PLoS ONE: Tab af Stromal caveolin-1 Expression: A Novel Tumor mikromiljø Biomarkør, der kan forudsige Dårlig kliniske resultater for kræft i bugspytkirtlen

abstrakt

Mål

Kræft udvikling og progression er ikke kun forbundet med tumorcelleproliferation men også afhænger af samspillet mellem tumorceller og det stromale mikromiljø. En ny forståelse af den rolle, tumormikromiljøet tyder på, at tabet af stromal caveolin-1 (Cav-1) som en vigtig regulator kan blive en potentiel terapi mål. Denne undersøgelse har til formål at belyse, om stromale Cav-1-ekspression i bugspytkirtelkræft kan være en stærk prognose biomarkør.

Metoder

Vævsprøver fra 45 bugspytkirtlen kræftpatienter blev undersøgt. Parenchym og stroma blev separeret og oprenset ved hjælp af laser capture microdissection. Stromal Cav-1-ekspression blev målt fra pancreascancer, paraneoplastisk, og normalt væv ved hjælp af immunhistokemi. Vi analyserede sammenhængen af ​​stromale Cav-1-ekspression med clinicopathologic funktioner og prognostiske indikatorer, såsom tumor markør HER-2 /neu-genet.

Resultater

Prøver fra seks patienter (13,3%) viste høje niveauer af stromale Cav-1-farvning, de fra otte patienter (17,8%) viste en lavere, mellemliggende niveau af farvning, mens dem fra 31 patienter (68,9%) viste et fravær af farvning. KAV-1-ekspression i cancerassocierede fibroblaster var lavere end den, paracancer-associerede og i normale fibroblaster. Stromal Cav-1 tab var forbundet med TNM stadie (

P =

0,018), lymfeknude metastaser (

P

= 0,014), fjernmetastaser (

P

= 0,027) og HER-2 /neu forstærkning (

P

= 0,007). Relationerne af alder, køn, histologisk klasse, og tumorstørrelse med stromale Cav-1-ekspression var ikke signifikant (

P

0,05). En negativ korrelation blev fundet mellem cirkulerende tumorceller og stromale Cav-1-ekspression (

P

0,05).

Konklusion

Tabet af stromale Cav-1 i bugspytkirtlen cancer var en uafhængig prognostisk indikator, hvilket antyder, at stromale Cav-1 kan være et effektivt terapeutisk mål for patienter med kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Shan T, Lu H, Ji H, Li Y, Guo J, Chen X, et al. (2014) Tab af Stromal caveolin-1 Expression: A Novel Tumor mikromiljø Biomarkør, der kan forudsige Dårlig kliniske resultater for kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 9 (6): e97239. doi: 10,1371 /journal.pone.0097239

Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Frankrig

Modtaget: 25 oktober, 2013; Accepteret: 16. april, 2014 Udgivet: 20 Jun 2014

Copyright: © 2014 Shan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Scientific Grand Shaanxi (2012SXKG-21). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

bugspytkirtlen har en overlevelsesrate på mindre end 25% til fem år efter delvis pancreaticoduodenectomy og er en af ​​de mest aggressive og vanskelige humane maligne tumorer [1]. Nylige undersøgelser har vist, at mikromiljøet tjener en funktion i progressionen af ​​ondartede epitheltumorer, hvilket understreger betydningen af ​​forståelsen af ​​stromaceller i forebyggelsen af ​​kræft celle aggression og anti-cancer behandlingsstrategier [2]. fuldt ud at forstå den mekanisme kørsel tumor tilbagefald, metastaser, og det kliniske resultat hos kræftpatienter, skal rolle tumor mikromiljø undersøges. Navnlig cancerassocierede fibroblaster (CAF) har vist sig at tjene en afgørende funktion gennem parakrine interaktioner med tilstødende epitelcancerceller [3], [4].

