PLoS ONE: En Probabilistic Boolean Network Approach til analyse af kræft-Specifik Signalering: Et casestudie af dereguleret PDGF Signalering i GIST

Abstrakt

Baggrund

Signal transduktion netværk i stigende grad studeres med matematisk modellering tilgange mens hver af dem er egnet til et særligt problem. For kontekstualisering og analyse af signalering netværk med steady state protein data, vi identificeret probabilistisk Boolean netværk (PBN) som en lovende ramme, der kunne fange kvantitative ændringer af molekylære forandringer ved steady-state med en minimal parameterisering.

Resultater og konklusion

i vores casestudie, vi med succes anvendt PBN tilgang til at modellere og analysere dereguleret blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) signalvejen i Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST). Vi eksperimentelt bestemte en rig og nøjagtig datasæt af steady-state profiler af udvalgte downstream kinaser af PDGF-receptor-alfa-mutanter i kombination med inhibitor behandlinger. Anvendelse af værktøjet

optPBN

, vi monteret en litteratur-afledt kandidat netværksmodel til uddannelsen datasæt bestående af enkelt forstyrrelse betingelser. Model analyse foreslog flere vigtige krydstale interaktioner. Gyldigheden af ​​disse forudsigelser blev yderligere undersøgt eksperimentelt peger på relevante igangværende krydstale fra PI3K til MAPK signalering i tumorceller. Den raffinerede model blev evalueret med en validering datasæt omfatter multiple forstyrrelse betingelser. Modellen derved viste fremragende præstation gør det muligt at kvantitativt forudsige kombinatoriske reaktioner fra de enkelte behandlingsresultater i denne indstilling kræft. Den etablerede

optPBN

pipeline er også bredt anvendelig til at få en bedre forståelse af andre signalering netværk ved steady state i en kontekst-specifik mode

Henvisning:. Trairatphisan P, Wiesinger M, Bahlawane C , Haan S, Sauter T (2016) En Probabilistic Boolesk Network Approach til analyse af kræft-specifik Signalering: Et casestudie af dereguleret PDGF Signalering i GIST. PLoS ONE 11 (5): e0156223. doi: 10,1371 /journal.pone.0156223

Redaktør: Julio Vera, University of Erlangen-Nürnberg, Tyskland

Modtaget: Januar 21, 2016 Accepteret: 11 maj 2016; Udgivet: May 27, 2016

Copyright: © 2016 Trairatphisan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud F1R-LSC-PUL-09PDGF og F1R-LSC-PUL-11PDGF fra University of Luxembourg. Panuwat Trairatphisan er en modtager af stipendier tildelt af Fonds National de la Recherche Luxembourg (AFR tilskud nummer 1.233.900). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Signal transduktion netværk er en af ​​de centrale funktionelle lag i celler. De overbringe intra- og ekstra-cellulære signaler i retning af regulatorer, der modulerer ekspressionen af ​​cellulære fænotyper svarende til de typer og koncentrationer af de [1] stimuli. Generelt er en signaltransduktion netværk er et stort og meget komplekst netværk omfatter multiple intracellulære signalveje såsom mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK), phosphatidyl-inositide-3-kinaser /AKT /pattedyr-target-of-rapamycin (PI3K /AKT /mTOR), og phospholipase C-y /proteinkinase C (PLCγ /PKC) baner [2]. Også, der findes en række krydstale samspillet mellem disse signalveje, der hjælper til at finjustere signaler og til at bevare hele netværkenes integritet på forstyrrelser [3-5]. I en fysiologisk tilstand, er signaler fra forskellige stimuli integreres og transduceres til at regulere cellulære funktioner og for at opretholde homeostase af cellulære bestanddele [6]. Når overførslen processer disse signaler dereguleret, de resulterende afvigende signaler ofte føre til abnormiteter i cellulære funktioner, som blev identificeret som ætiologien af ​​mange sygdomme, herunder neurodegenerative sygdomme, metaboliske sygdomme, samt kræft [7-9].

