PLoS ONE: Identifikation af Pro-inflammatoriske cytokiner associeret med Muscle Invasive blærekræft; Rollerne for IL-5, IL-20 og IL-28A

Abstrakt

Vi brugte genekspression profilering for at identificere inflammatoriske cytokiner, der korrelerer med udvikling blærekræft. Genekspressionsprofiler af vævsprøverne blev undersøgt ved anvendelse af cDNA-mikroarrays, der indeholdt 103 ikke-muskel invasive blære kræft (NMIBC), 62 muscle invasive blære kræft (MIBC), 58 prøver af histologisk normalt udseende omgivende væv og 10 normale, raske forsøgspersoner der tjente som kontrol kohorte til sammenligning. Vi opdelt de data-sæt i henhold til biologiske karakteriseringer og fokuseret på immunrespons-gener med mindst 2 gange differentiel ekspression i MIBC vs. kontroller. Den eksperimentelle data-sæt identificeret 36 immun-relaterede gener, der er blevet omformet betydeligt i MIBC prøver. Derudover 10 gener var opreguleret og 26 gener blev nedreguleret i MIBC prøver sammenlignet med de normale væv. Blandt de 10 opreguleres molekyler undersøgt, evnen til både sårhelende migration og invasion var forøget som respons på IL-5, IL-20 og IL-28A i blæren cancercellelinier (253J og EJ celler), sammenlignet med ubehandlede celler. Ekspressionsniveauerne af IL-5, IL-20 og IL-28A blev øget hos patienter med MIBC. Alle 3 cytokiner og deres receptorer blev produceret i blæren cancercellelinier, som bestemt ved real-time PCR, immunoblotanalyse og konfokal immunofluorescens. Opregulering af MMP-2 og MMP-9 blev fundet efter IL-5, IL-20 og IL-28A stimulering i begge celletyper. Desuden viste en EMSA-assay, at behandling med IL-5, IL-20 og IL-28A-induceret aktivering af transkriptionsfaktorer NF-KB og AP-1, der regulerer MMP-9-promotor. Endelig aktivering af MAPK og Jak-Stat signalering blev observeret efter tilsætning af IL-5, IL-20 og IL-28A til blære cancerceller. Denne undersøgelse tyder på tilstedeværelsen af ​​specifikke inflammatoriske cytokin (IL-5, IL-20 og IL-28A) -medieret forening i udvikling blærekræft. Alle 3 cytokiner kan være vigtige nye molekylære mål for modulation af migration og invasion i blærekræft

Henvisning:. Lee S-J, Lee E-J, Kim S-K, Jeong P, Cho Y-H, Yun SJ, et al. (2012) Identifikation af Pro-inflammatoriske cytokiner associeret med Muscle Invasive blærekræft; Rollerne for IL-5, IL-20 og IL-28A. PLoS ONE 7 (9): e40267. doi: 10,1371 /journal.pone.0040267

Redaktør: Nikolaos Frangogiannis, Albert Einstein College of Medicine, USA

Modtaget: Januar 26, 2012; Accepteret: 4 Jun 2012; Udgivet: 4. september, 2012 |

Copyright: © 2012 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Research Program Basic Science gennem National Research Foundation Korea (NRF), finansieret af Undervisningsministeriet, Science and Technology (2010 til 0.001.736) og Korea Healthcare Technology R D Project, Sundhedsministeriet Velfærd, Republikken Korea (A100651-1011-0000200). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er en af ​​de mest udbredte maligniteter i økonomisk udviklede lande, og næsten alle maligne blære kræftformer er overgangsordning celle karcinom (TCC), som følger af den overgangsordning epitel [1], [2]. To typer af TCC er histopatologisk klassificeret: non-muskel invasiv blærekræft (NMIBC) og muskel invasiv blærekræft (MIBC) [3], [4]. Ved første præsentation, er 70-80% af patienter med diagnosen NMIBC som er begrænset til slimhinden. Resten af ​​tilfældene viser MIBC med invasion af de muskulære lag af blæren. Patienterne med NMIBC held kan behandles, mens flest dødsfald forekommer hos patienter med hændelse MIBC [4]. Derfor har været fokuseret meget indsats på at forstå mekanismerne i MIBC udvikling for mulige terapeutiske anvendelser.

