PLoS ONE: En Udsættelse for den oxiderede DNA Forbedrer Begge Ustabilitet af genom og overlevelse i cancerceller

Abstrakt

Baggrund

Cell fri DNA (cfDNA) cirkulerer i hele blodbanen af ​​både raske mennesker og patienter med forskellige sygdomme og virker på cellerne. Reaktion på cfDNA afhænger koncentrationer og niveauer af skaden inden cfDNA. Oxideret ekstracellulært DNA fungerer som en stress-signal og fremkalder en adaptiv respons.

vigtigste resultater

Her viser vi, at oxideret ekstracellulært DNA stimulerer overlevelse MCF-7 tumorceller. Vigtigere, i celler udsat for oxideret DNA, er undertrykkelsen af ​​celledød ledsaget af en stigning i de markører for genom ustabilitet. Kortsigtet eksponering for oxiderede DNA resultater i både single- og dobbeltstrenget DNA pauser. Længere behandlinger fremkalde en kompenserende reaktion, der fører til et fald i niveauet af kromatin fragmenteringer tværs cellepopulationer. Udsættelse for oxideret DNA fører til et fald i aktiviteten af ​​Nrf2 og en stigning i aktiviteten af ​​NF-kB og STAT3. En model, der beskriver den rolle, oxideret DNA frigivet fra apoptotiske celler i tumor biologi foreslås.

Konklusioner /Betydning

Overlevelse af celler med en ustabil genom kan væsentligt forøge progression af malignitet. Yderligere undersøgelser af effekterne af ekstracellulært DNA på maligne og normale celler berettiget

Henvisning:. Kostyuk SV, Konkova MS, Ershova ES, Alekseeva AJ, Smirnova TD, Stukalov SV, et al. (2013) en eksponering til oxideret DNA Forbedrer Begge Ustabilitet af genom og overlevelse i kræftceller. PLoS ONE 8 (10): e77469. doi: 10,1371 /journal.pone.0077469

Redaktør: Roberto Amendola, ENEA, Italien

Modtaget: 25. maj 2013; Accepteret: 3. september 2013; Udgivet: 17 oktober 2013

Copyright: © 2013 Kostyuk et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af RFBR (12-04-32081, 12-04-32074), som kontrakterne nr 14.512.11.0090 og nr 8273 (under indkaldelsen nr 2012-1.1-12-000-2008-067) af Ministeriet for uddannelse og videnskab i Rusland og Jeffress Foundation Grant No. J-1023. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cellefri cirkulerende DNA (cfDNA) fragmenter kan indsamles fra plasma, serum eller andre kropsvæsker både raske mennesker og patienter med forskellige sygdomme. Oftest er virkningerne af cfDNA studeret ved anvendelse

in vitro Salg modeller af ekstracellulært DNA (ecDNA), isoleret fra cellefri supernatanter fra dyrkede celler [1], enten intakte eller udsat for forskellige typer af oxidativt stress.

Oxidativ stress er kendt for at inducere celledød. Døende celler frigiver fragmenter af oxideret DNA i cfDNA pool. cfDNA cirkulerer i hele kroppen og forårsager sekundære systemiske effekter i fjerntliggende organer og væv. cfDNA ekstraheret fra blodplasma af patienter med høje oxidative stress niveauer er kendt for at påvirke den fysiologiske aktivitet af intakte celler [1-6]. I mesenkymale stamceller (MSC’er), både ecDNA opsamlet fra medierne af primære tumorceller kulturer og cfDNA ekstraheret fra plasma af kræftpatienter har påvirket ROS produktion [5]. I fibroblaster, oxideret ecDNA fremkalder en adaptiv reaktion, der manifesterer sig som en stigning i resistensen af ​​behandlede celler for bestråling og kronisk stress midler [7]. Faktisk ecDNA fragmenter tjene som stress signaler for både det adaptive respons og for tilskuer-virkning, der udvikler som reaktion på lav dosis bestråling i mange typer af dyrkede celler [1,8-15].

Forrige

in vitro

undersøgelser profileret de forskellige virkninger af cfDNA /ecDNA i dyrkede primære celler, herunder humane endotheliocytes [2,3], mesenkymale stamceller (MSC) [5,6], lymfocytter [8-10,12] og fibroblaster [7] samt rottecardiomyocytter [4] og neuroner [16]. Men ingen undersøgelser hidtil har beskrevet virkningerne af ecDNA på tumorceller, på trods af den åbenlyse relevans af denne model til behandling af humane maligne lidelser, især på grund af den overflod af offentliggjorte observationer indikerer en stigning i cfDNA koncentrationer i cirkulationen af ​​kræftpatienter [17-25]. Kræftceller adskiller sig fra normale dem ved sine øgede niveauer af ROS; niveauerne af oxidation i tumor-DNA er også højere, at i det normale væv. Faktisk både bestråling og kemoterapi fører til oxidativ død af store antal af tumorceller teoretisk resulterer i en massiv frigivelse af oxideret cfDNA.

