PLoS ONE: SPARC, foxp3, CD8 og CD45 Sammenhæng med recidiv og Long-Term sygdomsfri overlevelse i kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

SPARC er et matricellular protein involveret i væv remodellering, cellevandring og angiogenese, mens forkhead kasse P3 (Foxp3) protein fungerer som en transskription faktor involveret i immun celle regulering . Både SPARC og Foxp3 kan spille en anti-tumorigen rolle i cancer progression. Formålet var at bestemme, om SPARC, foxp3, CD8 og CD45RO-ekspressionsniveauer er forbundet med colorektal cancer (CRC) stadium, sygdommens udfald og langsigtet cancer-specifik overlevelse (CSS) i trin II og III CRC.

Metoder og Resultater

SPARC udtryk blev oprindeligt vurderet i 120 parrede normal og stadie i-IV CRCs. Efterfølgende ca 1000 parret patientprøver i trin II eller III CRC’er i væv microarrays blev farvet for SPARC, foxp3, CD8 eller CD45RO. Proportional farer modellering vurderede sammenhænge mellem disse markører og klinisk-patologiske data, herunder sygdom udfald og kræft specifik overlevelse (CSS). Både SPARC og Foxp3 ekspression var signifikant større i CRC end normalt colon (p 0,0001). Høj SPARC udtryk korreleret med god sygdom resultatet (≥ 60 mdr uden recidiv, p = 0,0039) og bedre langsigtet CSS i fase II CRC ( 0,0001). I trin III CRC, høj SPARC ekspression korrelerede med bedre langsigtet CSS (p 0,0001) og mindre adjuvans kemoterapi brug (p = 0,01). Høj Foxp3 korreleret med en god sygdom resultat, bedre langsigtet CSS og mindre adjuverende kemoterapi brug i fase II (p 0,0037, 0,0001 og p = 0,04), men ikke i fase III CRC. Høj CD8 og CD45RO udtryk korreleret med bedre resultat sygdom i stadie II CRC, og bedre CSS, men forskellene var ikke så markant som for SPARC og Foxp3.

Konklusioner

Disse data tyder på, at høje SPARC og foxp3 er forbundet med bedre resultat sygdom i stadium II CRC og kan være prognostiske indikatorer for CSS. Yderligere vurdering af, om disse markører forudsige patienter med høj risiko for recidiv med trin II CRC og funktionelle studier af disse effekter er undervejs

Henvisning: Chew A, Salama P, Robbshaw A, Klopčič B, Zeps N, Platell C et al. (2011) SPARC, foxp3, CD8 og CD45 Sammenhæng med recidiv og Long-Term sygdomsfri overlevelse i kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (7): e22047. doi: 10,1371 /journal.pone.0022047

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 10. januar, 2011; Accepteret: 15 juni 2011; Udgivet: 26 Jul 2011

Copyright: © 2011 Chew et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen blev foretaget med støtte fra Fremantle Hospital Medical Research Foundation og National Health og Medical Research Council (NHMRC # 458.755). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er meget udbredt i de vestlige befolkninger og en af ​​de førende årsager til kræft morbiditet og mortalitet i hele verden [1], [2]. Eksklusive ikke-melanom hudkræft, CRC er den mest almindelige kræftform i Australien og den næstmest almindelige dødsårsag på grund af malign sygdom [3], [4]. Den amerikanske fælles udvalg om kræft (AJCC) udviklet et almindeligt anvendt mellemstation for at fastslå patientens prognose. Der er dog overlapper hinanden i de 5-årige overlevelsesrater mellem trin II og III CRC [5], [6]. Stage III kræftformer har vist lymfatisk spredning mens stadie II kræftformer har tumorer lokaliseret til tarmslimhinden. Nogle af fase II-tumorer, men kan også have mikrometastaser der går uopdaget. I lyset af dette, hensyntagen til de biologiske karakteristika af tumoren, gennem identifikation af biomarkører, der forudsiger sygdom omfang, kan give en mere nøjagtige metoder til at korrelere kræft scenen med resultatet sygdom, og tillade anvendelse af de mest hensigtsmæssige behandlinger for de enkelte patienter.