Det er nu almindeligt accepteret, at intravesikal immunterapi med Bacillus Calmette Guerin (BCG) er den mest effektive adjuverende middel til behandling af NMIBC [5] – [7]. Men det mest nyttig terapeutisk fremgangsmåde til behandling af patienter med MIBC mangler at blive identificeret. Derfor har mange undersøgelser blevet udført med henblik på at få mere indsigt i mekanismerne i MIBC udvikling, som kan føre til opdagelsen af ​​potentiel terapeutisk behandling. De biokemiske og biologiske undersøgelser i forbindelse med aggressiv TCC er blevet analyseret for at bestemme prognostiske indikatorer, eller at udvikle midler til diagnostisk og terapeutisk anvendelse. Flere specifikke molekylære markører er blevet identificeret af genekspressionsprofiler i blærekræft, herunder cellecyklus regulatorer, celledeling, apoptose og angiogenese faktorer [8]. Inflammation er involveret i udviklingen af ​​adskillige sygdomme, såsom atherosklerose, diabetes og tumorer, og ledsages af forekomsten af ​​adskillige inflammatoriske biomarkører [9] – [11]. Imidlertid er den inflammatoriske-fænotype forening, der regulerer blærekræft udvikling og metastase stadig dårligt forstået.

En enorm mængde data har vist, at interleukiner udøve en lang række funktioner ved at regulere cellevækst, celleoverlevelse, differentiering og apoptose i flere sygdomme [11]. Interleukiner kan også udvise forskellige virkninger på reguleringen af ​​immunreaktioner og patogenesen af ​​blærekræft [4] – [7]. Behandling med interleukin-6 (IL-6) var associeret med anti-tumor effekt via induktion af apoptose i muse blærecarcinom [12]. IL-15 genafgivelse viste antitumorvirkning i en mus ortotopisk blærecancer model [13]. I modsætning hertil har vist sig, IL-6 behandling for at bidrage til cellevækst i humane blære cancerceller

in vitro

[14]. Endvidere har ekspressionen af ​​IL-8 og IL-17 været impliceret i tumorvækst og metastase i human blærecancer [15], [16]. Selv om mange undersøgelser har analyseret virkningerne af interleukiner på væksten af ​​blærekræft [12] – [16]., Har dens præcise rolle og molekylære mekanisme i processen med migration og invasion af TCC forbundet med klinisk undersøgelse ikke blevet belyst

I denne undersøgelse har vi udnyttet en microarray tilgang til at identificere klinisk og biologisk informative ekspressionsmønstre, der adskiller sig mellem patienter med NMIBC og MIBC og kontrolprøver. Vores resultater fokuseret på forskelle mellem MIBC og kontrolprøver ved ekspressionsmønstre af gener, som spiller en væsentlig rolle i de vigtige cellulære processer involveret i inflammatoriske responser. Gener med mindst 2 gange forskellen udtryk i MIBC vs. kontroller blev identificeret, og de nye funktioner og signalveje i en inflammatorisk-baserede serier af blære TCC blev belyst.

Resultater

Differential Gene Expression mønstre blandt patienter grupper

Vi karakteriserede genekspression mønstre af 233 blære kræftpatienters prøver; 103 NMIBCs, 62 MIBCs og 68 normale slimhinde eller slimhinden omkring (støder op til) cancere (tabel 1). Vi anvendes først hierarkisk clustering analyse af genekspressionsmønstre at vurdere de molekylære karakteristika af de forskellige patientgrupper. Som forventet hierarkisk klyngedannelse analyse af genekspression data fra alle væv viste 3 store klynger, 1 repræsenterer den normale blære slimhinde, 1 repræsenterer MIBC patientgruppe, og 1 repræsenterer NMIBC patientgruppe (figur 1). Således genekspressionsmønstre afspejler den molekylære konfiguration var umiddelbart kan skelnes mellem blæretumorer og ikke-tumorvæv.

Gener med udtryk værdier, der havde en standardafvigelse på mindst 0,7 blev udvalgt (4.145 gener) . De røde og grønne farver afspejler høje og lave ekspressionsniveauer henholdsvis.

Vi har forsøgt siden identificere gen sæt, der blev differentielt udtrykte blandt de 3 forskellige grupper. Vi anvendte Venn-diagram sammenligning af 2-genet lister at sammenligne genekspressionsmønstre af NMIBCs og MIBCs. Først genererede vi 2 forskellige gen-lister ved at anvende en 2-stikprøve t-test (figur 2A,

P

0,001). Gene liste A repræsenterer de gener, som blev differentielt udtrykt mellem den normale slimhinde og NMIBC, og gen liste B repræsenterer de gener der blev differentielt udtrykte mellem den normale slimhinde og MIBC. Når man sammenligner de 2 gen lister blev 3 forskellige mønstre observeret: S ikke I (1.452 gener), S og I (679 gener), og jeg ikke S (381 gener) (Figur 2B). Gener i S ikke jeg kategori viste NMIBC-specifikke ekspressionsmønstre, mens gener i I ikke S kategori vises MIBC-specifik genekspression mønstre. Gener i S og jeg kategori udstillet både NMIBC og MIBC ekspressionsmønstre, hvilket betyder 679 gener i S og jeg kategori var fælles for både NMIBC og MIBC udvikling.