gastrointestinale stromale tumorer (GIST’er) er den mest almindelige primære mesenkymale neoplasi af mavetarmkanalen. Disse tumorer almindeligvis skyldes gevinst på funktion mutationer af type III receptortyrosinkinaser, dvs. KIT i 78-90% af tilfældene og blodpladeafledt vækstfaktor alpha (PDGFRα) i 5-7% af tilfældene [10]. Som konstitutivt aktive overfladereceptorer, disse muterede proteiner er de mest opstrøms komponenter af det cellulære signaltransduktion netværk. Den første linje terapi for GIST’er er kirurgisk resektion kombineret med administration af Imatinib mesylat, en tyrosinkinasehæmmer med aktiviteter mod ABL, BCR-ABL, KIT, og PDGFRα /β. Det kliniske resultat af første-linje-behandling er 35% -49% 9 år overlevelse [11]. Men visse punktmutationer i GIST, f.eks en aspartat (D) til valin (V) mutation ved aminosyre 842 på

PDGFRA

gen, blev også vist at være associeret med resistens [12]. Adskillige hypoteser blev foreslået til at forklare de underliggende molekylære mekanismer i onkogenisk PDGFRα-drevne GIST dannelse, såsom opbevaring af onkogene PDGFRα i intracellulære rum [13] eller deregulering af downstream onkogene signalveje, se også [14]. Sådanne hypoteser kræver yderligere undersøgelse på det molekylære niveau til at forstå, hvordan signaler transduceres og behandles mekanistisk i denne indstilling kræft.

I de seneste år, diverse modellering tilgange i Systembiologi blev anvendt til at modellere og analysere egenskaber signal transduktion netværk i både fysiologiske og patologiske tilstande. Dette omfatter Bayesianske netværk [15], Boolske netværk (BNS) [16], fuzzy logic modeller [17], ordinær differentialligning (ODE) -baserede modeller [18], partiel differentialligning (PDE) -baserede modeller [19], og også stokastiske modeller [20], til listen kun nogle få eksempler. Nogle modellering arbejde viste også forbindelserne mellem deregulering af signal transduktion netværk til patofysiologien af ​​sygdomme, f.eks i metabolisk sygdom [21], og i kræft [22]. Valget af en egnet modellering ramme er afhang af forskningsspørgsmål og de tilhørende applikationer.

I vores undersøgelse, vi sigter mod at vurdere relevansen af ​​de foreslåede krydstale interaktioner fra litteraturen i forbindelse med dereguleret blodpladeafledt vækstfaktor ( PDGF) signalering i gastrointestinal stromal tumor (GIST) baseret på steady-state protein data. På den eksperimentelle del, undersøgte vi en kombination af forskellige PDGFRα mutanter og signalanlæg molekyleinhibitorer at dissekere den molekylære struktur af dereguleret PDGF signalvejen og til at generere en omfattende tilsvarende sæt steady-state protein data. På modellering del, vi anvendte probabilistisk Boolean netværk (PBN) modellering, oprindeligt indført af Shmulevich et al. at modellere gen regulerende net i forbindelse med usikkerhed [23], for at vurdere krydstale relevans i PDGF signalering. Med tildelingen af ​​sandsynligheder på Boolske interaktioner, en binarised-state PBN er i stand til at skildre de enkelte regulerende virkninger kodet som booleske regler på en stokastisk måde og er derfor velegnet til bestemmelse af usikre relevans krydstale interaktioner. Desuden kan de molekylære aktiviteter ved steady-state også være repræsenteret ved steady-state fordeling inden for rammerne PBN, der giver dem mulighed for at være direkte i forhold til de normaliserede (ikke-diskretiserede) steady-state protein data. For en nylig gennemgang se [24].

