder når modne miRNA behandles af drosha og Dicer, men også indført ved terminal nukleotid tilføjelser eller intern RNA redigering. Selvom fysiologiske betydninger for mangfoldighed isomiR forblive undvigende, akkumulerende beviser tyder på, at der eksisterer udviklingsmæssige /vævsspecifik præference i spektret af isomiRs.

Således at undersøge mulighederne for heterogenitet i udtrykket profiler af miR-196a isomiRs mellem larynxcancer og andet væv, var dyb sekventering analyse af små RNA udført ved anvendelse Applied Biosystems solidt system (Kamimoto T et al., manuskript indsendt).