PLoS ONE: IL-24 inhiberer Lung Cancer Cell Migration og Invasion ved at forstyrre SDF-1 /CXCR4 Signaling Axis

Abstrakt

Baggrund

stromacelle afledt faktor (SDF) -1 /kemokinreceptor (CXCR) -4 signalvejen spiller en central rolle i lungekræft metastase og er molekylært mål for terapi. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om interleukin (IL) -24 kan inhibere SDF-1 /CXCR4 akse og undertrykke lungecancer cellemigration og invasion

in vitro

. Endvidere blev virkningen af ​​IL-24 i kombination med CXCR4-antagonister undersøgt.

Metoder

Humant H1299, A549, H460 og HCC827 lungekræft cellelinier blev anvendt i den foreliggende undersøgelse. Den H1299 lungekræft cellelinien blev stabilt transficeret med doxycyclin-inducerbare plasmid ekspressionsvektor, som bærer den humane IL-24-cDNA og anvendes i den foreliggende undersøgelse at bestemme de inhibitoriske virkninger af IL-24 på SDF-1 /CXCR4 akse. H1299 og A549-cellelinier blev anvendt i transiente transfektionsundersøgelser. De inhibitoriske virkninger af IL-24 på SDF1 /CXCR4 og dens downstream mål blev analyseret ved kvantitativ RT-PCR, Western blot, luciferase reporter assay, flowcytometri og immuncytokemi. Funktionelle undersøgelser omfattede celle migration og invasion assays.

vigtigste resultater

Endogen CXCR4 proteinekspressionsniveauer varierede blandt de fire humane lunge kræft cellelinier. Doxycyclin-induceret IL-24-ekspression i H1299-IL24 cellelinie resulterede i reduceret CXCR4 mRNA og proteinekspression. IL-24 post-transkriptionelt reguleret CXCR4 mRNA-ekspression ved at nedsætte halveringstiden af ​​CXCR4 mRNA ( 40%). Funktionelle undersøgelser viste IL-24 hæmmede tumor celle migration og invasion samtidig med reduktion i CXCR4 og dens downstream mål (Pakt

S473, pmTOR

S2448, pPRAS40

T246 og HIF-1a). Derudover IL-24 inhiberede tumorcellemigration både i nærvær og fravær af CXCR4 agonist, SDF-1. Endelig IL-24, når det kombineres med CXCR4 hæmmere (AMD3100, SJA5) eller med CXCR4 siRNA vist bedre hæmmende aktivitet på tumor celle migration.

Konklusioner

IL-24 afbryder SDF-1 /CXCR4 signalvejen og hæmmer lunge tumor celle migration og invasion. Derudover IL-24, når det kombineres med CXCR4-hæmmere udviste forøget anti-metastatisk aktivitet og er en attraktiv terapeutisk strategi til lunge metastase

Henvisning:. Panneerselvam J, Jin J, Shanker M, Lauderdale J, Bates J, Wang Q, et al. (2015) IL-24 inhiberer Lung Cancer Cell Migration og Invasion ved at forstyrre SDF-1 /CXCR4 Signaling akse. PLoS ONE 10 (3): e0122439. doi: 10,1371 /journal.pone.0122439

Academic Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: December 2, 2014 Accepteret: 11 februar 2015; Udgivet: 16 Mar 2015

Copyright: © 2015 Panneerselvam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte informationsfiler

Finansiering:. undersøgelsen blev delvist understøttet af midler modtaget fra Jim og Christy Everest Begavet Stol i Cancer Developmental Therapeutics (RR); frø bevilling fra Experimental Therapeutics Program (TJH, RR). Forfatterne takker Stephenson Cancer Center ved University of Oklahoma, Oklahoma City, OK og en Institutional Development Award (IDEA) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tilskud nummer P20 GM103639 for brug af Cancer Funktionel genomisk Core, hvilket billede real-time PCR service. Assistance modtaget fra molekylær billeddannelse core facilitet til udførelse flowcytometriske undersøgelser er værdsat. RR er en Oklahoma TSET Research Scholar og holder Jim og Christy Everest Begavet Stol i Cancer Developmental Therapeutics. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Effektiv behandling for lungekræft er stadig en udfordring med en samlet 5-års overlevelsesraten for patienter diagnosticeret med lungekræft er mindre end 16% [1, 2]. En væsentlig grund til den dystre overlevelsesraten for lungekræftpatienter er metastaser [3]. Således vil en effektiv kontrol af lungekræft metastase reducere forekomsten af ​​mortalitet og øge patienternes overlevelse.