Caveolins (Cav) omfatter en familie af stilladser proteiner at belægge 50 nm til 100 nm plasmamembran invaginationer [5]. CAV familie består af tre isoformer: KAV-1, KAV-2, og KAV-3. CAV-1 genet er lokaliseret i kromosom 7 (locus 7q31.1) og omfatter tre exoner (30, 165, og 342 bp) og to introner (1,5 og 32 kb). KAV-1 er en strukturel komponent i caveolae involveret i diverse cellulære funktioner, såsom vesikulær transport, cholesterol homeostase, og signaltransduktion [6]. På trods af en voksende mængde af beviser på Cav-1 implikation i tumorigenese, hvorvidt Cav-1 fungerer som en tumor suppressor eller som en onkogen fortsat uklart. Disse modstridende resultater er sandsynligvis afledt fra studiet af maligne epiteltumorer [7], [8], [9]. Et nyt paradigme for “den autophagic tumor stroma model af kræft stofskifte” blev for nylig indført for at lette forståelsen af ​​funktionen af ​​tumor mikromiljøer [10], [11]. I denne model tabet af stromale Cav-1 som en central regulator er en potentiel terapi mål, hvilket antyder den prognostiske betydning stromal Cav-1 [12]. Tab af stromale Cav-1 er den eneste uafhængige prædiktor for tidlig brystkræft tilbagefald og progression [7]. Ayala et al. rapporterede, at tabet af stromale Cav-1 bidrog til metastatisk adfærd prostata kræftceller via en mekanisme, der involverer opregulering af TGF-β1 og SNCG gennem Akt aktivering [13]. Zhao et al. rapporterede, at Cav-1-ekspression niveau i CAF forudsagde mavekræft resultater [14]. Karen et al. anført, at tabet af stromale Cav-1-ekspression i maligne melanom metastaser forudsagt ringe overlevelse [15]. Imidlertid stromale Cav-1-ekspression i pancreas cancer, såvel som dens kliniske betydning, forbliver uklar. For at belyse funktionen af ​​stromale Cav-1 i bugspytkirtelkræft, undersøgte vi det stromale Cav-1-ekspression i pancreas cancer prøver, sammen med korrelationen af ​​stromale Cav-1-ekspression med tumormarkør HER-2 /neu og et antal cirkulerende tumor celler (CTCs).

Materialer og metoder

patientprøver

fra januar 2007 til december 2012, bugspytkirtelkræft væv (herunder tilstrækkeligt mellemstore tumor vævsprøver og vævsprøver opnået fra områder inden 2,0 cm af tumoren) blev opnået fra 45 patienter, der gennemgår delvis pancreaticoduodenectomy (Whipple resektion) for kræft i bugspytkirtlen ved Institut for Lever og pancreas kirurgi, Første og Anden Affiliated Sygehuse i Xi’an Jiaotong Universitet. En portion af hver prøve blev frosset og forberedt til laser capture microdissection (LCM); andre specimen portioner blev fikseret med 10% formalin til histologisk undersøgelser. Ti prøver indeholdende normale pancreas væv fra patienter, der fik delvis pankreatektomi for godartede tumorer blev anvendt som normale kontroller. Af undersøgelsens patienter de 45, 24 var mænd og 21 kvinder. Den mediane alder på tidspunktet for kirurgi var 64,5 år (interval fra 44 år til 82 år). Alle 45 patienter havde pancreas duktalt adenokarcinom. Tumor scenen og histopatologisk grading blev registreret i henhold til klassificeringen af ​​Den Internationale Union Against Cancer. Tre patienter havde trin I tumorer, 11 havde stadie II, 27 havde fase III, og 4 patienter havde stadie IV tumorer. Histologiske tumor kvaliteter var som følger: 7 patienter havde klasse I, 20 havde grad II, og 18 havde grad III tumorer. Alle patienter deltog i opfølgningen procedure. Den gennemsnitlige tid for opfølgning var 22 måneder (interval fra 4 måneder til 52 måneder). Disse prøver blev indsamlet fra donorer eller pårørende, der underskrev en skriftligt informeret samtykke. Undersøgelserne blev godkendt af bestyrelsen og etiske komité af Xian Jiaotong Universitet Institutional Review, Kina.