(A) Venn-diagram af gener udvalgt af en 2 sample t-test. Den blå cirkel (gen liste S) repræsenterer gener udtrykkes forskelligt mellem normal slimhinde og NMIBCs. Den røde cirkel (gen liste I) repræsenterer gener udtrykkes forskelligt mellem normal slimhinde og MIBCs. En cut-off

P

-værdi på mindre end 0,001 blev anvendt til at vælge gener med et udtryk, der var signifikant forskellig mellem de to grupper. (B) ekspressionsmønstre for udvalgte gener i Venn-diagram. Dataene er præsenteret i matrix-format, hvor rækker repræsenterer individuelle gener og kolonner repræsenterer hver væv. De røde og grønne farver afspejler høje og lave ekspressionsniveauer henholdsvis.

Funktionel Klassificering af Gene Expression Signatur for MIBC udvikling

For at afgøre, om vores genekspression signatur blev beriget med kendte biologiske funktioner, bioinformatik funktionel klassificering analyser af de gener, der blev differentielt udtrykt mellem normal slimhinde og MIBC blev udført. Denne analyse viste en række MIBC udvikling er forbundet med funktionelle kategorier. Funktionelle klassifikationer af gensæt er illustreret i figur 3. Vi fandt, at gener involveret i cellecyklus, cancer, cellulær vækst og proliferation, celledød, og DNA-replikation og -reparation signifikant beriget. Vi fandt også, at gener involveret i infektionsmekanismer, immunologiske sygdomme og inflammatoriske sygdomme var også til stede i stort antal. Det er interessant, at et betydeligt antal gener involveret i nyre- og urologisk sygdom, cellulære udvikling, væv udvikling, og udviklingsforstyrrelser blev observeret, hvilket inspirerede tillid til vores resultater. Der er sket store fremskridt i blærekræft forskning på gener, der bidrager til cellecyklussen, cellulære udvikling, cellevækst, eller celleproliferation, som var yderst betydningsfulde funktioner i figur 3. For at identificere genet ekspressionsniveauer i blæretumorer, vi yderligere analyseret microarray datasæt. Individuelle tumorprøver fra blærecancerpatienter afslørede 664 gener, der blev differentielt udtrykt i alle tumor vævsprøver de, hvor differentierede gener blev enten op- eller nedreguleret (tabel S1, S2, S3, og S4).

Klassifikation berigelse blev bestemt under anvendelse Ingenuity Pathway Analysis-software (version 8.8). Betydningen af ​​hver funktion blev estimeret under anvendelse af Fishers eksakte test metode. Tærsklen på statistisk signifikans var -log (

P

= 0,05).