signalering mellem kemokinreceptoren CXCR4 og dens ligand SDF-1, også kendt som kemokinligand (CXCL) -12, bidrager til tumorvækst, angiogenese, invasion og metastaser i flere faste tumorer, herunder ikke-småcellet lungecancer [4]. Samspillet mellem SDF-1 og CXCR4 dirigerer tumorceller til fjerne organsteder gennem kemotaksi og målsøgning af metastatiske celler [5]. Høj celleoverfladeekspression af CXCR4 er blevet forbundet med metastatisk aktivitet af tumorceller [6, 7]. Inhibering SDF-1 /CXCR4 akse med et neutraliserende antistof eller transfektion med et antisense-oligonukleotid mod CXCR4 væsentligt reduceret invasion, migration og adhæsion af lungekræft cellelinier

in vitro

[7]. Endvidere blokerer CXCR4 svækket aggressivitet metastase i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [4, 8]. I overensstemmelse med den prækliniske undersøgelsens resultater, har kliniske studier vist høj CXCR4 udtryk i NSCLC tumorer er forbundet med metastase og en øget risiko for tilbagefald [9-12]. Molekylære undersøgelser har vist, at SDF-1 /CXCR4 akse fremmer tumorcelleoverlevelse, cellevandring og metastase ved modulering talrige signalveje [13, 14]. Derfor målrette SDF-1 /CXCR4 aksen har fået betydelig opmærksomhed til hæmning af tumormetastase.

I øjeblikket AMD3100 (plerixafor, Mozobil) er en FDA godkendt CXCR4 antagonist, der bliver testet som en kræft terapeutisk [13]. Selv AMD3100 har vist effekt mod solide tumorer i prækliniske studier har resultaterne fra kliniske undersøgelser ikke været opmuntrende [13, 15, 16]. Således er test for yderligere CXCR4-hæmmere, der effektivt kan forstyrre SDF-1 /CXCR4 signalvejen berettiget.

Den menneskelige melanom differentiering associeret gen (

mda

) -7 /

IL -24

er en unik cytokin /tumorsuppressorgen, der hører til IL-10 cytokinfamilien [17]. Endogen IL-24-protein-ekspression kan påvises i de mononukleære blodceller (PBMC’er) perifere, T- og B-celler og i melanocytter [18-20]. Imidlertid er IL-24-protein-ekspression tabt i de fleste cancerceller af menneskelig oprindelse [17]. Undersøgelser foretaget af ELLERHORST et al., [21] og Ishikawa et al., [22] viste, at tab af IL-24-ekspression korrelerede med sygdomsudvikling i melanom og lungekræft henholdsvis indikerer en tumor undertrykkende rolle for IL-24. Prækliniske undersøgelser viste, at eksogen ekspression af human IL-24 i et bredt spektrum af menneskelige kræftceller resulterede i potent anti-tumor og anti-metastatisk aktivitet både

in vitro

in vivo

[23-25]. Endvidere blev nytten af ​​IL-24 som et anti-cancer stof påvist i en klinisk fase I undersøgelse med adenovirus-

MDA-7

(INGN-241) -baseret kræft genterapi tilgang [26]. Mens MDA-7 /IL-24 udvikles som en cancer terapeutisk, de molekylære mekanismer, som det udøver det anti-tumor og anti-metastatiske aktiviteter er ikke helt forstået.

I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgte evnen af ​​IL-24 til at inhibere SDF-1 /CXCR4-signalvejen. Rationalet for at teste IL-24-inhiberende aktivitet på SDF-1 /CXCR4 akse og dens konsekvens på cellemigration og invasion stammer fra vores seneste observation viser, at IL-24 inhiberede AKT /mTOR pathway [27]. Da AKT /mTOR er nedstrøms for CXCR4 og er involveret i SDF-1 /CXCR4-signalvejen, vi hypotese, at IL-24 regulerer cellemigrering og invasion ved at forstyrre SDF-1 /CXCR4 akse i NSCLC. Desuden har vi den hypotese, at IL-24, når det kombineres med CXCR4 antagonister (AMD3100, SJA5) ville udvise forøget anti-metastatisk aktivitet.

Vi viser, at (i) IL-24 inhiberer lungetumor cellemigration og invasion ved at forstyrre SDF-1 /CXCR4-signalvejen og (ii) IL-24, når det kombineres med CXCR4 antagonister eller siRNA, udstillinger forbedrede anti-metastatisk aktivitet. Således kombinerer IL-24 med CXCR4-hæmmere er en attraktiv terapeutisk strategi til styring lungekræft metastase.