I denne undersøgelse beskriver vi virkningerne af stigninger i ecDNA oxidation og ecDNA koncentrationer på forskellige karakteristika af østrogen (ER) og progesteronreceptoren (PR) positiv mammacancer celle MCF-7. Her viser vi, at oxideret ecDNA inducere i disse celler et oxidativt stress, der på den ene side, er ledsaget af en manglende opretholde stabiliteten af ​​genomet, og på den anden side fører til udvikling af adaptive respons der forøger celleoverlevelse . Salg

Resultater

Koncentrationer af ecDNA i medierne betinget af intakte MCF-7 celler i gennemsnit på 140 ± 20 ng /mL. Effekter af gDNA og gDNA

OX blev evalueret efter tilsætning af forskellige koncentrationer af respektive DNA til dyrkning medier. Intakt gDNA blev ekstraheret fra primære humane embryonale fibroblaster (HEFs), mens gDNA

OX prøver blev opnået som følge af behandlingen af ​​gDNA med H

2O

2 som vi beskrev før [15]. Niveauer af 8- oxodG i gDNA var på

~ 0,1 8-oxodG pr en million af 2′- deoxynukleosider, mens disse niveauer i gDNA

OX var på ~ 750 8-oxodG pr en million af 2′- deoxynukleosider [5,7]. For at sikre at gDNA kampe gDNA

OX ved middellængde på dets fragmenter og deres størrelsesfordeling (0,2 til 15 kb), blev gDNA behandlet med forskellige koncentrationer af DNAse I og sammenkoblingen gDNA udvalgt efter elektroforetisk evaluering i agarosegeler. Komparative virkninger af gDNA og gDNA

OX behandlinger blev undersøgt ved slutkoncentrationer på 50 ng /ml eller 5 ng /ml medium, mens eksponeringen varierede fra 30 minutter til 48 timer.

1. Lokalisering af gDNA og gDNA

OX i MCF-7 celler

For at finde ud af de intracellulære placeringer af gDNA og gDNA

OX, blev en række DNA-prober syntetiseret og forskelligt mærket. gDNA

røde og pBR322

grønne sonder blev mærket ved hjælp af nick-translation med SpectrumRed og SpectrumGreen hhv. I MCF-7-celler, gDNA

rød og pBR322

grøn demonstrere lignende granuleret, sammenklumpede farvningsmønstre i periferien af ​​cytoplasmaet, synlig i ca. 70% af cellerne (figur 1А). Mere detaljeret analyse viste, at intracellulær fordeling af mærkede DNA-fragmenter er prøve specifik (fig 1В). I celler behandlet med både gDNA

rød og pBR322

grøn, er nogle områder af cytoplasmaet farvedes med en, men ikke den anden type af mærket DNA. Områder farvet med mere sekvens-forskelligartet gDNA

rød er til stede i større tal og optager en større volumen af ​​cellen. I gDNA

røde farvede celler var der også en diffus farvning nær kernekappen der var synlig ved en højere forstørrelse (x 200). Vores observationer viser, at i det mindste nogle eksogene gDNA fragmenter importeres ind i cellen

A – gDNA

rød, kerner farvet med DAPI (x40).; B – fusionerede farvningsmønstre af gDNA

rød og pBR322

grøn (x200); С – fusioneret farvede mønstre af gDNA

red-ox og FITC-konjugerede antistoffer til 8-oxodG (x200); D – FACS analyse af tidlig endosomale markør EEA1; fordelingen af ​​cellerne med varierende EEA1 indhold.

Slutkoncentrationer af tilsat DNA i medierne var på 50 ng /ml; celler blev inkuberet med DNA i 30 minutter før fiksering i 3% formaldehyd. I tilfælde af farvning med FITC-konjugerede antistoffer til 8-oxodG, fastsat celler forbehandlet med 0,1% Triton Х100 for gennemsivning.

For at bestemme de intracellulære steder for gDNA

OX, en sammensat sonde blev produceret ved langsom renaturering af nick-translation mærket gDNA

rød og gDNA

OX (gDNA

rød-OX). Svarende til gDNA

rød, var dette komposit mærkede probe også placeret ved periferien af ​​cytoplasmaet (figur 1С), men i tilfælde af den sammensatte probe gDNA

rød-OX, en væsentlig del af de mærkede fragmenter var findes inde i cytoplasmaet nær kernen. For at bekræfte, at denne diffuse farvning svarede til oxideret DNA farvede vi cellerne med FITC-konjugerede antistoffer til 8-oxodG (figur 1C). Vores data viser, at gDNA

OX importeres ind i cellen ved en væsentlig større grad end gDNA. Efter indtastning i cellen, gDNA

OX lokaliserer i cytoplasmaet, danner foci omkring kernen.