Tumor infiltrerende T-lymfocytter, som udtrykker CD8 og CD45RO er blevet vist at korrelere med bedre CRC resultater [7], [8], [9], [10]. Tilstedeværelsen af ​​en høj tæthed af CD8

+ T-celler er også forbundet med fraværet af tumorinvasion, et tidligere sygdomsstadie og forbedret patientoverlevelse [11], [12]. High CD45RO

+ T-celle densiteter i lymfeknudemetastaser og tumorer af CRC også forbinder med mindre tumorindtrængen, lavere sygdomsstadie og en bedre overlevelse patient [9], [12]. To yderligere potentielle biomarkører for interesse i patogenesen og prognosen for CRC er udskilt protein Sure og Rig på cystein (SPARC) og forkhead kasse P3 (Foxp3), da de er også begge stærkt udtrykt i maligne sygdomme og har vist sig at væsentligt korrelere med sygdom udfald.

SPARC er et matricellular glycoprotein, der er involveret i væv remodellering, sårheling, cellevandring og angiogenese [13], [14], [15], [16]. Det udtrykkes i talrige væv, især i beskadigede væv, hvor ekstracellulær matrix (ECM) remodeling er nødvendig som reaktion på skade [17]. Høj SPARC ekspression er blevet associeret med forøget tumorvækst, metastase og dårlig sygdomsprognose i forskellige maligniteter herunder melanom, bryst- og øsofageal kræft [6], [18], [19]. SPARC har også været impliceret i colon polyp udvikling og CRC tumor progression gennem regulering af cycloxygenase-2 (COX-2) [20], og transformerende vækstfaktor beta-1 (TGFp-1) [21]. Disse er involveret i regulering, og nedbrydning af ECM omgivende tumorceller. I ovariecancer, er imidlertid høj SPARC ekspressionsniveauer forbundet med en god prognose [22]. Denne korrelation er et resultat af SPARC evne til nedregulere makrofag rekruttering til tumorstedet og produktionen og aktiviteten af ​​interleukin (IL) -6, prostanoider og matrixmetalloproteinaser at mindske den tilknyttede inflammation [23].

foxp3 er også en biologisk markør af interesse og er den vigtigste transkriptionsfaktor kontrollerende regulatoriske T-celle (Treg) udvikling og funktion. Tregs undertrykke aktivering af immunsystemet, og dermed bevare immunsystemet homeostase og tolerance over for selv-antigener. Dermed kan imidlertid disse celler undertrykke antitumorvirkningen immunologisk respons ved at reducere cytotoksisk T-celle-aktivitet ved direkte celle-til-celle-kontakt eller gennem frigivelse af cytokiner [24]. En direkte forbindelse mellem tilstedeværelsen af ​​tregs og progression af kræft i æggestokkene er blevet påvist, hvor tumor foxp3 + tregs undertrykte tumor specifik immunitet og bidrog til reduceret overlevelse [25]. I brystcancer, en stigning i Treg befolkning, både i perifert blod og tumorvæv, blev også rapporteret, og en nylig undersøgelse påvist en sammenhæng mellem intratumoral infiltration af foxp3 + tregs i brystkræft og risikoen for sene tilbagefald [26]. I betragtning af den centrale bidrag foxp3 til Treg funktion, kan ekspressionen af ​​foxp3 af tumorceller repræsenterer en hidtil ukendt mekanisme, hvorved kræftformer undertrykke immunsystemet at undslippe destruktion.

I dette studie undersøgte vi SPARC og Foxp3 i trin II og III CRC væv og sammenligne deres prognostiske værdi mod de kendte CRC prognostiske markører CD8 og CD45RO, som udtrykkes ved tumor infiltrerende T-lymfocytter. Disse har vist sig at korrelere med en bedre sygdom udfald CRC [7], [8], [9], [10]. Tilstedeværelsen af ​​en høj tæthed af CD8

+ T-celler er associeret med fravær af tumorinvasion, et tidligere sygdomsstadie og forbedret patientoverlevelse [11], [12].