Udover PBNs, der også findes mange andre modellering rammer for studiet af signal transduktion netværk. Men hver af dem har nogle ulemper, når de anvendes til dette særlige tilfælde studie. Beskriver forbindelserne mellem signalmolekyler med betingede sandsynligheder i et Bayesian ramme netværk udtrykke deres relationer kvantitativt, men disse værdier ikke fange de underliggende reguleringsmekanismer mellem molekyler, der kan forenkles og kodet som booleske regler. Boolske netværk kan skildre reguleringsmekanismer af biokemiske vekselvirkninger med logiske operatører. Men resultaterne ikke fange finere skala kvantitative oplysninger om molekylære kinetik. De variant mange værdsat logiske netværk giver mulighed for en mere finjusteret beskrivelse af molekylære tilstande, men stadig lider den iboende deterministiske natur og tillader ikke at fange den usikkerhed af net interaktioner. Udvidelser af Boolske netværk, f.eks ved at tilføje usikkerhed i netværk stater (fx ved at tildele tilfældige oprindelige betingelser og /eller tilfældige sekvenser af indgange) og akkumulere de stokastiske resultater fra flere kørsler kunne også anvendes til at udlede kvantitative foranstaltninger fra det samme system [6,25]. , Men man udtrykkeligt pålægge disse yderligere overvejelser på toppen af ​​den konventionelle Boolean netværk rammer, mens den probabilistiske funktionen allerede er integreret i den oprindelige PBN tilgang. Flere kvantitative metoder såsom fuzzy logik eller ODE-baserede modeller give yderligere mekanistiske oplysninger om netværk på en kontinuerlig skala. Men de kræver en omfattende mængde forhåndskendskab til at definere en passende matematisk formel og kræver et omfattende sæt af eksperimentelle data med henblik på at udlede kinetiske parametre.

Med hensyn til PBN som tilhører gruppen af ​​probabilistiske logiske modeller , andre relaterede modellering rammer i samme gruppe som Dynamic Bayesianske netværk (DBNs) og Markov Login netværk (MLN’er) blev også beskrevet. Det blev vist, at analyseresultaterne fra DBNs normalt give lignende resultater som PBN engang staten overgangsordning diagram er etableret [26]. Men ikke-lineær opførsel i biologisk netværk såsom kompleksdannelse kunne ikke være direkte repræsenteret af betingede sandsynligheder i dynamisk Bayesian netværk, mens en sådan interaktion simpelthen kan kodes med logiske operatorer inden for rammerne PBN. Desuden blev det vist, at PBNs også kan repræsenteres i en mere generel form, som Markov Logic netværk (MLNs) [27]. Denne fremgangsmåde anvendes ofte i genetiske undersøgelser, hvor nettet struktur er stort set ukendt, og forbindelsen mellem netværkskomponenter kunne være meget tætte [28]. Alligevel kan MLNs ikke være egnet til studiet af signaltransduktion netværk i vores tilfælde som forbindelserne mellem molekylerne opstår ofte i en en-til-en eller en-til-mange måde og retningsbestemte forbindelser mellem signalmolekyler er for det meste veldokumenteret. Vi valgte derfor og anvendt PBN i vores casestudie, hvor vi kunne vise, at PBN modellen anvendes til at analysere relevansen af ​​krydstale interaktion. Desuden viste vi, at PBN modellen også kunne forudsige kombinatoriske behandlingsresultater fra individuelle stimulation målinger med stor nøjagtighed.

Materialer og metoder

Biologiske materialer

PDGFRα-mutant proteiner blev genereret på baggrund af pLNCX2-PDGFRα vildtype ekspressionsplasmid generøst tilvejebragt af Prof. Andrius Kazlauskas (Boston). Denne sekvens blev klonet til pcDNA5 /FRT /TO-vektor (Invitrogen ™) og konstitutivt aktive onkogene PDGFRα mutant forekommer i GIST blev genereret ved at indføre D842V punktmutation (PDGFRα-D842V-vildtype,

“DV-WT”

). Baseret på PDGFRα-D842V mutant, to PDGFRα-D842V-

“knock-out”

mutanter blev konstrueret ved at indføre tyrosin (Y) til phenylalanin (F) punktmutationer, dvs. Y720F (PDGFRα-D842V-Y720F,

“DV-dMAPK”

) og YY731 /742FF (PDGFRα-D842V-YY731 /742FF,

“DV-dPI3K”

), som har vist sig at ophæve rekruttering af signalmolekyler såsom SHP2 og PI3K i PDGFRα-vildtype-receptoren, hhv. Alle punktmutationer blev indført ved anvendelse af QuikChange kit (Stratagene) ifølge producentens anbefalinger.