Endocytose er en af ​​de almindelige måder at levering af eksogene stoffer ind i cellen. Dannelsen af ​​nye endosomer er ledsaget af en stigning i ekspression af tidlige endosom antigen 1-protein (EEA1), kendt som en tidlig endosomal biomarkør [26]. Anvendelse af FACS, demonstrerede vi, at eksponering for DNA

OX fører til en stigning af andelen af ​​celler, der udtrykker høje niveauer af EEA1 (figur 1D). Disse observationer er i samspil med visuelle mønstre af intracellulær farvning for gDNA

OX.

Det er kendt, at intracellulære sensorer er i stand til at binde til DNA-fragmenter, enten inde i cytoplasmaet (AIM2, RIG1, STING) [27 ] eller inden endosomerne (TLR9) [28]. Interessant, 2-timers udsættelse for gDNA

OX stimulerer ekspressionen af ​​mRNA’er, der koder AIM2, TLR9 og RIG1 (tabel 1). To DNA-sensorer, AIM2 og TLR9, blev undersøgt i større detaljer (Figur 2).

Symbol gen

gDNA, 50 ng /mL

gDNA

OX, 50 ng /ml

2h

48h

2h

48h

Cell Cycle Checkpoint og cellecyklusstop:

CDKN2A (p16INK4)

1,8 ± 0.53.3 ± 0,3 * 1,6 ± 0,1 * 2,5 ± 0,3 *

CDKN1A (p21CIP1 /WAF1)

1,3 ± 0.32.9 ± 0,2 * 1,1 ± 0.22.2 ± 0,2 *

TP53

0,8 ± 0.41.6 ± 0,2 * 2,6 ± 0,3 * 2,1 ± 0,2 * antiapoptotiske

BCL2

1,2 ± 0.22.5 ± 0,3 * 3,3 ± 0,3 * 3,2 ± 0,2 *

BCL2A1 (Bfl-1 /A1)

1,3 ± 0.32.0 ± 0,3 * 5,0 ± 0,3 * 1,8 ± 0,3 *

BCL2L1 (BCL-X)

1,0 ± 0.21.9 ± 0,3 * 1,2 ± 0.31.6 ± 0,3 *

BIRC3 (c-IAP1)

0,7 ± 0,33. 5 ± 0,4 * 1,8 ± 0,2 * 2,6 ± 0,4 * Dobbelt Strand Break DNA Repair

BRCA1

1,0 ± 0.11.0 ± 0.16.4 ± 0,6 * 2,1 ± 0,5 * Cytoplasmisk DNA-receptorer:

AIM2

1,2 ± 0.21.3 ± 0.12.2 ± 0,2 * 2,5 ± 0,4 *

RIG1

1,5 ± 0.21.3 ± 0.22.4 ± 0,2 * 1,4 ± 0,3

STING

1,3 ± 0,21. 4 ± 0.21.0 ± 0.21.3 ± 0,3

TLR9

1,6 ± 0,2 * 1,3 ± 0.23.0 ± 0,3 * 1,2 ± 0.2Nrf2-Keap1 Pathway:

Nrf2 (NFE2L2)

1,4 ± 0,1 * 1,1 ± 0.12.3 ± 0,1 * 1,2 ± 0,2

KEAP1

0,9 ± 0.11.1 ± 0.13.6 ± 0,2 * 1,0 ± 0.1NFκB Pathway:

MAP4K4

1,1 ± 0.21.5 ± 0.22.0 ± 0,1 * 1,1 ± 0,3

MyD88

1,0 ± 0.22.0 ± 0,2 * 3,6 ± 0,2 * 1,4 ± 0,2

NFKB1

1,6 ± 0,2 * 0,9 ± 0.21.8 ± 0,2 * 1,5 ± 0,4

TIRAP

1,0 ± 0.22.2 ± 0,2 * 2,7 ± 0,3 * 1,3 ± 0.3STAT Familie:

STAT3

1,2 ± 0.21.8 ± 0,1 * 3,0 ± 0,3 * 1,0 ± 0.2

STAT6

1,2 ± 0.21.8 ± 0,3 * 1,6 ± 0,3 * 1,1 ± 0.3MAPK og JNK /p38 Pathway:

FOS

1,3 ± 0.21.4 ± 0.31.4 ± 0.21.3 ± 0,3

juni

1,6 ± 0,3 * 1,6 ± 0,2 * 2,3 ± 0,3 * 1,9 ± 0,4 *

MAPK8 (JNK1)