Immunhistokemi

Cav-1 protein blev påvist ved immunhistokemi hjælp af den standardiserede streptavidin-peroxidase metode. Vævssnit (4 um) blev inkuberet natten over med en standard primært antistof-koncentration. Objektglassene blev inkuberet i 30 minutter med biotinyleret gede-anti-kanin IgG efterfulgt af inkubering med peroxidase-konjugeret streptavidin i 20 minutter ved stuetemperatur. Farve blev udviklet ved anvendelse af 0,02% opløsning af 3, 3′-diaminobenzidin i 50 mM Tris-HCI-buffer (pH 7,6) i 5 minutter til 7 min. Endelig blev snittene modfarvet med hematoxylin, skyllet med vand, dehydreret, klaret, og låget gled. I negative kontroller for immunfarvning, blev det primære antistof erstattes med ikke-immunt ged eller kaninserum. Antallet af farvede celler pr 1000 blev bestemt under et mikroskop (Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, Japan) i tre visuelle områder, ved en forstørrelse på × 400. Når det samlede antal celler observeret under mikroskopet var mindre end 1000, blev alle celler talt. Farvning blev scoret semikvantitativt som negativ (0, ingen farvning), svagt (1; enten diffus svag farvning eller stærk farvning i mindre end 30% af stromaceller) eller stærk (2; defineret som stærk farvning på 30% eller mere af stromale celler). Antistoffer mod Cav-1, vimentin, og β-actin blev købt fra Abcam (Cambridge, MA, USA eller Santa Cruz, Californien, USA).

LCM

Frosne snit (5 um tyk ) af kræft i bugspytkirtlen, paraneoplastisk, og normale væv blev mikrodissekeres hjælp af en PixCell II LCM-system (Arcturus Engineering, Mountain View, Californien, USA). Laseren capture-system var udstyret med PixCell II billedarkivering software. Indstillingerne for laseren var som følger: spot diameter på 15 um, pulsvarighed på 50 ms, og strøm sat til 50 mW. Væv blev mikrodissekeres til 10 dele af hver prøve med en separat “cap” anvendes til at indfange materiale fra hver sektion. Typisk blev 2500 og 3000 laserimpulser anvendes til hver hætte. Efter mikrodissektion blev plastfolien indeholder de Mikrodissekterede celler fjernet fra resten af ​​hætten, og alle de film indeholdende materiale fra en enkelt prøve blev anbragt i et mikrocentrifugerør og nedfrosset i flydende nitrogen eller opbevaret ved -80 ° C i mRNA-ekstraktion . Frosne snit blev skåret på en kryostat. Snit blev optøet og monteret på ikke-coatede objektglas. De frosne snit blev fikseret i 70% ethanol i 30 sekunder og farvet med H og (2) fravær af dækglasset i at analysere mikrodissekeret vævssnit. Fraværet af et dækglas og indekset matchning mellem monteringselementerne medier og vævet forårsage tørre vævssnit at have en refraktile kvalitet, der tilslører cellulære detaljer ved store forstørrelser. For at forbedre visualisering, er en dråbe xylen tilsættes til vævet til at levere befugtning og lette brydningsindeksforskel matchning.

RT-PCR og Real-time PCR

Total RNA blev ekstraheret fra bugspytkirtlen tumor, paraneoplastisk, og normale vævsprøver ved hjælp TRIzol-reagens (Gibco BRL, Life Technology, Grand Island, New York, USA).

første streng cDNA blev syntetiseret fra 2 ug totalt RNA under anvendelse af RevertAid Kit ( Fermentas MBI, Waltham, Massachusetts, USA). PCR primersæt blev designet som følger: 1) for KAV-1 (140 bp), videresende CTGGGCTGTTCTCGCTTCG-3 ‘og revers 5′-CTCTCCTCTTCCTTCTCTTCTTCC-3′; og 2) for β-actin (179 bp), fremadrettet 5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 ‘og revers 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’. PCR-betingelser omfattede et indledende denatureringstrin i 5 minutter ved 94 ° C efterfulgt af 22 cykler af amplifikation: 30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C, og 30 sekunder ved 72 ° C. Efter den sidste cyklus blev en endelig ekstension udført ved 72 ° C i 10 min. Husholdning genet, β-actin blev anvendt som en intern kontrol.