Formålene med denne undersøgelse var at bestemme, om SPARC og foxp3 ekspressionsniveauer er forbundet med CRC fase udfald sygdom og langsigtet cancer-specifik overlevelse i trin II og III CRC og sammenlignet den prognostiske værdi af disse to markører mod de kendte prognostiske CRC markører CD8 og CD45RO .

Materialer og metoder

Etik erklæring

Etisk godkendelse til denne forskning blev opnået fra human Research etiske komité for de sydlige Metropolitan Area Health Services og fra Sir Charles Gairdner Hospital menneskelige forskningspotentiale etiske komité. Alle patienter, der leverer væv til væv microarray underskrevet en samtykkeerklæring før kirurgisk fjernelse af tarmkræft at give mulighed for denne forskning, der skal gennemføres.

Patient detaljer

Demografiske oplysninger blev indsamlet retrospektivt på alle patienter fra patologi optegnelser, og oplysninger om sygdomsspecifikke overlevelse blev opnået fra Cancerregisteret i Western Australia. Alle patienter havde mindst opfølgning på 60 måneder eller indtil døden. Oplysninger om anvendelsen af ​​adjuverende kemoterapi med fluorouracil /leucovorin-baserede regimer efter operationen blev opnået fra hospital medicinske journaler. Patienter blev anset for at have haft en god sygdom resultat, hvis der ikke var nogen tilbagefald inden for 60 måneder efter diagnosen, mens patienter, som havde sygdomstilbagefald inden for 60 måneder efter diagnosen, eller var døde af deres sygdom, blev anset for at have haft en dårlig sygdom udfald .

Initial SPARC vurdering

SPARC niveauer blev oprindeligt vurderet i histologiske snit af AJCC fase i-IV CRC væv for at afgøre, om der var en forening med CRC og i hvilke celler SPARC blev udtrykt. Dette omfattede prøver (n = 120) indsamlet fra en 464 patient kohorte diagnosticeret med CRC mellem 1996 og 2002.

Tissue microarray (TMA)

Opførelsen af ​​TMA’er anvendt i denne undersøgelse har tidligere været beskrevet [27]. Den TMA’er bestod af cirka 1000 sager hver af fase II og III CRC arkivering vævsprøver fra patienter, der blev diagnosticeret med CRC i perioden 1990-1999 på Sir Charles Gairdner Hospital. Hvert tilfælde bestod af to 1 mm tumor diameter væv kerner og en ekstra kerne 1mm diameter taget fra histologisk normal colon mucosa.

Vurdering af SPARC udtryk blev foretaget på 233 patienter med AJCC stadie II og 125 AJCC fase III CRCs. T-celle-densitet-analyse af foxp3, CD8 og CD45RO blev afledt fra en større patient kohorte af samme arkiveret AJCC stadie II og III CRC prøver, er tidligere blevet beskrevet [28].

Fire mikrometer tyk formalinfikseret paraffin indlejrede sektioner fra TMAs havde høj temperatur antigen hentning med 1 mM EDTA (pH 8) og 10 mM citratpuffer (pH 6). Ikke-specifik farvning blev blokeret. Primære antistoffer anti-SPARC (1: 200; Hæmatologiske Technologies Inc, Vermont, USA), anti-CD8 (klon C8 /144B, klar til brug, DakoCytomation, Heverlee, Belgien), CD45RO (klon UCHL1, klar til brug; DakoCytomation) og anti-foxp3 (1:100; Abcam, Cambridge, MA, USA) blev anvendt med inkubation natten over ved 4 ° C. Efter vask blev sektionerne inkuberet med 1:2 fortyndet biotinyleret link universel antistof og streptadvidin-HRP opløsninger (Universal LSAB + kit, DakoCytomation Carpinteria, CA) i 30 minutter hver. Farve blev udviklet ved inkubation i 3,3-diaminobenzidin (DAB) opløsning (Substrat Kromogen System, DakoCytomation, Carpinteria, CA) og sektioner blev modfarvet med Mayers haemotoxylin og dækglas med Depex. Farvning uden primært antistof blev anvendt som en negativ kontrol. Billeder blev taget med et digitalt kamera (Nikon DS-L1) i lyse felt på et omvendt mikroskop (Nikon TE2000-U). Tissue microarrays blev scannet ved hjælp af Aperio ScanScope XT Digital Slide Scanner (Aperio Technologies, CA), der ligger på den australske Microscopy Mikroanalyse Research Facility ved Center for Mikroskopi, Karakterisering Analyse, The University of Western Australia