0,8 ± 0.21.8 ± 0,2 * 1,3 ± 0.21.3 ± 0,2 cytokiner

IL10

0,8 ± 0.25.3 ± 0,5 * 1,8 ± 0,2 * 4,2 ± 0,4 *

IL6

0,8 ± 0.31.8 ± 0,2 * 2,6 ± 0,3 * 1,9 ± 0,2 *

IL8

1,7 ± 0,2 * 1,1 ± 0.23.2 ± 0,2 * 1,4 ± 0,4

TNFa

1,8 ± 0,2 * 2,2 ± 0,2 * 3,6 ± 0,2 * 2,3 ± 0,3 * Cell Adhesion og Cell Migration molekyler:

ICAM1

0,9 ± 0.21.3 ± 0.22.6 ± 0,3 * 1,6 ± 0,4

PECAM1

1,3 ± 0.21.4 ± 0.21.7 ± 0,2 * 1,2 ± 0,2

SELE

1,0 ± 0.11.1 ± 0.22.1 ± 0,3 * 1,0 ± 0,2

SELP

3,7 ± 0,3 * 1,5 ± 0,2 * 1,3 ± 0.21.6 ± 0,3 *

VCAM1

1,5 ± 0.31.9 ± 0,2 * 3,2 ± 0,3 * 1,3 ± 0,2

RhoA

1,3 ± 0.21.2 ± 0.21.6 ± 0,2 * 1,1 ± 0.1Growth Faktorer:

BMP-2

1,6 ± 0,2 * 1,7 ± 0,2 * 3,0 ± 0,3 * 2,4 ± 0,2 *

BMP4

1,2 ± 0.21.9 ± 0,3 * 2,6 ± 0,4 * 1,4 ± 0,4

VEGFA

1,3 ± 0.21.8 ± 0,4 * 0,7 ± 0.31.4 ± 0.3Pluripotent stamceller gener:

NANOG

1,2 ± 0.31.4 ± 0,1 * 1,2 ± 0.21.0 ± 0,2

OCT4

1,2 ± 0.21.5 ± 0,2 * 2,5 ± 0,2 * 1.7 ± 0.1 *

GATA-4

1.1 ± 0.21.5 ± 0.2 * 1.4 ± 0.31.3 ± 0.3Table 1. ændringerne i ekspressionsniveauer af udvalgte mRNA’er efter eksponering af MCF-7-celler til enten gDNA eller gDNA

OX.

relative niveauer af ekspression er gennemsnit for tre biologiske gentagelser og en standardafvigelse. (*) P 0.05 – mod kontrol celler, ikke-parametrisk

U

-test (Mann-Whitney U-test) CSV Hent CSV

A – intracellulær lokalisering af AIM2 (FITC-konjugerede antistoffer) og mærket probe gDNA

rød-ox (x40). B – forholdet mellem niveauerne af aim1 [1] og TLR9 [2] – kodende RNA’er til niveauer TBP-kodende henvisning mRNA i celler udsat for gDNA eller gDNA

OX i 2 timer (grå søjler) og 48 timer ( sorte søjler)

C og D -. Flowcytometri påvisning af AIM2 (C) og TLR9 (D) ekspression i MCF-7. Celler blev farvet med AIM2 (C) eller TLR9 (D) antistof (sekundære PE-konjugerede antistoffer). Paneler D [1] og E [1] – kontrol celler parceller: FL2 versus SSC. R: gated område. Paneler C [2] og D [2]: median signal intensitet FL2 (R) i MCF-7-celler (middelværdi for tre uafhængige forsøg). Paneler C [3] og D [3]: relative proportioner af AIM2- eller TLR9-positive celler i R porte [1]. Baggrund fluorescens blev kvantificeret ved anvendelse af PE-konjugerede sekundære antistoffer.

* p 0.05 imod kontrolgruppe af celler, ikke-parametrisk U-test.

AIM2.

I ikke-sammenflydende MCF-7 celler, niveauerne af

AIM2

mRNA (figur 2B [1]) og proteinekspression (figur 2C) er lave. I kontrolceller, protein niveauer af AIM2 korrelerer med graden af ​​konfluens. I ikke-sammenflydende kulturer, er AIM2 udtrykt i ca. 25% af cellerne (figur 2C [1,3]). I konfluerende kulturer, andelen af ​​celler med AIM2 øger 2-fold (figur 2C [1,3]). Disse stigninger parallelt med stigninger i AIM2 proteinniveauer per celle (Figur 2C [2]), mens niveauerne af AIM2 koder mRNA’er forblive omtrent det samme (figur 2B [1]). Disse observationer kan forklares ved fremherskende regulering af AIM2 aktivitet på niveau med oversættelsen eller dets stabilitet snarere end på niveauet for transskription og afventer yderligere undersøgelser.