Til analyse signaleringen adfærd af den mutante PDGFRα protein, en isogen Flp-In ™ cellelinien blev konstrueret baseret på HEK293 cellelinjen hvilket naturligvis blottet for endogen ekspression af PDGFRα /p-proteiner. Som sådan HEK293-celler blev co-transficeret med Flp-In ™ målstedet vektor (pFRT /lacZeo, Invitrogen ™) og den regulerende vektoren (koder Tetracycline repressorproteinet, pcDNA ™ 6 /TR /Invitrogen) under anvendelse af TransIT®-LT1 transfektionsreagens (Mirus) ifølge producentens anbefalinger. Cellekloner blev selekteret ved dyrkning i nærvær af 10 ug /ml Blasticidin og 100 pg /ml Zeocin ™ (begge InvivoGen). Baseret på denne isogene parentale cellelinje ( “293FR”), blev stabile cellelinjer frembragt ved steddirigeret rekombination ved co-transfektion af transgenekspression plasmid (pcDNA5 /FRT /TO-baseret) i kombination med Flp-rekombinase ekspressionsplasmidet (pOG44, Invitogen). Stabilt transficerede celler blev selekteret og dyrket i nærvær af 100 ug /ml Hygromycin og 10 ug /ml Blasticidin [13].

Cell behandling og Western blot-analyse

Eksperimenter blev udført ved podning 250.000 celler /brønd (12 brønds plade) i DMEM indeholdende 10% FBS, 2% L-glutamin og 25 mM HEPES på plader med 12 brønde i 24-30 timer. Derefter blev vækstmediet udskiftet og proteinekspression blev induceret ved tilsætning af 5 ng /ml doxycyclin (Sigma) under serum reduceret (1% FBS) betingelser for 14 timer og i yderligere 3 timer under serumfrit (0% FBS) betingelser. Farmakologisk inhibering blev udført ved tilsætning af enten 1 uM af PI3K-inhibitoren Wortmannin, 10 uM af MEK1,2 inhibitor U0126, 1 pM af pan-PKC-inhibitor GF109203X, eller 500 nM for PKC-α og PKC-β1 specifik inhibitor Gö6976. Wortmannin og Gö6976 blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, mens GF109203X og U0126 blev indkøbt fra Calbiochem.

Celler blev lyseret på fad med 300 pi 1x Lämmli buffer. Cellulære proteiner blev underkastet SDS-PAGE, overført til en nylonmembran (Amersham Hybond ™ -N /GE Healthcare af ThermoFisher Scientific), blokeret med 10% BSA og probet med de respektive antistoffer. Alpha-tubulin blev også probet som ladningskontrol. Phospho-specifikke antistoffer mod ERK1 /2 (pThr202 /pTyr204), PDGFRα (pTyr849) /β (pTyr857), AKT (pSer473) og PKC substrater (Pser-) blev købt fra Cell Signaling. Phospho-specifikke antistoffer til STAT5 (pTyr694) og PLCγ1 (pTyr783) blev indkøbt fra BD Biosciences. Antistoffer mod PDGFRα (C-20) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology®. Hver gel blev undersøgt samtidig mod alfa-tubulin at give kompensation for lastning variationer (ved hjælp af enten antistof DM1A /Santa Cruz Biotechnology® eller PA1-38814 /Pierce ™). De sekundære antistoffer blev koblet med IRdye, så billeddannelse med LI-COR Odyssey system. De relative intensiteter af Western blot billeder blev kvantificeret med Image Studio Lite version 4.0 ved hjælp af venstre-højre og top-bund baggrund subtraktion. Eksperimenterne blev udført i 3 biologiske replikater med 3 tekniske replikater på hver Western blot. Den kalibrator blev fremstillet fra en tidlig passage af DV-WT-cellelinje fremkaldt af 5 ng /ml doxycyclin.