Real-time kvantitativ PCR blev udført med Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen, USA) under anvendelse af Rotor-Gene RG-3000 (Corbett Forskning, Doncaster Victoria, Australien). For hver amplikon blev mængden af ​​KAV-1 og β-actin bestemt ud fra en standardkurve genereret ved seriel fortynding. Forud for amplifikation blev prøverne inkuberet ved 95 ° C i 10 min, og hver amplifikationscyklus bestod af denaturering i 45 sekunder ved 95 ° C, annealing i 30 sek ved 57 ° C og ekstension i 30 sek ved 73 ° C. Mængden af ​​målgener i cDNA prøverne blev beregnet på basis tærskelcyklus (Ct). PCR signaler blev kvantificeret ved densitometrisk analyse under anvendelse Mængde One analysesoftware.

Isolering og dyrkning af primære humane fibroblaster Salg

CAF og normale fibroblaster (NFS) blev isoleret fra pancreascancer og ikke-kræft partiel pankreatektomi prøver henholdsvis. Prøver blev opsamlet og overført til laboratoriet. Efter flere vask med steril phosphatpufret saltvand (PBS), 1 cm

2 sektioner af væv blev anbragt i brøndene på dyrkningskolber. Når vævet syntes at vedhæfte til kolberne (5 timer til 6 timer), blev Dulbeccos modificerede Eagle medium indeholdende 10% føtalt bovint serum tilsat. Prøver blev inspiceret dagligt for fremkomsten af ​​fibroblaster, og mediet blev skiftet efter 24 timer og hver tredje dag, derefter. Vævsprøver blev fjernet fra kulturerne når fibroblaster nåede 70% konfluens (ca. to uger), og fibroblaster blev overført til store vævskulturplader fartøjer. Alle fibroblaster blev anvendt til denne undersøgelse var fra passager 3 til 5. Fibroblaster blev verificeret ved vimentin positiv immunhistokemi farvning.

immunofluorescensassay

Eksponentielt voksende celler blev podet på 25 mm kvadratiske dækglas placeret i 35 mm kultur diameter retter. Efter behandling blev cellerne fikseret med 4% formaldehyd i 5 minutter, permeabiliseret med 0,2% opløsning af Triton X-100 i PBS, og blokeret med 2% bovint serumalbumin (BSA) -PBS i 30 min. Objektglas blev inkuberet med anti-Cav-1 natten over. Fluorescerende billeddannelse blev opnået med et konfokalt laserscanningsmikroskop (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.).

Fluorescens in situ hybridisering

HER-2 /neu-genet blev amplificeret med tofarvet (fluorescens i situ hybridisering) FISH under anvendelse af en Passvision HER-2 DNA-probe kit (Vysis Inc. Downers Grove, Illinois, USA) ifølge producentens instruktioner. Derefter blev 4 um tykke vævssnit bages natten over ved 56 ° C og blev udsat for afparaffinering, enzymfordøjelse og fiksering. Objektglassene blev derefter denatureret i 70% formamid /to-tiden standard saltvand-citrat ved 72 ° C i 5 min. Efter puffer vask blev 10 pi af en blanding af to direkte mærkede prober (HER-2 /neu specifikke sekvens Probe) tilsat til vævssnittene, og hybridisering blev udført ved 37 ° C i 14 timer til 18 timer. Objektglassene blev derefter vasket i en post-hybridisering vask ved 72 ° C, modfarvet med 4, 6-diamidino -2-phenylindol (DAPI), monteret, og opbevaret i mørke før signalet tælling. HER-2 /neu-spektrum appelsin probe indeholder en DNA-sekvens specifik for HER-2 /neu gen locus og hybridiseret til regionen 17q11.2-q12 af humane kromosomer. Kromosom tælling sonde 17 (CEP17) /spektrum grøn probe, der indeholder alfa-satellit-DNA, som hybridiserer til D17Z1-locus (centromer region af kromosom 17) blev anvendt som kontrol. Objektglassene blev observeret under fluorescensmikroskop udstyret med et digitalt kamera (DP50; Olympus, Tokyo, Japan). For hver prøve blev genamplifikation scoret, da mindst 20 kræft cellekerner udviste en HER-2 /CEP17 forholdet ≥2 eller når en HER-2-signalet klynge blev observeret.