Flettede farvede mønstre for FITC-konjugerede anti-AIM2 antistoffer og mærket probe gDNA

rød-ox er vist i figur 2A. Mange farvede områder, ja, overlap, hvilket muligvis indikerer en interaktion mellem gDNA

OX med AIM2 sensorer. I dyrkede MCF-7 celler udsat for oxideret DNA, er niveauerne af både AIM2 protein og dets mRNA forhøjet (figurerne 2B [1] og 2C). I AIM2-positive population af celler, en eksponering for enten oxideret DNA eller genom-DNA i 48 timer fører til fald i niveauerne af AIM2 protein per celle (Figur 2С [2]).

TLR9.

I ikke-sammenflydende MCF-7 celler, niveauerne af TLR9 er lave, med ca. 20% af cellerne farvet (figur 2B [2], D) efter aftale med tidligere undersøgelser [28]. I sammenflydende MCF-7-kulturer, er andelen af ​​celler, der udtrykker TLR9 protein forøger til ca. 40% (figur 2D) [3] sammen med intensiteten af ​​TLR9 farvning af individuelle celler (figur 2D [2]). I lighed med niveauerne af AIM2 kodninger mRNA’er, niveauerne af TLR9 kodninger mRNA’er forbliver uændret (figur 2B [2]). Efter 2 timers eksponering for oxideret DNA, niveauerne af TLR9 kodning mRNA stigning, mens mængden af ​​TLR9 protein i de enkelte celler ændres ikke.

Forlænget eksponering af MCF-7 til oxideret DNA fører til et fald i intensiteten af ​​farvningen af ​​individuelle celler med anti-TLR9 antistoffer (figur 2D [2]). Tidligere lignende type responset gDNA og gDNA

OX blev observeret i dyrkede humane fibroblaster [7]. Alt sammen, vores data viser, at langvarig udsættelse for enten gDNA eller gDNA

OX fører til fald i de cellulære niveauer af DNA-sensorer AIM2 og TLR9 og eventuelt til delvis desensibilisering af disse celler til virkningerne af ekstracellulært DNA.

2. Udsættelse for gDNA

OX inducerer kortvarig oxidativt stress

For at undersøge mulig indflydelse af gDNA og gDNA

OX på de intracellulære niveauer af reaktive ilt arter (ROS), blev den ROS målt ved hjælp dichlorodihydrofluorescindiacetate ( H2DCFH-DA) farvestof, der hurtigt penetrerer cellemembraner og bliver fanget i cytosolen i sin deacetylerede formular. Ikke-fluorescerende DCFH omdanner til fluorescerende DCF af en række ROS radikaler og derfor tjener som en følsom intracellulær markør for oxidativ stress [29]. Figur 3A viser resultaterne af ROS-niveauer analyse i levende celler. I ubehandlede kontrolceller, DCF farvestof diffust associerer med overfladen af ​​cellen, og kan fjernes fra membranen ved PBS vask. De fleste almindelige kilder til ROS ved cellemembranen er enzymer af NOX familie [30]. I celler behandlet med gDNA (50 ng /ml), H2DCFH-DA plet visualiserer både membranen og en vis mængde af intracellulære granulater. PBS vask ikke påvirker cytoplasmatisk granula farvning. Mønstre af DCF-granulater og mærket gDNA

røde probe pletter ca. overlap (figur 3C), hvilket muligvis indikerer, at en vekselvirkning af gDNA med nogle cellulære bestanddele stimulerer ROS biosyntese på det sted for kontakt. Denne observation flugter godt med tidligere udtalt hypotese, at ecDNA eller anden måde direkte kan stimulere enzymatiske aktivitet af NOX-proteiner [5]

А -. Mikroskopi-baseret evaluering af MCF-7-celler sekventielt behandlet med DNA (50 ng /ml) og H2DCFH-DA (kontrol, gDNA, gDNA

ox [1]) og inkuberet i 30 minutter (x100). Alternativt blev MCF-7-celler inkuberet med DNA (50 ng /ml) i 1 time efterfulgt af tilsætning af H2DCFH-DA og fotografering 30 minutter senere (gDNA

ox [2]). B – MCF-7 celler udsat for gDNA

ox (0,5 time; 50 ng /ml), blev sekventielt behandlet med Mito-tracker TMRM (15 min) og H2DCFH-DA (15 min) (x200). C – Co-detektering af mærket probe gDNA

rød (50 ng /ml) og DCF efter 30 minutters inkubation. D – Resultaterne af kvantificering af fluorescens under anvendelse pladelæser [1]. De tidsmæssige kinetik fluorescens udgange i celler sekventielt behandlet med H2DCFH-DA og tre minutter senere, en DNA-prøve i en slutkoncentration på 5 eller 50 ng /ml [2]. Det samme for celler forbehandlet med DNA (slutkoncentration 5 ng /ml) i en time, med efterfølgende tilsætning af H2DCFH-DA. *) P 0,05 mod kontrolgruppe af celler, ikke-parametrisk U-test.