I den foreliggende undersøgelse, analyserede vi udtrykket profil af gener involveret i cellulær proliferation, apoptose, celle cykluskontrol, angiogenese, sårheling, DNA-replikation og -reparation, cytoskelettet, og celle adhæsion mellem normal slimhinde og MIBC (tabel S1 og S2). I MIBC, de mRNA ekspressionsniveauerne af de cellulære spredning gener VAX1, TTK, TPX2, TIMELESS, STIL, TBRG4, MCM7, KIF2C, HGS, DHCR7, CENPF, BRCA1, UHRF1, TRAIP, RECQL4, RACGAP1, nationale tilsynsmyndigheder, MKI67, KISS1R, KIF15, ING1, IMPDH1, FGF18, E2F1, DLG7, BUB1B, BUB1, BRCA2, og BLM var opreguleret sammenligne med normal slimhinde (tabel S1). Den næste klynge var sammensat af apoptose-gener, der var overudtrykt (TOP2A, SCOTIN, MTP18, GSK3b, FANCG, BIRC5, AKT1S1, yars, TRIB3, TRAF2, SCARB1, RAD21, FAF1, ESPL1, E2F2, BCL2L12, ATF5, og AATF) i MIBC (tabel S1). Generne tilhørte en familie korreleret med cytoskelettet og var betydeligt over-udtrykt i MIBC: TUBG1, SPTBN2, SPAG5, SCYL1, RCC2, RAE1, PRC1, PPP4C, NUSAP1, MYOHD1, LMNB2, KIFC1, KIF4A, KIF20A, KIF14, KIAA1688 , GTSE1, CCNB1, C9orf48, C18orf24, AZI1, AURKB, TUBA6, STMN1, SNIP, SLC9A3R1, SAC3D1, ODF2, NEK2, LMNB1, KNTC1, KIF22, ITGB4BP, FAM33A, CCNB2, og ANLN (tabel S1). Vi har detekteret også opreguleret udtryk for celleadhæsion-relaterede molekyler såsom TSTA3, TROAP, ADAM15, TINAG, PVR, PPFIA1, CELSR3, og ADRM1 i MIBC (tabel S1). Angiogenese-relaterede molekylære gener, herunder TOP2A, POLD1, Pfs2, ORC1L, MCM7, Npr1 og FGF18 er opreguleret i MIBC (tabel S1). Imidlertid blev opreguleret ekspression af angiogene faktor VEGF uventet observeret i NMIBC (tabel S1). DNA-replikation og reparation gener var opreguleret i MIBC: TDP1, DNA2L, Tyms, TDG, POLQ, POLE2, POLD2, POLA2, ORC6L, MCM10, PRPF19, MGC32020, GTF2H4, EME1, RUVBL2, RAD51AP1, NUDT1, FANCB, og FANCA (tabel S1). Endelig viste de nuværende data de over-udtrykte niveauer af cellecyklus regulerede gener, der bidrager til tumor progression og invasion: UBE2C, TREX1, RCC1, PSMD8, PA2G4, LIN9, GSG2, E2F3, CDT1, CDK5RAP1, CCNF, ZWINT, PKMYT1 , CDC45L, CCNE2, CCNA2, SUV39H1, RAD54L, POLD1, HCAP-G, H2AFX, GPS1, FLJ22624, FANCD2, CHAF1A, CDCA3, ASPM, XRCC2, SPBC25, SMC4L1, SGOL1, SC65, PTTG1, POLE, PBK, MCM2, KNTC2 , KIAA1794, EXO1, CIT, CHAF1B, CEP55, CDCA8, CDCA5, CDCA2, CDCA1, C20ort172, ANAPC11 cdc2, CDC20, Cdc25C, CDC7, CDC27, og Cdc25A (tabel S1).

IL-5, IL-20 og IL-28A Stimulere Migration og invasion for blærekræft Cells

blærekræft er en immun- eller betændelse sygdomme, og immunterapi som intravesikal instillation af Bacillus Calmette-Guérin (BCG) er den vigtigste behandlingsmulighed for NMIBC at forhindre sygdomsudvikling [5] – [7], [9]. Kumulative undersøgelser har vist, at ændringer i cytokinniveauer kan være en vigtig begivenhed i fastlæggelsen af ​​sygdomsudviklingen af ​​blærekræft [17] – [19]. For den næste analyse, derfor valgte vi immunologiske eller inflammatoriske funktioner fra vores funktionelle resultater klassifikation (figur 3). Fordi døden hos patienter blærekræft er stærkt forbundet med udviklingen af ​​MIBC [4], vi analyserede genekspressionsmønstre repræsentative immun- eller inflammationsassocierede gener, der sammenligner MIBC og kontrolprøver (tabel 2 og 3). Ti (10) af disse gener (IL-5, IL-26, IL-22RA1, IL-1RAPL1, IL-1F5, IL-17RB, IL-17RE, IL-20, IL-28A, og TRAF2) viste forøget ekspression og 26-generne var nedreguleret i MIBC prøver sammenlignet med kontrolprøver (tabel 2 og 3). Vi inddelte 10 up-regulerede gener i 3 typer: (1) cytokiner (IL-26, IL-5, IL-20 og IL-1F5) (2) cytokinreceptorer (IL-22RA1, IL-17RB, IL 17RE, IL-1RAPL1, og IL-28AR1), og (3) cytokinreceptor adapter protein (TRAF-2). For det første at undersøge evnen til at inducere migration og invasion, vi brugte cytokiner IL-26, IL-5, IL-20 og IL-1F5. For det andet, vi anvendte cytokin IL-22, IL-17E, IL-17C, og IL-28A fordi disse cytokiner medierer celle-responser via sin interaktion med deres receptorer (IL-22 /IL-22RA1, IL-17E /IL-17RB, IL-17C /IL-17RE, IL-28A /IL28AR1) [20] – [23]. I tilfældet med IL-1RAPL1 brugte vi overekspression af IL-1RAPL1 cDNA-gen, fordi liganden af ​​IL-1RAPL1 endnu ikke var blevet identificeret [24]. Endelig har vi også brugt TRAF2 cDNA-genet, vi havde klonet. Tidligere rapporter viste, at MIBC udvikling var stærkt forbundet med migration og invasion af cancerceller [4], [15]. For at bestemme om up-regulerede gener i MIBC inducere migration og invasion af blære cancerceller, udførte vi sårhelende assays og invasion analyser i blærekræft 253J og EJ celler ved hjælp af rekombinante proteiner eller cDNA gener. Blandt de 10 undersøgte molekyler, IL-5, IL-20 og IL-28A væsentligt forbedret både sårhelende migration og invasion af 253J celler, sammenlignet med ubehandlede celler (figur 4A og 5A). Lignende resultater blev fundet i EJ celler (figur 4B og 5B). Desuden blev celleproliferation ikke observeret i nogen af ​​de 3 tilfælde af cytokin-behandlede blære cancerceller (fig S1A og B). Men de andre 5 cytokiner og 2 gener havde ingen effekt på migration og invasion af blære cancerceller (figur S2, S3, og S4).