Blood Sampling og Berigelse af CTCs

Samtykke former blev godkendt af den etiske Review Committee for personmotiver Komité Xian Jiaotong University, Kina og underskrevet af alle forsøgspersonerne. Først blev 7,5 ml prøver af perifert blod opsamlet i BD Vacutainer-rør (Becton, Dickinson and Company, Franklin, New Jersey, USA) og vasket med PBS. For at undgå epithelial kontaminering celle under venepunktur blev alle prøver opsamlet efter kassering af de første 2 ml blod. Røde blodlegemer (RBC) blev blandet med 45 ml lysisbuffer (155 mM NH

4CL, 10 mM KHCO

3, 0,1 mM EDTA), efterfulgt af rotation i 8 min og centrifugering (600 g i 5 min ) for at fjerne røde blodlegemer. Den resulterende cellepellet blev resuspenderet i PBS og efterfølgende inkuberet med 0,5 ml antileukocyte overflademarkør CD45 monoklonale antistof-coatede magnetiske perler i 30 minutter, efterfulgt af separation af magnetiske perler ved anvendelse af en magnetisk stativ (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Supernatanter blev overført til et nyt rør, og efterfølgende centrifugeret ved 800 g i 3 min. Cellepellets blev spottet på glasplader, efterfulgt med (immunofluorescens in situ hybridisering) imFISH farvning.

imFISH Farvning (CEP8-CD45-DAPI)

Negativ berigelse af tumorceller blev udført ved anvendelse immunmagnetisk perler, efterfulgt af identifikation med cytologi analyse. FISH blev udført under anvendelse centromer DNA-prober af kromosom 8 (gul) (Vysis Inc. Downers Grove, Illinois, USA), og immunofluorescens assay blev udført ved anvendelse af anti-CD45 (rød) (Santa Cruz, Californien, USA). Objektglassene blev vasket tre gange med tris-bufret saltvand (TBS) (10 mM Tris, 2,8 mM KCI, 137 mM NaCl, pH 7,4) indeholdende 0,2% BSA i 3 min og derefter skyllet med TBS gang. Celler blev monteret med montering medium, der indeholder den nukleare farvestof DAPI. En blindet gennemgang af de fluorescerende billeder ved tre teknikere bekræftet identiteten af ​​CTCs fra tre farver fluorescerende billeder, der blev forstørret 400 gange. Vurderingskriterier for CTC identifikation fra fluorescerende billeder omfattede både CEP8≥3 og CD45 (-) farvning mønster overliggende DAPI farvning af kernen

Statistisk analyse og Patient Outcome

Data blev analyseret ved hjælp af. chi-square test (χ2) eller tosidet Fisher exact test, alt efter omstændighederne. Pearson korrelationskoefficient blev anvendt til at måle styrken af ​​foreningen blandt Cav-1, tælling af CTCs, og HER-2 /neu ekspressionsniveauer. Overlevelse blev beregnet ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden, og forskelle blev undersøgt af log-rank test. Faktorer fundet at være betydelige blev derefter udvalgt til en trinvis Cox ‘multivariat proportional hazard model til at bestemme deres prognostiske værdi.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS Version 13.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA).

Resultater

Angivelse af Stromal Cav-1 i kræft i bugspytkirtlen

Cav-1 udtrykkes både på membranen og i cellers cytoplasma [16]. For at undersøge ekspressionen status stromal Cav-1 i bugspytkirtelkræft, brugte vi immunhistokemi til at evaluere pancreascancer, paraneoplastisk, og normale vævssnit. Vores resultater viste repræsentative billeder af KAV-1-antistof farvede vævssnit (fig. 1), hvilket understreger de observerede i KAV-1-immunfarvning i fibroblastiske stromale rum forskelle. Interessant, Cav-1-ekspression var stærk og begrænset primært til stroma i paraneoplastic og normale væv, men blev først opdaget lejlighedsvis i tumor stroma. I 45 cancer prøver, viste 6 (13,3%) patienter høje niveauer af stromale Cav-1-farvning, mens 8 (17,8%) viste en lavere mellemliggende niveau af farvning, og 31 (68,9%) viste et fravær af stromal Cav-1-farvning .

Paraffinsnit blev immunfarvet som beskrevet i metodeafsnittet. (N) normalt væv stærkt positiv for KAV-1-ekspression; (P) Paracancer væv moderat for Cav-1-ekspression; (C) Tumor væv med negativ Cav-1-ekspression (× 400).