I celler behandlet med gDNA

OX (50 ng /ml), opstår intracellulære ROS-producerende granuler hurtigt, og deres antal er væsentligt større end i celler behandlet med gDNA (figur 3A, indpresningsdybde gDNA

OX [1]). Disse begivenheder er ledsaget af ændringer i morfologien af ​​MCF-7-celler, herunder en stigning i størrelsen af ​​kerner og cytoplasmatiske swell. Det er vigtigt at bemærke, at observerede cellulære reaktioner er hurtig og kort-levende. Beskrevet ændringer i farvede mønstre og cellemorfologi ses kun i tilfælde af sekventielle tilsætninger af H2DCFH-DA og gDNA

OX til MCF-7-medier. Når celler blev forbehandlet med gDNA

OX i 1 time, og derefter undersøgt ved hjælp а H2DCFH-DA farvestof, de numeriske ROS-syntetiserer granulat ses i celler var lavere og deres intensitet var mindre lyse end i tilfælde af no-forbehandling protokol (Figur 3А indsatte gDNA

OX [2]). Endnu mere interessant, i forbehandling protokol, nogle celler standsede ROS biosyntese overhovedet, og blev endnu mindre lyse derefter ikke-behandlede kontrolceller (mørkere celler, som er mindre fluorescerende end baggrunden (fig 3А indsatte gDNA

OX (B )).

De observerede fænomener blev uafhængigt bekræftet i en undersøgelse af DCF generation kinetik hjælp kvantificering med en fluorescerende læser (figur 3D). Når MCF-7 celler blev behandlet med DNA umiddelbart efter tilsætning af H2DCFH-DA til medierne, en dramatisk stigning i intensiteten af ​​DCF fluorescens blev observeret. Disse stigninger var på højeste stigningstakter under første 20 minutter efter tilsætning af DNA til medierne (koefficienten k1), derefter, med tiden, disse satser dråbe ( koefficient k2) (Figur 3D [1], tabel indsat) K1 og k2 koefficienter var afhængige af type og koncentrationer af DNA behandling:. gDNA

OX (5 ng /ml) gDNA (5 ng /ml) gDNA

OX (50 ng /mL) ≥ gDNA (50 ng /ml) . kontrol Disse virkninger blev ikke set, når celler blev forbehandlet med DNA i 1 time inden tilsætning af H2DCFH-dA (figur 3D [2]).

samlet set resultaterne af disse forsøg viser, at behandling med gDNA

OX hurtigt inducerer ROS biosyntese i MCF-7-celler. Parallelt hermed den modsatte proces af undertrykkelsen af ​​ROS generation eller ROS quenching, påbegyndes. Som større mængderne af gDNA

OX blev sat til medierne, hurtigere var udviklingen af ​​ROS quenching.

En størstedelen af ​​intracellulære ROS genereres af mitokondrier. En stigning i oxidativ metabolisme i mitokondrierne kan føre til udbredelsen af ​​ROS i cytoplasmaet og efterfølgende stigning i perimitochondrial detektion af ROS af DCF. For at teste denne hypotese, vi sekventielt farves cellerne eksponeret for 50 ng /ml gDNA

OX i 30 minutter med Mito-tracker (TMRM rød) og DCF (figur 3B). Et flertal af Mito-tracker og DCF signal blev placeret tæt på hinanden, med delvist overlapper (gul signal, figur 3B). I intakte celler, er H2DCFH-DA ikke pletter mitokondrier (figur 3А, kontrol). Vores observationer peger, at i de celler udsat for oxideret DNA, er et flertal af endogen ROS genereret af mitokondrier.

3. Eksponering togDNA

OX stimulerer en stigning i niveauet af oxidativ modifikation af cellens eget DNA

Det er sandsynligt, at intensiv produktion af ROS observeret umiddelbart efter eksponering af celler for gDNA

OX kan resultere i skader på cellulært DNA. At visualisere denne skade, er fastsat MCF-7-celler farvet med PE-mærket anti-8-oxodG antistoffer (figur 4). Sammenlignet med ikke-behandlede kontrolceller, i MCF-7 kulturer behandlet med enten gDNA eller gDNA