(A, B) Den sammenflydende blære cancerceller blev inkuberet med serumfrit medium og behandlet med rekombinant protein IL-5, IL-20 og IL-28A i de angivne tidsrum. Bredden af ​​skade linjer foretaget i celler blev derefter undersøgt ved 0 og 24 timer. Sårhelende migration er repræsenteret ved bredden af ​​skade linjer.

(A, B) Cellerne blev anbragt i det øvre kammer, og de angivne koncentrationer af IL-5, IL-20, og IL-28A blev anbragt i den lave brønd i kemotaxi kammeret. Invaderet celleantal blev talt efter de angivne tidspunkter. Resultaterne er udtrykt som antallet af invaderede celler i forhold til ubehandlet kontrol som bestemt fra 3 uafhængige eksperimenter. **

P

. 0,01 sammenlignet med ingen behandling

IL-5, IL-20 og IL-28A Expression blev opreguleret i Patienter med MIBC

for at validere niveauet af IL-5, IL-20 og IL-28A, vi næste målte mRNA-niveauerne af 62 MIBCs og 68 normale prøver af real-time PCR. Resultaterne viste, at ekspressionsniveauer af IL-5, IL-20 og IL-28A mRNA var almindeligvis højere i MIBC patienter end hos raske personer (figur 6), hvilket antyder, at ekspression af IL-5, IL-20, og IL-28A er stærkt og signifikant associeret med invasiv blærekræft.

Kvantitativ realtids-PCR blev anvendt til at validere genekspressionen af ​​IL-5, IL-20 og IL-28A i MIBC patienter og raske individer. Kliniske prøver blev opnået fra 62 MIBC patienter og 68 raske individer. MRNA blev isoleret og anvendt til at udføre real-time PCR for IL-5, IL-20 og IL-28A. Resultater repræsenteres som IL-5, IL-20 og IL-28A mRNA-ekspression i forhold til GAPDH mRNA-ekspression. *

P

. 0,01 sammenlignet med raske individer

IL-5, IL-20, IL-28A, og deres receptorer opdaget af Real-time PCR, immunoblot og Konfokal immunfluorescensmikroskopi i Blære Cancer Cells

for at afgøre, om IL-5, IL-20 og IL-28A mRNA blev udtrykt i både 253J og EJ celler, blev real-time PCR-analyse udført. Som vist i figur 7A og D, ekspressionen af ​​IL-5, IL-20 og IL-28A mRNA blev endogent detekteret i begge cellelinier. Behandling af begge cellelinier med 10% FBS i 24 timer viste signifikant opregulering af IL-5, IL-20 og IL-28A ekspression i mRNA-niveauer (figur 7A og D). Desuden viste real-time PCR-analyse ekspressionen af ​​receptorerne 3 cytokiner, IL-5Rα, IL-20R1, og IL-28AR1 i både 253J og EJ celler (figur 7B og E). IL-5, IL-20 og IL-28A proteiner blev observeret ved immunblot af proteinekstrakter fra begge cellelinier (figur 7C og F). IL-5, IL-20 og IL-28A-proteinekspression blev forøget ved tilsætning af 10% FBS (figur 7C og F). Brug af immunfluorescens konfokal mikroskopi, vi undersøgte dernæst sub-cellulære lokalisering af IL-5, IL-20 og IL-28A protein i begge cellelinier. Alle 3 cytokiner blev dispergeret i cytoplasmaet og i peri-nukleare områder (figur 8A og B).