Normalisering pipeline og datasæt til modellering

Fra de opnåede rå eksperimentelle data, en kvalitet kontrol skridt blev påført ved at kassere 1) datapunkterne overlappende med uspecifikke pletter og 2) datapunkterne med lave signaler på grund af blotting spørgsmål. Endvidere blev datapunkter med et tilsvarende tubulin signal på mindre end 20 procent i forhold til det maksimale signal i det samme blot fjernet fra analysen på grund af lavt signal-støjforhold.

De resterende datapunkter blev først normaliseret til tubulin (lastning kontrol) og derefter til en kalibrator prøve for at korrigere for forskellene på tværs af flere blots. Den normaliserede gennemsnit af tekniske triplikater fra hver biologisk replikat blev samlet og igen normaliseret til den maksimale værdi for at generere den endelige middelværdi og standardafvigelse for modellering opgaven.

Vi delte den indledende sæt eksperimentelle data i to dele . Uddannelsen datasæt består af 6 eksperimentelle betingelser, herunder negativ kontrol (alle signaler antages at være nul), positiv kontrol (DV-WT) og 4 eksperimentelle betingelser med enkelt forstyrrelser ved YF punktmutationer (DV-dMAPK og DV-dPI3K) eller signalering inhibitorer ( DV-WT-Wortmannin og DV-WT-U0126). Valideringen datasæt omfatter de 4 resterende eksperimentelle betingelser med kombinerede forstyrrelser.

Litteratur-afledt PDGF signalering netværk

Vi byggede en mutant PDGF signalering netværk, herunder de store nedstrøms signalveje herunder MAPK, PI3K /AKT /mTOR, PLCγ /PKC veje, samt Stat5 som en anden fremtrædende signalering mål nedstrøms for den onkogene mutant (men ikke nedstrøms for vildtype-receptor) [13]. Interaktioner og reguleringsmekanismer blev modelleret efter veletableret viden [29,30]. De rekruttering steder af opstrøms signalmolekyler til PDGFRα blev beskrevet tidligere [31,32]. Blandt de tre nedstrøms signalveje i PDGF signalering, findes der også en række krydstale interaktioner foreslået af litteraturen som anført i tabel 1. Ud bortset fra afbilder virkninger af inhibitorer på deres vigtigste mål, vi omfattede også oplysninger om en off-target virkning Wortmannin på konventionel PKC [33], som kan være afgørende for at forklare de opnåede signalering profiler i forbindelse med GIST.

PBN beskrivelse af PDGF signalnet

baseret på topologien af ​​litteraturen-afledte PDGF signalnet byggede vi en tilsvarende PBN model, som består af 27 knuder (molekyler) og 40 kanter (interaktioner). Flere interaktioner dirigere på én node blev modelleret som adskilte booleske regler med de tilsvarende udvælgelsessandsynligheder. Vi anvendte den booleske logik gate “eller” at kombinere ikke-eksklusive indgange i samme klasse, mens hæmninger var repræsenteret ved den kombinerede “AND” og “ikke” porte. Derudover blev udvælgelsessandsynligheder af de Boolske regler, der repræsenterer de vigtigste veje tildelt til at være høj med flaget “H”, og samtidig være fastgjort til lav med flaget “L” for alle krydstale interaktioner. Denne opgave sikrer, at de optimerede udvælgelsessandsynligheder for interaktion (er) med flaget “H” vil altid være højere i forhold til interaktionen (r) med flaget “L”. For eksempel, hvis der er to aktiverende interaktioner lede mod et enkelt mål node mens det ene er fra de vigtigste vej og en anden er fra den krydstale interaktion, den bundne af den optimerede valg sandsynligheden for de vigtigste interaktion (med flag “H”) vil være 0,5-1,0, mens den vil ligger mellem 0 og 0,5 for den krydstale interaktion (med flag “L”). Denne implementering er integreret i den seneste version af

optPBN

værktøjskasse (version 2.2.3) til rådighed på https://sourceforge.net/projects/optpbn. Det komplette sæt af modelbeskrivelser og gennemførelsen af ​​de Boolske regler, herunder tildeling af “H” og “L” flag kan blive fundet i S1 Filer og de beregningsmæssige scripts af PBN modeller, samt eksempel på resultaterne indgår i S2 File.