OX, blev mængderne af farvede celler forøget (figur 4A (x20). Ved større forstørrelser, tre typer farvningsmønstre kan være påvist (figur 4B):. (1) – nuklear farvning, (2) – cytoplasmatisk farvning, (3) – farvning for mikrokerner Hos ikke-behandlede kontrolgrupper populationer af MCF-7-celler, PE-mærket anti-8-oxodG antistoffer overvejende pletten mikrokerner. i populationer behandlet med gDNA

OX, var der en stigning i mængden af ​​celler med nukleare farvning (Figur 4E). som vores tidligere forsøg viste, at gDNA

rød-OX ligger i cytoplasmaet og ikke trænge ind i kernen, skal observeres farvning af kerner tilskrives tab af cellens eget DNA Salg

A -. celler farvet med PE-mærket anti-8-oxodG antistoffer og DAPI (x20) B -. Tre typer af anti-8-oxodG plet fordeling observeret i celler behandlet med gDNA

OX (x100). Cell blev inkuberet med DNA-prøver i 1 time, fikseret med 3% formaldehyd, gennemtrængt med 0,1% triton X100 og farvet med anti -8-oxodG (PE-konjugeret sekundære antistoffer). C – colokalisering 8-oxodG med mitokondrier. Celler blev inkuberet med gDNA

OX i 0,5 time, обработаны Mito-tracker (30 nM, 15 min), fotograferet og derefter fikseret med 3% formaldehyd, gennemtrængt med 0,1% triton X100, farvet med anti-8-oxodG antistoffer (FITC-konjugerede sekundære antistoffer) og fotograferet igen. D – 8-oxodG indhold i DNA eksponerede celler forbehandlet med NAC (FACS-analyse). Celler blev inkuberet med NAC (0,15 mM) i 30 min, derefter udsat for gDNA

OX i 1 time og analyseret ved anvendelse af anti-8-oxodG antistoffer (PE-konjugerede sekundære antistoffer). Baggrund fluorescens blev kvantificeret ved anvendelse af PE-konjugerede sekundære antistoffer. E – relative andele af kerner farvet for 8-oxodG i ikke-behandlede kontrolceller, celler udsat for gDNA, celler udsat for gDNA

OX (grå søjler). Lys grå kolonne afspejler celler præ-behandlet med NAC og udsat for gDNA

OX. * P 0.05 imod kontrolgruppe af celler, ikke-parametrisk U-test.

En stigning af mitokondrie biosyntese af ROS i gDNA

OX eksponerede celler påvist ovenfor (figur 3В) kan føre til en stigning i niveauet af oxidation i mitokondrie-DNA, som på sin side kan forklare observerede cytoplasmatisk farvning for gDNA

rød-OX vist ved figur 1C. På figur 4C, kan man se, at nogle 8-oxodG signalerne ikke fusionere med gDNA

rød-OX. I celler forbehandlet med antioxidant N-acetyl-cystein (NAC) (0,15 mM) i 30 minutter før udsættelse for gDNA

OX, niveauerne af oxidation i cellulært DNA, var væsentligt lavere end i celler ikke behandlet med NAC (figur 4D og 4E).

4. Udsættelse for gDNA

OX stimulerer en stigning i strengbrud i celle ‘egen DNA

En af velkendte træk ved DNA oxidation er en ophobning af enkelt- og dobbeltstrenget DNA pauser (SSB’er og DSB’er). For at kvantificere SSB’er og DSB’er i MCF-7 celler udsat for enten gDNA eller gDNA

OX anvendte vi komet elektroforese i alkaliske betingelser (Figur 5А). Tre typer kerner blev optalt: kerner med intakt DNA (fig 5А [1], type I); kerner med en vis grad af kromatin fragmentering (type II); kerner med væsentlig fragmentering af DNA (type III). I de fleste tilfælde er kernerne af ikke-behandlet kontrol klassificeret som enten type I eller type II, mens type III kerner ses overvejende celler behandlet med gDNA

OX. Afhængigt af hvor lang cellerne blev udsat for gDNA

OX, andelene af type III kerner kan være forskellige. Figur 5A præsenterer også de komet hale øjeblikke [2] og% tail DNA [3]. Efter 30 minutters inkubation af MCF-7 celler med gDNA

OX, bryder mængder DNA drastisk stige, mens lignende behandling med gDNA fører til moderat stigning af kromatin fragmentering niveauer. Efter 2 timers inkubering enten med gDNA eller gDNA

OX, de mængder DNA bryder falde, og antallet falder til under denne findes i respektive gate-specifikke populationer i ikke-behandlede kontrolceller.