(A, B, D, og ​​E) Celler blev inkuberet med de forskellige koncentrationer af FBS i 24 timer og de mRNA-ekspressionsniveauer af IL-5, IL-20, IL-28A (A, D) og deres receptorer (B, E) blev kvantificeret ved real-time PCR. Resultaterne blev udtrykt som IL-5, IL-20, IL-28A og deres receptorens mRNA-ekspression i forhold til GAPDH mRNA-ekspression. *

P

0,01 sammenlignet med ingen behandling. (C, F) Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af FBS i 24 timer, og protein-niveauer af IL-5, IL-20 og IL-28A blev analyseret ved immunblot. GAPDH-ekspression blev anvendt som indlæsning kontrol.

(A, B) 253J og EJ celler henholdsvis blev farvet med antistoffer mod QD565-konjugeret IL-5, IL-20 og IL-28A (rød). Begge kerner (anti-DAPI) og cytoplasma (anti-tubulin-Alexa488) er modfarvet med DAPI (blå) og tubulin-Alexa488 (grøn).

IL-5, IL-20 og IL -28A Aktiverer MMP-9 Expression via Aktivering af Transcription Factors NF-KB og AP-1 i blærekræft Celler

Tidligere rapporter viste, at MMP-9-ekspression tæt forbundet med blære tumor invasion og migration [4], [15], [25] – [29]. Vores data viser, at IL-5, IL-20 og IL-28A stimuleret migrering og invasion af blæren cancerceller (figur 4 og 5). Disse resultater fik os til at undersøge, om IL-5, IL-20 og IL-28A inducerer MMP-9-ekspression. Behandling af begge typer af cancerceller med IL-5 i signifikant opregulering af MMP-9-ekspression i et koncentrations- og tidsafhængig måde, detekteret ved anvendelse af gelatinezymografi og immunoblotanalyse (figur 9A, 9B, 10A, og 10B) . Lignende resultater blev observeret efter behandling med enten IL-20 eller IL-28A, henholdsvis (figur 9A, 9B, 10A, og 10B). Derudover er ekspressionen af ​​MMP-2, en anden matrixmetalloproteinase, blev også stimuleret i IL-5-, IL-20- og IL-28A-behandlede celler, såsom 253J og EJ celler (figur 9A, 9B, 10A, og 10B). 5′-regulatoriske region af det humane MMP-9-promotor indeholder flere konsensus motiver til NF-KB, AP-1, og SP-1 transkriptionsfaktorer [30] – [32]. Vi ræsonnerede, at MMP-9-ekspression af IL-5, IL-20 og IL-28A kan være korreleret med forøget aktivitet af NF-KB, AP-1, og Sp-1 i kernen. Til dette formål har vi udført en elektroforetisk mobilitet (EMSA) under anvendelse nukleare ekstrakter af blærekræft celler induceret af IL-5, IL-20 og IL-28A. IL-5, IL-20 og IL-28A inducerede signifikant stigning i NF-KB og AP-1 bindingsaktiviteter i 253J cellelinjer (figur 11). Ingen specifikke bindende komplekser i Sp-1 blev observeret i celler behandlet med nogen af ​​interleukiner (Figur 11). Men i tilfælde af EJ-celler, både IL-5 og IL-28A stimulerede NF-KB-bindingsaktivitet (figur 12). Øget NF-KB og AP-1 bindingsaktiviteter blev påvist i IL-20-behandlede EJ celler (figur 12).

(A) Celler blev dyrket til 70% konfluens i DMEM suppleret med 10% FBS og mediet blev skiftet til et serumfrit medium. Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af IL-5, IL-20 og IL-28A i 24 timer. (B) Time-afhængig MMP-9-ekspression i blære cancerceller induceret af IL-5-, IL-20- og IL-28A. Celler i serumfrit medium blev inkuberet med IL-5-, IL-20- og IL-28A (100 ng /ml) i forskellige tidsrum. Konditionerede medier fra (A) og (B) blev analyseret ved Zymografisk MMP-aktivitet. Protein ekspression af MMP-2, MMP-9 og GAPDH blev bestemt ved immunoblotanalyse.