Vurdering af SPARC udtryk

rolle SPARC i patogenesen af ​​forskellige tumorer er meget kontekstafhængig. I både CRC, og normal colonvæv blev SPARC bemærket at være næsten udelukkende udtrykkes af vimentin-positive stromale mesenchymceller. Dets ekspression blev ikke observeret i de maligne celler og blev set i kun et meget lille antal af normale epitelceller. SPARC ekspression inden maligne og kontrolvæv derfor nødvendigt at være kontrolleret for mængden af ​​stromavæv stede. Serielle vævssnit blev taget og farvet for SPARC og den specifikke mesenchymal celle markering, vimentin (anti-vimentin, 01:30; Novocastra Laboratories Ltd). De vimentin-positive celler blev morfologisk identificeret ved en uafhængig histopatolog som stromale mesenkymale celler. SPARC positive områder blev bestemt ved hjælp af en positiv pixel algoritme (ImageScope v8.0, Aperio Technologies, CA), som måler farvning intensitet af de positive, stærke positive og negative pixels

(

Figur 1

)

. SPARC ekspression blev kun målt i regioner, der indeholder vimentin-positive celler og forholdet mellem SPARC til vimentin farvning for hver TMA kerne blev anvendt til at styre for indhold det stromale væv i hver prøve. Alle SPARC resultater præsenteres som et forhold mellem SPARC til vimentin.

SPARC og vimentin farvning fra en enkelt patient. Billeder demonstrere serielle DAB-farvede vævssnit til både (A) SPARC og (C) vimentin og computer analyserede billeder af den respektive DAB-farvning (B og C). Blå repræsenterer DAB-negative pixels (mørke områder), appelsin DAB-positive pixels og røde stærkt DAB-positive pixels (lyse områder). SPARC-ekspression selektivt kun måles i de regioner i det væv, der var også vimentin-positive.

Vurdering af foxp3, CD8 og CD45RO udtryk

Målingen af ​​T-celle tæthed har tidligere blevet rapporteret [28] og anvendes billedanalysesoftware (Imagescope v8.0, Aperio) at evaluere antallet af FOXP, CD8 og CD45RO-positive celler (celler pr kvadratmillimeter). Individuelle kerner blev undersøgt og kommenteret at sikre, at kun normal colon epitel eller levedygtigt tumorvæv indgik i området analyse.

Statistisk analyse

Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± SEM. Students uparrede t-test og Kruskal-Wallis-analyse med Dunns efterfølgende tests blev anvendt til at sammenligne SPARC ekspression og T-celle densitet mellem de forskellige grupper, og en P-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. SPARC udtryk og T-celle tætheder blev klassificeret som

høj

eller

lave

i forhold til medianværdien som vist i Salama

et al

, 2008 [28]. Alle statistiske analyser og grafer blev oprettet ved hjælp Graphpad Prism® 4.0 softwarepakke til Windows PC (Graphpad Software, San Diego, CA, USA). Kaplan-Meier produkt grænse estimat af overlevelse blev anvendt til at beregne langsigtet cancer-specifik overlevelse. Arrangementet variable var død af CRC (som defineret af kodning på patientens død certifikat). Alle overlevelsestider blev beregnet fra datoen for histologisk diagnose af CRC, indtil enten en begivenhed fandt sted, eller de forblev i live på en

st marts 2008.

Resultater

Stromal SPARC udtryk i normal colon væv vs. stadie i-IV CRC

SPARC niveauer blev undersøgt i 120 parrede normale colon og AJCC stadier i-IV CRC. SPARC udtryk var signifikant større i alle kræftformer sammenlignet med den tilsvarende normale colon væv

(

Figur 2A

).