PCR Analyser i Laser Captured Prøver

Tab af stromale Cav-1 er en enkelt uafhængig prædiktor for tidlig brystkræft tilbagefald og progression [17]. Vores immunhistokemisk data viste også lavere stromale Cav-1-ekspression i kræft i bugspytkirtlen. For at verificere den immunhistokemiske data videre, vi adskilt og renset stroma hjælp LCM. Stroma celler fra pancreas prøver blev mikrodissekeres held fra tumoren, paraneoplastisk, og normale sektioner. LCM teknik forårsagede ingen synlig ændring i morfologien af ​​dissekerede prøver (Fig. 2A). Vi analyserede sekventielt mRNA ekspression af KAV-1 i laser-indfanget stroma prøver ved hjælp af RT-PCR og Real-time PCR (qPCR). MRNA niveau af Cav-1 var signifikant forringet i laser-erobrede tumor stroma prøver sammenlignet med den paraneoplastisk og normale væv (fig 2B, 2C.) (

P

0,05).

A: Skematisk diagram, der viser LCM teknik. B: mRNA-ekspression af stromale Cav-1 i laser-indfanget prøver som bestemt ved RT-PCR. C: Kvantificering af mRNA ved real-time kvantitativ PCR. Data fra mindst tre uafhængige forsøg med dobbelte bestemmelser er udtrykt som middelværdi ± SEM. (N) normalt væv; (P) Paracancer væv; (C) Tumor væv. *

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Angivelse af Cav-1 i CAF, PAFs, og NFS

For at forstå yderligere stromale Cav-. 1 proteinekspression i bugspytkirtlen stroma (det meste fibrocytter), vi først udvindes CAF fra bugspytkirtelkræftceller, paracancer-associerede fibroblaster (PAFs), paracancerous væv, og NFS fra ikke-kræft partielle pankreatektomi prøver. Forskellige vimentin ekspressionsniveauerne i stroma CAF, PAFs, og NFS blev vurderet ved immunhistokemi analyse. Disse resultater også bekræftet, at vores celle udvinding var vellykket (fig. 3A, 3B). Efterfølgende har vi bestemt og analyseret stromale Cav-1-ekspression i CAF og NFS farvet med fluoresceinisothiocyanat mærkning-IgG-antistof ved konfokal mikroskopi. KAV-1 fluorescenssignal i CAF var lavere end den, PAF og NF prøver (figur 3C.), Hvilket antyder, at CAV-1 er tabt i en pancreascancer mikromiljø

A:. Cell morfologisk karakteristiske for CAF, PAFs, og NFS (× 100). Ekstraherede CAF fra bugspytkirtelkræft og PAFs og NFS fra paracancerous væv og ikke-kræft partielle pankreatektomi prøver. B: Forskellige vimentin ekspressionsniveauerne i stroma CAF, PAFs, og NFS blev vurderet ved immunhistokemi (× 200). C: Cav-1-protein-ekspression i CAF og NFS farvet med FITC mærkning-IgG-antistof og analyseret ved konfokal mikroskopi. KAV-1 fluorescenssignal i CAF er lavere end i PAFs og NFS (× 200). (CAF) Cancer forbundet fibroblaster; (PAFs) Paracancerous forbundet fibroblaster; (NFS) Normal forbundet fibroblaster.

Forholdet mellem Stromal Cav-1 Expression og klinisk-patologisk Parametre

Tabel 1 opsummerer sammenslutninger af stromale Cav-1 protein-ekspression og klinisk-patologiske parametre i bugspytkirtelkræft . Den stromale Cav-1 tab blev set i seks af 14 trin I og II-sager (42,9%) og var signifikant lavere end i fase III (77,8%, 21 ud af 27 tilfælde) og trin IV sager (100,0%, 4 af 4 tilfælde ) (

P =

0,018). Stromal Cav-1 tab var også forbundet med lymfeknude metastaser (

P

= 0,014) og fjernmetastaser (

P

= 0,027). Vi undersøgte også forholdet mellem alder, køn, histologisk klasse, og tumorstørrelse med stromale Cav-1-ekspression. Men statistisk signifikante relationer blev ikke observeret (

P

0,05).