(A) Konfluente celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS, og mediet blev ændret til et serum -fri medium. Cellerne blev stimuleret med angivne koncentrationer af IL-5, IL-20 og IL-28A i 24 timer. (B) Induktion af tidsafhængige MMP-9-ekspression i IL-5-, IL-20- og IL-28A-behandlede blære cancerceller. Celler i serumfrit medium blev stimuleret med IL-5-, IL-20- og IL-28A (100 ng /ml) i angivne tidspunkter. Zymografisk MMP-aktivitet blev analyseret under anvendelse konditionerede medier fra (A) og (B). Protein ekspression af MMP-2, MMP-9 og GAPDH var underkastet immunoblotanalyse.

Celler blev dyrket med serum-frit medium indeholdende de angivne koncentrationer af IL-5, IL-20 og IL -28A. Efter 24 timer blev kerneekstrakter fra cellerne analyseret ved EMSA for aktiveret NF-KB, AP-1, og Sp-1 under anvendelse af radioaktivt mærkede oligonucleotidprober.

Celler blev inkuberet med serum-frie medier for de angivne koncentrationer af IL-5, IL-20 og IL-28A i 24 timer. Derefter blev kerneekstrakter fra cellerne underkastet EMSA for at teste NF-KB, AP-1, og Sp-1 bindingsaktivitet anvendelse af radioaktivt mærkede oligonucleotidprober.

Induktion af MAPK og Jak-Stat Signaling pathway i blærekræft celler induceret af IL-5, IL-20 og IL-28A

Fordi signalering for cytokiner primært aktiverer Jak /Stat og MAPK signaltransduktionsveje [8], vi næste undersøgt signaleringskaskader induceret af IL-5, IL-20 og IL-28A i blære cancerceller. Tidsforløb eksperimenter blev udført i 253J og EJ celler. IL-5 behandling induceret aktivering af ERK1 /2, JNK, JAK1, JAK2, Stat1, Stat2, og Stat3 i 253J celler (Figur 13A og 14A). Stimulering af EJ celler med IL-5 resulterede i aktivering af ERK1 /2, p38MAPK, JAK1, JAK3, Stat1, og Stat3 (figur 13B og 14B). Desuden IL-20 steg aktiveringen af ​​ERK1 /2 i både 253J og EJ celler (figur 13A og 13B). Aktivering af JAK2, JAK3, Stat2, og Stat5 blev påvist i IL-20-behandlede 253J celler (Figur 14A). Behandling med IL-20 stimulerede aktiveringen af ​​JAK1, JAK2, Stat1, Stat2, og Stat5 i EJ celler (Figur 14B). I tilfældet med IL-28A, blev aktiveringen af ​​ERK1 /2 observeret i 253J-celler (Figur 13A), p38MAPK aktivering var opreguleret i EJ celler (Figur 13B). Behandling af 253J celler med IL-28A inducerede aktivering af JAK2, JAK3, Stat3, og Stat5 (figur 14A). Desuden blev aktiveringen af ​​JAK2, Stat1, og Stat3 induceret af IL-28A behandling i EJ celler (Figur 14B). Imidlertid blev AKT aktivering påvirkes ikke i IL-5-, IL-20- og IL-28A-behandlede blære cancerceller (fig S5A og B).

(A, B) Celler blev inkuberet i IL -5, IL-20 og IL-28A (100 ng /ml) i de angivne tider, og blev derefter høstet, lyseret og underkastet immunoblotanalyse til aktivering niveauer af MAPK anvendelse af specifikke antistoffer.

(A, B) Celler blev behandlet med IL-5, IL-20 og IL-28A (100 ng /ml) i de angivne tidsrum, og blev derefter høstet. De aktivering niveauer af Jak-Stat blev påvist ved immunoblotanalyse anvendelse af specifikke antistoffer.

Diskussion

Mange undersøgelser har brugt genekspression profilering af urinblæren kræft ved hjælp af microarrays. Tidligere undersøgelser med analyse af genekspression profilering har fokuseret på cellulær proliferation, cellecyklusregulering, DNA-replikation og reparation, apoptose, signaltransduktion, transkriptionsfaktorer, angiogenese, celleadhæsion, sår helbredelser, og cytoskelettet. I den foreliggende undersøgelse er de ekspressionsmønstre for en række tumorrelaterede klassiske gener (fx VEGF, PGF, FGF18, AKT, E2F1, ATF5) inden for vores microarray datasæt blev påvist som forudsagt. Den hierarkiske clustering analyse foreslog, at mange gener kan deltage i regulatoriske netværk, som omfatter de mange biologiske systemer, der er nødvendige for udvikling blærekræft. Men lidt om de immunologiske eller inflammatoriske-associerede cytokiner er involveret i udviklingen af ​​menneskelig urin blærekræft.