Metoder Salg

Cellekultur

Humant ikke-småcellet lungekræft celle ( NSCLC) linjer blev opretholdt som tidligere beskrevet [25, 28].

Stabil transfektion af inducerbar IL-24 plasmidvektor i H1299 celler

human IL-24 cDNA tidligere klonet i pLJ143 plasmidskelet var frigivet fra et pLJ143 plasmid ved restriktionsenzym fordøjelse og blev reklonet i ptet-ON plasmidvektor (Clonetech, Mountain View, CA, USA). Kloning af IL-24-cDNA på et passende restriktionsenzymsted af pTet-ON plasmid blev bekræftet ved hjælp af restriktionsenzymfordøjelse og DNA-sekventering. Det resulterende plasmid mærket som pTet-IL-24 blev derefter opformeret i E. coli (DH5a-stamme) og oprenset under anvendelse af Qiagen Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) ifølge producentens anbefalinger.

IL-24-protein ekspression ved tilsætning af doxycyclin (1 ug /ml) blev bestemt ved udførelse af en assay med transient transfektion i H1299 celler ved anvendelse af Fugene (Roche, Indianapolis, IN, USA). Efter bekræftelse af, at doxycyclin induceret IL-24-protein-ekspression anvendte vi pTet-IL-24-plasmid til frembringelse af en Tet-inducerbar stabil cancercellelinie. Kort fortalt, H1299-celler podet i seks-brønds plader blev transficeret med pTet-IL24-plasmid-DNA (1 ug) blandes med Fugene i serumfrit RPMI-medium. Ved fireogtyve timer efter transfektion G418 (800 ug /ml; Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA) blev tilsat til brøndene, og celler blev selekteret i fjorten dage. De overlevende celler blev selekteret, ekspanderet og screenet for doxycyclin-induceret IL-24-ekspression ved Western blotting. Cellepopulation, der viste IL-24-protein-ekspression blev efterfølgende udsat for enkelt celle klonal ekspansion og screenet for IL-24-protein-ekspression. Klonen, der viste den højeste IL-24-protein-ekspression ved tilsætning af doxycyclin var mærket som H1299-IL24 og blev anvendt i vores studier.

cellemigrationsassay

En cellemigrationsassay hjælp polycarbonatfiltre med en porestørrelse på 8 um (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) blev udført som tidligere beskrevet [28]. Kort fortalt, H1299-IL24 (5 x 10

4) celler blev podet i det øvre kammer af indsatsen og anbragt i en seks-brønds plade fyldt med serumfrit RPMI-1640 medium (nedre kammer). Efter 24 timer blev dyrkningsmediet i pladen med seks brønde erstattet med frisk medium indeholdende 20% tetracyclin frie FBS (Atlanta Biologicals, Inc., Flowery Branch, GA, USA) og det øvre kammer blev fyldt med 2% tetracyclin fri FBS holdigt medium med eller uden doxycyklin (1 pg /ml; Sigma Chemicals). Efter inkubation i 6 timer, 24 timer og 48 timer blev inserterne fjernet og behandlet som beskrevet tidligere. Resultaterne blev udtrykt som et gennemsnitligt antal af migrerede celler pr mikroskopisk felt.

For at bestemme den inhiberende virkning af IL-24 mod eksogen SDF-1-induceret tumorcellemigration blev en cellemigrationsassay udført som beskrevet ovenfor, bortset fra at det nedre kammer indeholdt SDF-1 (100 ng /ml) i stedet for 20% FBS.

for at bestemme den kombinerede inhiberende virkning af IL-24 og AMD3100, celler suspenderet i 2% tetracyclin gratis FBS indeholdende medium var podet i det øvre kammer af indsatserne og blev behandlet med doxycyclin alene (1 ug /ml), AMD3100 (100 ng /ml) alene eller en kombination af begge. Dyrkningsmediet i det nedre kammer indeholdt SDF-1 (100 ng /ml). Celler, der ikke modtog nogen behandling tjente som kontrol i disse forsøg. Ved 24 timer efter behandling blev antallet af migrerede celler talt som beskrevet ovenfor.