Det var også signifikant større i CRC stadie II-IV sammenlignet at iscenesætte jeg, men der var ingen forskel mellem trin II-IV

(

Figur 2B

)

. Når patienter med stadie II og III CRC blev opdelt i dem med et godt resultat (ingen sygdom tilbagefald inden for 5 år efter diagnosen) og en dårligt resultat (tilbagefald inden for 5 år efter diagnosen eller død af sygdom), patienter med en god sygdom resultatet i både fase II og III havde højere SPARC udtryk i den primære tumor, men disse resultater var ikke signifikant forskellige

(

Figur 2C

).

(A) Procentdelen af ​​positivt farvede celler i AJCC trin i, II, III og IV CRCs sammenligning med normalt colonvæv (Con). SPARC-ekspression var signifikant større i CRC sammenlignet med kontrol. Der var en signifikant større antal SPARC positive celler i fase II, III og IV CRC forhold til fase I (p = 0,092, p = 0,005 og p = 0,0007 henholdsvis). Data præsenteret som et scatter plot med gennemsnittet ± SEM. (B) P-værdier, der sammenligner procentdelen af ​​SPARC-positive celler i trin I, II, III og IV CRC. (C) P-værdier, der sammenligner SPARC udtryk i fase II til III god og dårlig resultat CRC. Ingen forskelle i SPARC niveauer mellem god og dårlig fase II CRC eller gode og dårlige fase III CRC. Data, udtrykt som en procentdel af positivt farvede celler ± SEM.

Stromal SPARC udtryk i fase II og III CRC

TMA’er var ansat til at måle SPARC i en kohorte af 358 trin II eller III CRC patienter. SPARC-ekspression var signifikant større i alle cancer (fase II og III kombineret) sammenlignet med normale colon-væv (p 0,0001;

Figur 3A

), med ingen statistiske forskelle, der konstateres i SPARC ekspression mellem patienter med stadium II og III sygdom (

3B

). Når patienterne blev yderligere opdelt i fase II og III sygdom med enten en god eller en dårlig resultat, SPARC udtryk var signifikant større hos patienter med en god sygdom resultat i fase II CRC (p = 0,0039;

Figur 3C

) blev dog ikke observeret nogen statistisk forskel mellem grupperne i fase III CRC (

Figur 3D

).

(A) SPARC til vimentin forholdet var signifikant større i CRC væv i forhold til normal colon væv. (B) blev ikke observeret nogen forskel i SPARC udtryk mellem fase II og III CRC. (C) SPARC var signifikant større hos patienter med en god sygdom resultat i fase II CRC, men ikke i (D) fase III CRC. Hver prik repræsenterer en patient og søjlerne repræsenterer medianen ± SEM.

T-celle Foxp3, CD8 og CD45RO udtryk i CRC

Undersøgelse T-celle tæthed ved hjælp TMA’er af en 967 kohorte, foxp3 var signifikant højere i CRC væv i forhold til normal colon mucosa (p 0,002,

Figur 4A

og

Figur 5

). I modsætning hertil CD8 og CD45RO-ekspressionsniveauer var signifikant lavere i normal kolonmucosa (p 0,0001,

Figur 4B og C

) stemte overens med tidligere resultater. Når dividere prøverne i faser II eller III, var foxp3 signifikant større i fase II i forhold til fase III (p 0,002,

Figur 4D

). Tilsvarende CD8 og CD45RO ekspressionsniveauerne var signifikant større hos patienter med stadie II CRC forhold til fase III (p 0,0001 for begge,

Figur 4E og F

). Når man sammenligner disse markører med resultatet sygdom, var signifikant større hos patienter med en god sammenlignet med dårligt resultat i fase II CRC (p = 0,0037;

Figur 6A

) Foxp3, mens ingen statistiske forskelle blev observeret i fase III CRC (

Figur 6B

). Disse resultater svarede til CD8 og CD45RO (p = 0,0195 og 0,0054 henholdsvis

Figur 6C, D, E og F

).