Tab af Stromale Cav-1 korrelerer med HER-2 /neu qenamplifikation

HER-2 /neu er et transmembrant vækstfaktor receptor, overekspression af der er anerkendt som en selvstændig negativ prognostisk faktor i flere kræftformer, herunder kræft i bugspytkirtlen [18], [19], [20], [21], [22 ], [23], [24], [25]. At udforske nærmere, om stromale Cav-1 tab er en negativ prognostisk biomarkør i bugspytkirtelkræft, blev sammenhængen mellem stromale Cav-1-ekspression og HER-2 /neu genamplifikation analyseret. HER-2 /neu gen amplifikation blev vurderet ved anvendelse FISH, hvilket betragtes som den gyldne standard for måling af procentdelen af ​​positive celler. Vores resultater viste, at 64,4% af pancreas-adenocarcinomer udviste HER-2 /neu gen amplifikation (fig. 4). Stromal Cav-1 tab haft en positiv korrelation med HER-2 /neu genamplifikation (r = -0,697,

P

= 0,000; tabel 2). Firedobbelte stromale Cav-1 tab blev observeret i prøver, der udviser HER-2 /neu-genamplifikation. Derimod i peritumorale og normale prøver, stromale Cav-1-ekspression var høj, når HER-2 /neu-genet ikke blev amplificeret. Afslutningsvis blev stromale Cav-1 tab positivt korreleret med forstærkning af HER-2 /neu gen

(N) Normal væv negativ for HER-2 /neu genamplifikation.; (P) Paracancer væv moderat til HER-2 /neu genamplifikation; (C) Tumor væv positive for HER-2 /neu genamplifikation (× 1000).

Tab af Stromale Cav-1 korrelerer med CTC Enumeration

CTCs er tumor celler kaste fra den primære tumor i det cirkulerende blod. Tilstedeværelsen af ​​CTCs i det perifere blod hos patienter er blevet forbundet med metastase og ringe overlevelse, selv om den biologiske betydning af CTCs tilskrives tumor genomisk ustabilitet og potentiel metastatisk ineffektivitet er blevet drøftet [26]. Baseret på dens kliniske relevans er CTC anbefales af American Society of Clinical Oncology at være en acceptabel kræft markør [27]. At udforske nærmere, om stromale Cav-1 tab er en negativ prognostisk biomarkør, blev sammenhængen mellem stromale Cav-1-ekspression og CTC tælling analyseret. Vores resultater viste, at CTCs blev påvist i 35.71% (5/14) af pancreas cancerpatienter med stromale Cav-1 ekspression versus 77,42% (24/31) af patienterne med stromale Cav-1 tab (fig. 5). Desuden blev signifikant højere CTC opregning observeret hos patienter med stromale Cav-1 tab end hos patienter med stromale Cav-1 ekspression (18,5 ± 2,0 i 7,5 ml blod vs 6,0 ± 1,5 i 7,5 ml blod). Afslutningsvis blev stromale Cav-1 tab positivt korreleret med CTC tælling

A:. CTCs negative patienter med stromale Cav-1 tab. B: CTCs positive patienter med stromale Cav-1 tab. C: CTCs negative patienter med stromale Cav-1-ekspression. D: CTCs positive patienter med stromale Cav-1-ekspression. Målestokken hvid angiver 10 um (x400).

Prognostiske Værdier for tab af Stromal Cav-1 i patienter med kræft i bugspytkirtlen

For at bestemme den prognostiske værdi af stromale Cav-1 for kræft i bugspytkirtlen, analyserede vi den kumulative overlevelse af patienter efter deres Cav-1-status (fig. 6). Stromal Cav-1 mangel, som indikeret af den manglende farvning, blev betragtet som negativ, hvorimod svag eller stærk farvning blev betragtet som positive. Den kumulative overlevelse i stromale Cav-1 negative patienter (n = 31) på tre år var 8,8% (median overlevelsestid på 16 måneder). Derimod den kumulative overlevelse i stromale Cav-1-positive patienter (n = 14) var 20,2% (median overlevelsestid på 28 måneder), en forskel, der var statistisk signifikant (

P

0,05).