Til undersøgelser tester kombinatorisk inhibitoriske aktivitet af IL-24 med SJA5 på cellemigrering under tilstedeværelse af SDF-1 (100 ng /ml), celler (5 x 10

4) blev behandlet enten med doxycyclin (1 ug /ml) eller SJA5 (100 ng /ml) eller AMD3100 (100 ng /ml) som et enkelt middel eller i kombination af doxycyclin + SJA5 eller doxycyklin + AMD3100. Celler, der ikke modtog nogen behandling tjente som kontrol. Antallet af migrerede celler blev bestemt efter 24 timers behandling som beskrevet ovenfor.

Cell invasion assay

A Matrigel celleinvasion assay blev udført som tidligere beskrevet [29]. Matrigel pre-coatede filtre (8 um; BD Biosciences) blev rehydreret med 1 ml vævskulturmedium. H1299-IL24 (5 x 10

4) celler blev podet i det øvre kammer, medens det nedre kammer af insertet blev fyldt med serumfrit vævsdyrkningsmedium. Efter 24 timer blev det nedre kammer erstattet med 20% tetracyclin gratis FBS indeholdende medium og det øvre kammer blev fyldt med 2% tetracyclin fri FBS med eller uden doxycyklin (1 ug /ml). Efter inkubation i yderligere 6 timer, 24 timer og 48 timer, kamrene blev bearbejdet og tumorcelleinvasivitet blev bestemt som tidligere beskrevet.

Flowcytometrisk analyse Salg

H1299-IL24 celler (1 x 10

6) var enten ikke behandlet (kontrol) eller behandlet med SDF-1 (100 ng /ml). Ved 1 time, 4 timer, og 24 timer efter SDF-1-behandling blev cellerne høstet, dissocieret til enkelte celler, og blev vasket to gange med PBS-BSA-puffer. Celler blev derefter fikseret i 20 minutter i 1 ml PBS indeholdende 1% paraformaldehyd ved stuetemperatur. Efter skylning i PBS-BSA-puffer, blev cellerne inkuberet med 10% humant AB-serum (Cat.No.110-HG-100, R 10 pl /10

6 celler; R Amersco LLC, Solon, OH, USA) og blev høstet ved 30 min, 1 time, 2 timer, 3 timer, 4 timer, 6 timer og 24 timer efter actinomycin D behandling. Totalt RNA fremstilles ud fra de høstede celler blev anvendt til at bestemme CXCR4 mRNA-niveauer ved RT-PCR som beskrevet ovenfor. CXCR4 mRNA halveringstider blev beregnet ud fra typiske henfaldskurver ved lineær regression mellem 0 timer og 24 timer [31]. Værdier ± SD er baseret på mindst to uafhængige forsøg Salg

Transient transfektion assay

H1299 og A549-celler (1 x 10

5) blev podet i seks-brønds vævskulturplader og transient transficeret med 1 ug plasmid ekspressionsvektor, som bærer den

IL-24

cDNA og indkapslet i kationisk DOTAP: Cholesterol liposom som tidligere beskrevet [30]. Efter 6 timers transfektion blev vævskulturmedium aspireret og genopfyldes med frisk medium. Celler, som ikke blev transficeret med

IL-24

plasmidvektor tjente som kontrol. Cellerne blev høstet ved 24 timer efter transfektion cellelysat fremstilles og analyseres for IL-24, CXCR4, og AKT ved western blotting. Salg

Western blotting-assays

Celler modtager forskellige behandlinger og opsamlet ved forskellige tidspunkter blev underkastet Western blot-analyse som tidligere beskrevet [32]. Primære antistoffer mod IL-24 (1: 2000; Introgen Therapeutics, Houston, TX, USA), GRK6 (SC-100.380; 1: 1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, CA, USA), phospho-CXCR4

S339 (ab74012) og CXCR4 (ab2074) (1: 1000; Abcam, Cambridge, MA, USA), phospho-CXCR4

S324 /325 (CP 4251; 1: 1000; ECM Biosciences LLC, Versailles, KY, USA ), phospho-AKT

S473 (katalog nr. 4060), total AKT (katalog nr. 9272), phospho-PRAS40

T246 (katalog nr. 2997), total PRAS40 (katalog nr. 2691 ), phospho-mTOR

S2448 (Cat No. 2971) og total mTOR (kat nr 2983) (1:.. 1000; Cell Signaling Technology Inc; Beverly, MA, USA), CXCR7 (PA5-28739; 1 : 1000; Thermo Scientific, Rockford, IL, USA); HIF-1α (ABE 279; 1: 1000; Millipore), Beta-actin (1: 2000; Sigma Chemicals) blev indkøbt og anvendt som anbefalet af producenterne. Proteiner blev påvist ved anvendelse af passende sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Inc., og Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) og en forøget kemiluminescens kit (Thermo Scientific). Proteinniveauer blev påvist ved anvendelse kemiluminescens imaging system (Syngene, Frederick, MD) og kvantificeret under anvendelse Billede Quant (Syngene) software.