(A) Foxp3 ekspression var signifikant større i CRC væv sammenlignet til normal colonvæv, mens (B) CD8 og (C) CD45RO-ekspressionsniveauer var signifikant større i normal colonvæv forhold til CRC væv. Når der ses på T-celle-tæthed og sygdomsstadie (D – Foxp3; E – CD8 og F – CD45RO), ekspressionen af ​​alle tre markører var signifikant større i trin II CRC sammenlignet med stadium III CRC. Hver prik repræsenterer en patient og søjlerne repræsenterer medianen ± SEM.

Billeder demonstrere DAB-farvede vævssnit for CD8 positive celler, CD45RO-positive celler og Foxp3 positive celler. Billeder blev taget ved 20X scanning forstørrelse.

Når dividere patienterne i god og dårlig sygdom resultat, foxp3 udtryk var signifikant større hos patienter med en god sygdom resultatet i (A) fase II CRC, men ikke i (B) fase III CRC. Tilsvarende CD8 var også signifikant større hos patienter med en god sygdom resultatet i (C) fase II CRC, men ikke i (D) fase III, som med CD45RO i (E) fase II og (F) fase III. Hver prik repræsenterer en patient og søjlerne repræsenterer medianen ± SE.

Kræft-specifik overlevelse

Patienterne blev fulgt i mindst 60 måneder eller indtil døden. Den mediane follow-up tid var 60,6 måneder for patienter med AJCC stadie II-sygdom og 41,3 måneder for patienter med stadie III sygdom. Den gennemsnitlige SPARC og Foxp3 ekspression i de primære tumorer i patienter med og uden tilbagefald ved hvert tidspunkt blev målt for at bestemme, om niveauer korreleret med recidiv over tid. Fase II CRC patienter uden tilbagefald, havde signifikant højere SPARC niveauer i deres primære tumorer på alle tidspunkter op til 60 måneder, og for de fleste point op til 138 måneder, sammenlignet med de patienter, der lider af en sygdom tilbagefald (

Figur 7A

). I fase III CRC, SPARC niveauer signifikant højere hos patienter uden sygdomstilbagefald 84 måneder fra diagnose og fremefter (

Figur 7B

). Denne sammenhæng mellem høj SPARC udtryk og lav recidiv blev forstærket af univariat analyse viser, at forskellen mellem de to grupper (med og uden, sygdomstilbagefald) var signifikant forskellig i både fase II og III (p 0,0001;

Figur 7A og B

).

den gennemsnitlige SPARC og foxp3 udtryk i den primære tumor blev målt og korreleret med recidiv. Antallet af patienter med eller uden recidiv på hvert tidspunkt vises under hver graf. (A)

SPARC udtryk i fase II CRC

.

Patienter uden recidiv havde signifikant højere SPARC niveauer på hele tiden peger op til 60 måneder, og for de fleste point op til 138 måneder i forhold til dem patienter, der lider af en sygdom tilbagefald. Den samlede SPARC ekspression var signifikant forskellig mellem de to grupper (p lt; 0,0001). (B)

SPARC udtryk i fase III CRC

.

SPARC udtryk var signifikant højere hos patienter uden tilbagefald fra 84 måneder og videre. SPARC var også signifikant forskellig mellem de to grupper (p 0,0001). (C)

Foxp3 udtryk i fase II CRC

. Højere Foxp3 niveauer var også signifikant forbundet med mindre tilbagefald som med (D)

Foxp3 udtryk i fase III CRC

imidlertid forskellene var ikke så markant som i fase II CRC. Foxp3 udtryk var signifikant forskellig mellem de to grupper i både fase II og III (p 0,0001). Hvert datapunkt repræsenteret middelværdien SPARC eller Foxp3 ekspressionsniveauet på hvert tidspunkt. (*) P 0,05, (**) p. 0,01

Højere Foxp3 niveauer blev også forbundet med mindre tilbagefald i fase II CRC (

Figur 7C

), og selvom foxp3 ekspressionsniveauerne i primære tumorer var forskellig mellem patienter med og uden tilbagefald i fase III som forskellige tidspunkter (