På baggrund af resultaterne fra den nuværende microarray datasæt, har vi bestemt forskellene i immun lydhør genekspression mønstre mellem normal og MIBC. Ti (10) gener (Tabel 2) blev opreguleret baseret på deres genekspression mønstre i MIBC, sammenlignet med normale mucosa prøver, hvilket tyder på, at disse up-regulerede gener er tæt forbundet med udviklingen af ​​blærekræft. På det første stadium af undersøgelsen, fra disse 10 gener, vi fundet 3 store cytokiner, IL-5, IL-20 og IL-28A, som deltager i migration, invasion, og MMP udtryk uden at påvirke celledeling, hvilket indikerer et koordineret program klynge for at muliggøre udviklingen af ​​TCC som bestemt ved sårhelende migration, invasion assay, zymografi, proteinniveauer, og EMSA aktivitetsniveauer. Desuden identificerede vi også, at MAPK og Jak /Stat signalering aktiveres i blære cancerceller efter behandling med IL-5, IL-20 og IL-28A.

IL-5 blev oprindeligt identificeret som et T -celle erstatte faktor (TRF), og blev efterfølgende vist at regulere aktiveringen, proliferation og overlevelse af eosinofiler [33]. IL-5 har også vist sig at være en vigtig regulator for differentieringen af ​​muse-B-celler [34]. IL-5-receptoren er en heterodimer sammensat af a- og p-underenheder. Den α-underenheden er ligand-specifik (IL-5Rα), hvorimod β-underenhed (βc) er fælles for IL-3 og IL-5 [33], [34]. Tidligere undersøgelser har vist, at IL-5 aktiveret Lyn [35], Jak2 /Stat1 [36], MAPK [35], Syk [37], og PI3K [38] i eosinofiler. Aktiveringen af ​​Jak2, BTK tyrosinkinaser, PI3K, Shc, Vav, og HS1was forbundet med IL-5-induceret proliferation af B-celler [39]. IL-5-promotor indeholdt væsentlige transkriptionsfaktorer herunder Sp1, E12 /E47, Oct-2, og c /EBPβ i B-celler og eosinofiler [40]. Anvendelsen af ​​rBCG vacciner til behandling af blærecarcinomer frembragte ikke TH-2 type cytokiner, herunder IL-5 niveauer [41]. I den foreliggende undersøgelse blev både IL-5 og IL-5Rα detekteret ved RT-PCR og immunoblot i blære cancerceller. Vi har også identificeret aktiveringen af ​​ERK1 /2, p38MAPK, JNK, JAK1, JAK2, JAK3, Stat1, Stat2, og Stat3 i blære cancerceller. Vores observation i dette forsøg er i overensstemmelse med en nylig rapport, der viser, at de cirkulatoriske niveauer af IL-4, IL-5 og IL-10 var signifikant højere i blærekræft patientserum end i normale prøver [19]. Således kan stigninger i IL-5-niveauer i denne undersøgelse være ansvarlig for augmented udvikling af blære tumorceller og deres manglende evne til at blive genkendt af inflammatorisk.

IL-20, den pleiotropiske inflammatoriske cytokin, findes i keratinocyt og identificeret som et medlem af IL-10 familiemedlemmer cytokiner, som omfatter IL-10, IL-29, IL-20, IL-22, IL-24 og IL-26 [42], [43]. IL-20 stimulerer signaler gennem 2 alternative heterodimere komplekser, der består af enten IL-20R1 og IL-20R2 eller IL-22R1 og IL-20R2 [42], [43]. Resultater fra den foreliggende undersøgelse viste ekspression af IL-20 og IL-20R1 i blære cancerceller. Med hensyn til signalering, IL-20 induceret STAT3-aktivering i keratinocytter [42]. En tidligere rapport viste aktiveringen af ​​MAPK, såsom ERK1 /2, p38 MAPK, og JNK, i IL-20-behandlede HUVEC-celler [44]. IL-20 behandling inducerede også aktiveringen af ​​Jak2 /Stat3 og ERK1 /2-vejen i GBM8901 glioblastomceller [45]. Vores resultater fra blære cancerceller viser, at IL-20 inducerede aktivering af ERK1 /2 og JAK1, Jak2, JAK3, Stat1, Stat2, og Stat5. Desuden er IL-20 er forbundet med flere inflammatoriske sygdomme [45], [20], herunder psoriasis, rheumatoid arthritis, nyresvigt, hjerneskade, og atherosklerose.