optimering

Vi anvendte grid-baseret version af den

optPBN

værktøjskasse (version 2.2.3) til at udføre optimering og analyse [39]. Modellen beskrivelse af PDGF signaleringsnetværket i PBN format blev kombineret med steady-state måledata af 6 signalmolekyler herunder phosphorylerede former af PDGFRα, af PLCγ, af STAT5, af PKC-substrater, af ERK1,2, og for AKT , at generere et optimeringsproblem. Formålet med optimering er at identificere de udvælgelsessandsynligheder af hver boolesk interaktion i PBN model, returnere steady-state egenskaber, dvs. de stationære fordelinger af de molekylære tilstande, som passer til de måledata. I

optPBN

rammer, vi repræsenterer dynamikken i en PBN som en ergodic Markov kæde, hvor vi sikrer ergodicitet ved at indføre en lille forstyrrelse parameter ‘p’ til tilfældigt forurolige staterne [40]. Den resulterende ergodic Markov kæden er derfor

irreducible

(alle stater kan nås med andre stater) og

aperiodisk

(alle stater kan revurderes i en ikke-periodisk måde) dermed besidder en unik stationær fordeling, uanset at de oprindelige betingelser. De to-state Markov kæde tilgang blev efterfølgende anvendt til at bestemme antallet af nødvendige tid skridt til at nå steady-state og at tilnærme de marginaliserede steady-state distribution af hver udgang stat med en vis nøjagtighed [41] (se også rørledningen i fig 1). Alle parameterværdier blev valgt i overensstemmelse med den tidligere undersøgelse [39], dvs. den forstyrrelse parameteren ‘p’ = 0,001, rækken af ​​nøjagtighed parameter »r« = 0,025, og sandsynligheden for at erhverve resultater på den definerede nøjagtighed ‘s’ = 0,95, at sikre oprettelsen af ​​ergodic Markovkæder baseret på tilfældige forstyrrelser, mens steady-state distribution af hver node var minimalt perturberede og tilnærmelse af steady-state fordeling er forholdsvis nøjagtige. I det sidste trin, blev summen af ​​kvadrerede fejl (SSE) at sammenligne de simulerede molekylære stater og måling af data beregnet som indikator for goodness-of-fit.

Den dynamiske opførsel af PBN modellen blev repræsenteret en Markov-kæde. En lille forstyrrelse parameter ‘p’ blev indført for at sikre ergodicitet af de respektive Markov kæde, der er gjort

irreducible

(alle stater kan nås med andre stater) og

aperiodisk

(alle stater kan revurderes i en ikke-periodisk måde) dermed besidder en unik steady-state fordeling uafhængigt af de oprindelige betingelser. De to-state Markov kæde tilgang blev efterfølgende anvendt til at bestemme antallet af nødvendige tid skridt til at nå steady-state (burn-in periode), og til at indsamle tilstrækkeligt stort antal prøver for at tilnærme de marginaliserede steady-state fordeling af output stater for en defineret (justerbar) nøjagtighed. Bemærk, at flere evalueringer af burn-in periode, og kan være nødvendig indsamlede prøver. Den tilnærmet steady-state fordeling svarer til sandsynligheden for output node (r) er ON, dvs. være en, som bestemt ud fra de indsamlede prøver.

I den undersøgte PBN model af PDGF signalering, op til 27 udvælgelsessandsynligheder blev optimeret på Grid’5000 infrastruktur ved hjælp 160 parallelle kerner (Intel CPU @ 2.50Ghz, 16GB ram). 5.000 prøver af parametersæt blev evalueret af to optimeringsalgoritmer, nemlig differentiel evolution (DE) og evolutionære algoritme (EA). Tre runder af optimering blev udført, hvor vi observerede, at optimering resultater genereret af DE-algoritmen blev konvergeret allerede efter 1.500 iterationer (resultat ikke vist). Den bedste fitting omkostninger fra DE-algoritmen blev valgt til sammenligning af montering kvalitet mellem modelvarianter sammen med Akaike s Information Criterion (AIC) [42,43] og F-test for regressionsmodel. blev analyseret efterfølgende Middelværdien og distribution af de optimerede udvælgelsessandsynligheder baseret på de bedste 500 parametersæt.