Figur 7D

), disse forskelle var ikke så markant som i fase II-sygdom. Som med SPARC, den samlede foxp3 udtryk var signifikant forskellig mellem patienter med og uden, tilbagefald i både fase II og III. (P 0,0001:

Figur 7C og D

)

samlet overlevelse

Ved udgangen af ​​undersøgelsesperioden, havde 27% af patienterne døde af CRC og 22% døde af andre årsager. For at vurdere den samlede patient overlevelse, blev Kaplan-Meier overlevelseskurver afledt at vise høje og lave markør niveauer i forhold til medianen SPARC værdi, og deres forbindelse med overlevelse. Høje SPARC og Foxp3 niveauer begge signifikant korreleret med en bedre langsigtet overlevelse (p 0,0001 og 0,0002 henholdsvis;

Figur 8A og B

). Høje CD8 og CD45RO niveauer også korreleret med en bedre overlevelse på lang sigt, men i forhold til SPARC og Foxp3, adskillelsen mellem kurverne og betydningen niveauer var ikke så stor (

Figur 8C og D

). En univariate overlevelse analyse blev anvendt til at bestemme den prognostiske betydning af hver af de fire markører.

Tabel 1A

viser, at høj SPARC, foxp3, CD8 og CD45RO udtryk i CRC væv alle uafhængigt forudsagt overlevelse. Ved at kombinere alle fire markører i en multivariat analyse (

Tabel 1B

) viste, at mens hver af disse markører havde en betydelig prognostisk værdi på egen hånd, anvendes sammen de ikke forbedre forudsigelse af overlevelse. Kombinationen af ​​SPARC og foxp3 eller SPARC og CD8 dog betydeligt forudsagt overlevelse bedre end at bruge alle fire markører i koncert, eller kombinationen af ​​foxp3, CD8 og CD45RO (

Tabel 1B

). Ingen af ​​disse kombinationer var imidlertid bedre til at forudsige overlevelse end SPARC anvendt alene.

Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev afledt til at vise høje og lave markør niveauer i forhold til overlevelse. (A) Høj SPARC niveauer signifikant korreleret med bedre overlevelse på lang sigt. (B) Høj Foxp3 niveauer også signifikant korreleret med bedre overlevelse på lang sigt. Selvom høj (C) CD8 og (D) CD45RO ekspressionsniveauerne var forbundet med bedre overlevelse på lang sigt, adskillelsen og betydning mellem kurverne var ikke så stor.

Korrelation af CRC patologi med T-celle tæthed og SPARC udtryk

De patologiske funktioner i CRC, T-celle markører og SPARC udtryk er angivet i

tabel 2

. Densiteten af ​​CD8

+, CD45RO

+ og Foxp3

+ -celler i tumorvæv omvendt korreleret med AJCC fase (i overensstemmelse med TMA data

Figur 4A

), mens ingen signifikant korrelation mellem SPARC udtryk og AJCC blev observeret (også i overensstemmelse med TMA-data

Figur 3B

). CD8

+ og CD45RO

+ udtryk omvendt korreleret til perineural invasion, og direkte korreleret med lymfatisk respons og mikrosatellit instabilitet.

Adjuverende kemoterapi

TMA samling opstod fra 1990 -96 og før 1994 kemoterapi blev ikke rutinemæssigt givet for CRC. Af patienterne i denne kohorte, 8% af fase II og 44% af stadium III patienter fik adjuverende kemoterapi. SPARC udtryk og T-celle tætheder blev sammenlignet mellem patienter, som havde, og havde ikke modtaget adjuverende kemoterapi efter kirurgisk resektion (

Tabel 3

). Forholdet mellem SPARC at vimentin udtryk var signifikant større hos patienter med stadium III CRC, der ikke havde fået adjuverende behandling (p = 0,01), mens patienter med stadie II CRC, foxp3

+ celletæthed var signifikant større hos de patienter der havde fået adjuverende behandling i forhold til dem, der ikke havde (p = 0,04).