Baseret på multivariat analyse, resuméet eller af lymfeknude metastaser på kumulative overlevelse gange på tre år var 1,32 (95% CI, 1,10-1,63), og TNM (III + IV /II + i ) fase (OR = 1,27, 95% CI, 1,15-1,46) var en uafhængig prognostisk faktor for den samlede overlevelsestid i studie patienter med kræft i bugspytkirtlen. Tabet af stromale Cav-1 protein var også en uafhængig prognostisk faktor for den samlede overlevelsestid (

P =

0,006). Men tumor diameter og andre kliniske parametre var afhængige prognostiske faktorer.

Diskussion

Solide tumorer ikke længere betragtes blot som klonede udvidelser af kræftceller. Ud over erhvervede celle iboende egenskaber, er tumor initiering og vækst understøttet af en overflod af parenkymale, inflammatorisk, og stromale celletyper, som infiltrerer og omgiver tumoren [28]. Vores resultater understreger betydningen af ​​en udviklende mikromiljø og foreslå, at behandlingen skal rettes mod både neoplastiske celler og støttende stromale celler [29]. Den autophagic tumor stroma model af kræft metabolisme [30] tyder på, at tabet af stromale Cav-1 som en central regulator er en potentiel terapi mål, hvilket yderligere antyder, at stromale Cav-1-ekspression i stromaceller kan være af prognostisk betydning. Desuden har et tab af stromal Cav-1 blevet rapporteret at være en prædiktor for tidlig tumortilbagevenden, lymfeknudemetastase, tamoxifen modstand og dårlig klinisk resultat af patienter human brystcancer [17]. Vi undersøgte stromale Cav-1-ekspression i bugspytkirtelkræft at evaluere en potentiel rolle for stromale Cav-1 som en prognostisk markør. Stromal Cav-1 blev nedreguleret i bugspytkirtelkræft sammenlignet med paraneoplastisk og normalt væv. Tab af stromal Cav-1 er nært korreleret med avanceret TNM stadium, lymfeknudemetastase, fjernmetastaser, og dårlig prognose. Tabet af stromale Cav-1 blev korreleret med amplifikationen af ​​klassiske markører for tumorudvikling (HER-2 /neu genet). Mere vigtigt var tabet af stromale Cav-1 associeret med metastase fordi cirkulerende tumorceller blev fundet i patient blod. Disse resultater udvider vores forståelse af funktionen af ​​stromale Cav-1 som en diagnostisk markør. Vigtigst er det, så vidt vi ved, denne undersøgelse er den første til at vise, at tabet af stromal Cav-1 i bugspytkirtelkræft er en negativ prognostisk indikator. Men arbejdet i Witkiewicz et al. [31] viste, at co-ekspression af FASN og KAV-1 kan være en informativ klinisk markør. Witkiewicz et al. fundet, at Cav-1 og FASN havde højere udtryk i PDA’er end i Panin. Foruden farvning neoplastiske epitelceller, Cav-1 var også til stede i fibroblaster af desmoplastiske cancer stroma. Stromale celler i normal pancreas eller kronisk pancreatitis væv støder op til tumorceller var negative, hvilket er i modsætning til vores resultater. Denne forskel kan tilskrives muligheden for, at den undersøgelse, som Witkiewicz et al. opstået under immunlokalisering af de to molekyler (FASN og Cav-1), og resultaterne kan tilskrives indbyrdes interferens. Desuden er den anvendte Cav-1 Ab havde en anden specificitet. Den metode, som Witkiewicz et al. (Immunhistokemi) er forskellig fra den, der anvendes i denne undersøgelse, hvori PCR blev anvendt med hensyn til kvantificering. Endelig kan prøve heterogenitet har også påvirket resultaterne. Selvom resultaterne af Witkiewicz et al. [17] er i overensstemmelse med de af vores undersøgelse, yderligere undersøgelse skal udføres på dette emne.

CTCs er tumorceller kaste fra den primære tumor i blodcirkulationen. Tilstedeværelsen af ​​CTCs i det perifere blod hos patienter har længe været forbundet med metastase og ringe overlevelse [32] og er nu betragtes som en acceptabel cancermarkør [27]. De nuværende teknikker er begrænsede. Den eneste kommercielt tilgængelige CTC test (Cell Søg, Veridex LLC, North Raritan, New Jersey, USA) har en opdagelse sats på 50% hos patienter sene [33].