Modellering af dereguleret PDGF signalering i BN og ODE-baserede rammer

Vi anvendte

BN /PBN værktøjskasse

[44] og

Systembiologi værktøjskasse 2 (SBTB2)

revision 72 [45] for at modellere og analysere deregulerede PDGF signalering i GIST også i BN og ODE rammer hhv. Hvad angår modellering i forbindelse BN fjernede vi alle negativ tilbagekobling på noden PDGFR, fjernede de basale aktiviteter PTEN og PDK samt antaget, at Wortmannin ikke hæmmer PKC effektivt, for at opnå den bedst mulige tilpasning i forbindelse BN . For ODE modellering, anvendte vi loven af ​​masse indsats for at konvertere interaktionen grafen for dereguleret PDGF signalering i et sæt af ordinære differentialligninger, se et eksempel i [20]. Vi tilføjede også deaktivering /nedbrydningsreaktioner og deres tilsvarende parametre for hvert molekyle at afbalancere aktivering /syntese. 20 uafhængige optimering løber af ODE model blev udført ved anvendelse 50.000 parametersæt anvender partikel sværm algoritme (global optimiser) efterfulgt af afprøvning yderligere 50.000 parametersæt anvender Simplex algoritmen (lokal optimiser) med en parameter området fra 0 til 100. Det bedste fitting pris fra ODE model blev sammenlignet med dem fra BN og PBN nærmer mens fordelingen af ​​optimerede parametre fra alle 20 optimering kørsler blev sammenlignet med dem af PBN model. Det komplette sæt af beregningsmæssige scripts og modellering resultater findes på https://sourceforge.net/projects/optpbn.

Resultater

Ufuldstændig hæmning og potentielle indflydelse af krydstale interaktioner blev observeret fra eksperimentelle data

Vi undersøgte signalering profiler af tre PDGFRα mutanter, dvs. DV-WT, DV-dMAPK og DV-dPI3K i kombinatorisk behandling med to signalering hæmmere, dvs. Wortmannin og U0126. Ifølge resultaterne fra Western blot-undersøgelse (figur 2), cellesystemet og signalering inhibitorer fungerede korrekt. Vi observerede, at PDGFRα transgener blev udtrykt udelukkende på doxycyclin induktion, og at basal phosphorylering af signalmolekyler var meget lavt. Desuden var phosphorylerede PDGFRα (pPDGFRα) signaler kunne sammenlignes mellem de forskellige mutanter (figur 2). Denne bemærkning gælder også for phosphoryleret Stat5 (pSTAT5) signaler. Det phosphorylerede PLCγ (pPLCγ) signaler faldt i DV-dMAPK mutant, hvilket indikerer, at SHP-2 rekruttere motiv Y720 påvirker også PLCγ aktivering (se figur 2). Samtidig faldt aktiviteter nedstrøms signalmolekyler, dvs. phosphoryleret ERK1,2 (pERK1,2) og phosphoryleret AKT (Pakt) blev observeret i overensstemmelse med de hæmmende virkninger af YF mutanter og de signalering hæmmere. Disse resultater indikerer, at ophævelsen af ​​rekruttering sites ved punktmutationer og signalering hæmmere arbejdede effektivt på deres primære mål. Desuden fandt vi, at hverken de konstruktioner af vores cellesystem eller de inhibitor-behandlinger, der anvendes i undersøgelsen påvirker ekspressionsniveauet af de undersøgte signaling komponenter (se [13] og S1 Fig).