diskussion

Cell migration eller invasion gennem basalmembranen og fjern spredning via lymfe- eller vaskulære systemer er iboende egenskaber malign sygdom og har en betydelig indvirkning på resultatet sygdom [3]. Disse vandrende processer kræver den differentielle regulering af klæbemiddel og anti-adhæsive molekyler, og det er blevet foreslået, at SPARC kan spille en central rolle i de indledende processer tumorindtrængen og ECM modulation skyldes dens anti-klæbende egenskaber. Treg celler kan også bidrage til malign sygdom ved at undertrykke lokale anti-tumor immunrespons i tumormikromiljøet [29], [30]. Tilstedeværelsen af ​​høje antal Foxp3-positive T-celler er blevet forbundet med en højere risiko for recidiv og dårlig samlet overlevelse af patienter med solide tumorer [29]. AJCC sygdom mellemstation er baseret på histologiske tegn på infiltration og metastase, det var derfor den hypotese, at SPARC og Foxp3 ekspression kan være forbundet med primær CRC sygdomsstadie og kræft specifik overlevelse.

Denne undersøgelse observeret et højere forhold mellem SPARC at vimentin i CRC’er, uanset sygdommens stadie, end i kontrol væv, hvilket tyder på en rolle for SPARC i kolorektal carcinogenese. Stages II, III og IV CRC alle havde signifikant højere SPARC udtryk end fase I, men der var ingen signifikante forskelle observeret mellem trin II, III eller IV CRC, hvilket indikerer, at selv om SPARC udtryk var højere i de mellemliggende og mest fremskredne stadier af CRC , det ikke altid korrelerer med cancer scene som er tidligere blevet foreslået [6], [18], [31]. Disse undersøgelser, der gennemføres i human gastrisk karcinom [6], CRC [31] bryst [18] og øsofageal cancer [32], identificeret, SPARC var en dårlig prognose markør, og var forbundet med mere aggressive og yderst metastatiske tumorer. Vores resultater imidlertid vist, at højere niveauer af SPARC udtryk i den primære CRC var forbundet med en god sygdom resultat og en bedre langsigtet kræft overlevelse 60 måneder i både fase II og III CRC, og omvendt, at lavere SPARC udtryk var forbundet med en mere avanceret klinisk sygdom stadie.

Vores resultater er i overensstemmelse med den observation, at reducerede SPARC-niveauer i primære CRC xenografter kan øge tumor resistens mod stråling og kemoterapeutiske stoffer [33]. Radiosensitivitet og respons til 5-fluoruracil og irinotecan hos mus xenotransplantater, var imidlertid i stand til at gendannes ved genekspressionen af ​​SPARC, medens overekspression af SPARC i CRC xenotransplantater forbedret tumor følsomhed over for stråling og kemoterapi [33]. Selv før 1994 kemoterapi ikke var rutine, i vores undersøgelse, der indsamles prøver 1990-1996, de fleste patienter med stadium III CRC og højere SPARC udtryk har ikke modtaget kemoterapi. Dette antyder muligheden for, at ikke blot er SPARC stand til at sensibilisere CRC-celler for kemoterapi [33], [34], men højere SPARC ekspression kan være forbundet med andre kliniske træk at klinikeren tænker gør tumoren mindre aggressiv og således ikke kræve supplerende terapi.

SPARC kan være potentielt anti-tumorigen gennem induktionen af ​​en mikromiljø, som er ikke-permissiv til tumorprogression [35]. Chlenski

et al

, viste, at forøget SPARC ekspression i muse-xenotransplantater gennem transficerede celler, resulterede i et fald i glatmuskelactin ekspression, samt forringet xenograft vækst, hæmning af angiogenese og mere tumor stroma sammenlignet med vildtype typen og vektor-kontrol 293 xenografter [35]. Co-dyrkning af SPARC-transficerede celler med vildtype eller vektor-kontrol xenografter resulterede også i færre aktiverede fibroblaster, der var ude af stand til at producere nok ECM til at understøtte tumorvækst. Ved at ændre sammensætningen af ​​tumorstroma gennem inhibering af vaskulære celler, rekruttering af værten fibroblaster og forebyggelse af fibroblast aktivering, blev det foreslået, at SPARC kan spille en rolle i “normalisere” tumor stroma, hvilket fører til en mikromiljø, der ikke støttende