А – comet assay i alkaliske betingelser [1]. – Digital fotografering af kernerne med varierende grad af DNA-beskadigelse [2,3]; – Kumulative histogrammer for hale øjeblik og procentdelen af ​​DNA inden haler. Pålideligheden af ​​forskelle med kontrollen i de opnåede distributioner blev analyseret ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov statistik (tabellen viser værdien af ​​D og α)

B -. DsDNA pauser i celler udsat for gDNA

OX (50 ng /ml, 1 time) .Cells blev forarbejdet til immunfluorescensfarvning med anti γH2AX antistof (x40) [1] .- Tre detekterede typer kerner er angivet med numre: 1- kerne med flere dsDNA pauser, 2- kerne med et par dsDNA pauser, 3 kerne med intakt DNA [2]. – Eksempel på en mikronucleustest med dsDNA pauser

С – FACS analyse af γ-foci A:. Der vigtigste fraktioner af cellerne som er tydelige i gating områder R1, R2, R3 [1], fordelingen af ​​γH2AX fluorescens intensiteter [2], relative andele af celler i gating områderne R1-R3 [3]. * P 0,05 mod kontrolgruppe af celler, ikke-parametrisk U-test.

Observationer beskrevet ovenfor blev uafhængigt bekræftet ved anvendelse anden almindelig teknik til visualisering af DSBs, en immunfarvning med antistoffer mod histon γH2AX, phosphoryleret med serin -139. Denne form for H2AX er kendt for hurtigt at akkumuleres ved DNA loci flankerende DSB site [31]. MCF-7-celler farvet med FITC-konjugerede antistoffer til Ser-139 phosphoryleret histon γН2АХ er vist på figur 5B [1]. Farvede objektglas omfattede også tre forskellige cellepopulationer γН2АХ positive celler. I dette eksperiment blev celler klassificeres som type 1-celler, når de havde flere phospho-γН2АХ foci. De fleste af de γН2АХ positive celler blev klassificeret som type 2-celler (mellem 2 og 10 særskilte γН2АХ foci per celle), og Type 3 celler med ingen tegn på omdrejningspunktet fos- γН2АХ farvning.

I anti-γН2АХ farvning samlet fluorescensintensitet af cellen er proportional med antallet af γН2АХ foci per celle, og dermed til mængden af ​​DSB’er. Anvendelse af FACS, tre gated områder, R1 til R3, blev undersøgt (figur 5C [1,2]). Celler indenfor gate R1 har største FL1 (γH2AX); Dette fortolkes som flere DSBs (type 1 celler, Figur 5B). Gate R2 indeholder celler med ikke talrige γH2AX (Type 2-celler). Gate R3 indeholder det største antal celler; de fleste af disse celler er intakte uden DSBs (type 3 celler). I MCF-7-kulturer, en eksponering for gDNA

OX (1h) fører til en 1,5-folds stigning i antallet af celler inden gate R1, der modsvares af et fald i antallet af celler inden R2. Efter 24 timers eksponering for gDNA

OX, mængderne af celler med multiple DSBs falde til niveauerne nedenfor, at i ikke-behandlede kontrolceller (figur 5C [3]). En behandling med gDNA fremkalder lignende, men mindre udtalt type cellulær reaktion som i sin størrelsesorden ikke når signifikans sammenlignet med ikke-behandlede kontrolceller (p 0,05).

Disse observationer viser, at, i MCF-7 celler, kortvarig udsættelse for gDNA

OX resultater i både single- og dobbeltstrenget DNA pauser. Længere varigheder af behandlingen (mellem 2 og 24 h) fremkalde en form for kompenserende reaktion, der fører til et fald i niveauerne af chromatin fragmenteringer tværs cellepopulationer.

fald i andelen af ​​DSB-holdige celler efter kortvarig eksponering for oxideret eller kontrol-DNA kan forklares enten ved reparation af pauserne, eller ved apoptose /frigørelse af beskadigede celler eller begge. At evaluere disse muligheder, vi opregnede celler, der forbliver i medierne efter det er fjernet fra cellelag og cellerne fjernes fra laget efter PBS vask. I kulturer udsat for oxideret DNA i 2 timer, andelen af ​​løsrevne celler forblev svarende til den i kulturer udsat for genomisk DNA og ubehandlede kontrolkulturer (ca. 2% af den samlede mængde af celler i given kultur). Lignende resultater blev opnået i nogle eksperimenter med henblik på direkte evaluering af apoptose (se nedenfor). Det er derfor sandsynligt, at faldet i andelen af ​​celler med DSBs observeret efter eksponering for gDNA eller gDNA

OX skyldes en stigning i DNA-reparation.

5. Udsættelse for gDNA

OX fører til en stigning i genom ustabilitet

enkelt- og dobbeltstrenget DNA pauser er kendt for at medføre tab af kromosom stabilitet, som er særligt fremtrædende i aktivt prolifererende celler [32]. En grundig undersøgelse af kernerne i celler inkuberet med gDNA

OX afslørede udtalt kromosom ustabilitet (figur 6).

A.