[A] An eksempel, af rå data fra Western blot eksperimenter er vist i fig 2A. Tre PDGFRα mutanter, der indeholder D842V punktmutation blev undersøgt. En mutant indeholder ingen yderligere YF punktmutation, dvs. vildtype (DV-WT), mens de to andre indeholder enten Y720F (DV-dMAPK) eller YY731 /742FF (DV-dPI3K) punktmutationer, som ophæver de rekruttering steder af opstrøms signalmolekyle til MAPK og PI3K /AKT /mTOR veje, henholdsvis. Disse eksperimentelle betingelser blev kombineret med en behandling med to signaling inhibitorer, dvs. Wortmannin (W) [1 pM], som primært inhiberer PI3K, og U0126 (U) [10 pM], som primært inhiberer MEK1,2. Doxycyclin anvendes til at inducere transkription af konstitutivt phosphorylerede PDGFRα mutanter. Eksperimentet blev udført i 3 biologiske replikater med 3 tekniske replikater. Signalerne fra kalibratoren prøve (C) afledt af den inducerede DV-WT-cellelinie i en tidlig passage blev anvendt til at kalibrere de relative intensiteter mellem Western blots. [B] summerede kvantificerede Western blot data er vist i fig 2B. Signalerne blev normaliseret mod tubulin og efterfølgende kalibreret af kalibrator signaler. Den normaliserede middelværdi af tekniske triplikater fra hver biologisk replikat blev samlet og re-normaliseret til den maksimale værdi for at generere det endelige middelværdi og standardafvigelse værdier for modellering opgave. De betydninger mellem to datapunkter blev vurderet med t-test; p-værdi 0,05 (*) og p-værdi 0,01 (**).

Blandt de hæmmende effekter, som vi undersøgte, vi observeret, at både Wortmannin og U0126 reduceret phosphorylering af deres downstream signalering mål næsten fuldstændigt. I modsætning hertil DV mutanter med yderligere YF punktmutationer leveres kun delvis inhibering, f.eks signalerne fra pERK1,2 og pPLCγ i DV-dMAPK mutanter er kun reduceret til det halve. Sideløbende blev nogle beviser på krydstale interaktion observeret i datasættet. For eksempel inhiberer PI3K med Wortmannin sænkede også pERK1,2 signal i MAPK-vejen, mens inhibering MEK1,2 med U0126 endvidere øget den Pakt signal i PI3K /AKT /mTOR pathway (Fig 2B). Det skal bemærkes, at den tværgående regulering gennem Wortmannin inhibering er stærkere end en via U0126, med op til 39% nedsat pERK1,2 signal versus op til 25% øget Pakt signal sammenlignet med de ubehandlede betingelser. Også på tværs af regulering af Wortmannin er signifikant i 2 ud af 3 mutanter, mens krydset hæmmende effekt medieret af U0126 var betydelig kun i DV-WT tilstand (figur 2).

Indledende dataintegration i PBN rammer foreslog vigtige krydstale interaktioner fra kandidat netværk

Vi har integreret denne første datasæt i litteraturen-afledte PBN model af PDGF signalering ved at anvende værktøjet

optPBN

. Modellen struktur og opsplitning af datasæt er vist i figur 3. I første omgang, vi startede med en model topologi uden crosstalk interaktion at udforske, hvis modellen, der kun indeholder de vigtigste onkogene veje allerede ville være tilstrækkelig til at passe træningen datasættet. Resultaterne viste, at den oprindelige model passede godt til pPDGFR, pSTAT5 og Pakt data, men stadig ikke kunne fange faldet i pErk1 /2 signaler efter Wortmannin behandling. Vi fandt også, at en model variant med alt-eller-intet-hæmning ikke kunne passe godt til enten pErk1 /2 eller pPLCγ data (se S2 Fig).

[A] Den model af litteraturen -afledt PDGF signalering er vist i fig 3A. Den konstitutive aktivitet af muteret PDGFRα (mPDGFR) er inducerbar ved doxycyclin (DOX). Neden for mPDGFR omfatter 3 kanoniske intracellulære signalveje: MAPK, PI3K /AKT /mTOR og PLCγ /PKC veje samt reguleringsmekanismer på PDGFRα. Desuden har vi inkluderet, STAT5, som viste sig at være temmelig aktiveret af onkogene PDGFRα mutanter [13]. SHP2, PI3K og PLCγ, markeret med stjerner, er målene for YF mutanter. De basale aktiviteter PTEN og PDK var repræsenteret ved bPTEN og bPDK hhv. Fire signalering inhibitorer, dvs. Wortmannin, U0126, GF109231X (GF109), og Gö6976 og deres mål er også afbildet.