Immuncytokemi

Celler (1,0 x 10

4) blev podet på Lab-Tek 2-brønds kammerobjektglas (Nalge-Nunc International, Rochester, NY, USA) og var enten ikke behandlet (kontrol) eller behandlet med doxycyclin (1 ug /ml). Ved 24 timer efter behandling blev cellerne behandlet og farvet som tidligere beskrevet [25, 28, 30]. Primære antistoffer blev anvendt, var muse-anti-humant IL-24-antistof (1: 1000) og kanin-anti-human CXCR4 antistof (1: 2000). Glassene blev cover-gled, observeret, og fotografier taget med Nikon Tiu mikroskop (Nikon Instruments Inc. Melville, NY, USA).

Calcium mobilisering assay

Celler dyrket på poly-D- lysin-overtrukne plader blev behandlet med doxycyclin (1 ug /ml) i 24 timer. Celler, som ikke blev behandlet med doxycyclin tjente som kontrol. Den følgende dag blev cellerne mærket med Fluo-4 Direkte calcium reagens (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) ved tilsætning af reagens til vævsdyrkningsmediet som anbefalet af fabrikantens protokol, og inkubering i 1 time ved 37 ° C . SDF-1 (100 ng /ml) blev derefter tilsat i hver af brøndene, og den cytosoliske frie calciumkoncentration blev bestemt på forskellige tidspunkter ved måling af fluorescens (excitation ved 495 nm og emission ved 516 nm) under anvendelse af Perkin Elmer EnVision Multilabel Reader (Waltham, MA, USA). Resultaterne blev plottet mod tiden og udtrykt som relative fluorescensenheder (RFU).

CXCR4 RNA-interferens undersøgelser

Celler (1 x 10

5 celler /brønd) blev podet i 6 brønd plader og transficeret med 100 nM af CXCR4 siRNA (Santa Cruz Biotechnology) ved anvendelse DOTAP: Cholesterol liposom [30]. Seks timer efter transfektion i serumfrit medium, blev vævet dyrkningsmediet erstattet med 2% tetracyclin fri serum indeholdende RPMI-1460 og SDF-1 (100 ng /ml). Cellerne blev derefter enten ikke behandlet eller behandlet med doxycyclin (1 ug /ml). Celler, som ikke blev transficeret med siRNA tjente som kontrol. Efter 24 timers inkubation blev cellerne høstet og samlet cellelysat fremstillet og analyseret for CXCR4, AKT, og PRAS40 ved Western blotting.

I den cellemigrationsassay, celler (5 x 10

4) blev podet i det øvre kammer af migrationen skær og blev transficeret med CXCR4 siRNA (100 nM) og blev enten ikke behandlet eller behandlet med doxycyclin (1 ug /ml). Det nedre kammer blev fyldt med SDF-1 (100 ng /ml) indeholdende vævskulturmedium. Antallet af migrerede celler ved 24 timer efter doxycyclinbehandling blev talt som beskrevet ovenfor.

Statistisk analyse

Medmindre andet er angivet, blev alle data vist som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SD) . Univariat statistisk signifikans blev bestemt ved envejs variansanalyse (ANOVA) med Tukeys justering for parvise sammenligninger. Forskel mellem grupperne på hvert tidspunkt blev opnået ved lineær Mixed Model med Tukey tilpasnings-. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. SAS 9.2 blev anvendt til de statistiske analyser.

Resultater

NSCLC celler udtrykker CXCR4 og AKT

Expression niveauer af endogenousCXCR4 og AKT (phosphoryleret AKT

S473 og total AKT ) proteiner varierede blandt de fire humane lungecancer (H1299, HCC827, H460, og A549) cellelinier testet med H1299 cellelinje viser den højeste ekspressionsniveau af de to proteiner (fig. 1a). Baseret på vores resultater, vi valgte at bruge H1299 cellelinie til alle vores studier beskrevet nedenfor.

En

, Endogen CXCR4 og AKT proteinekspression i human lunge cancer cellelinjer.

B

, IL-24 reduceret CXCR4 udtryk på 24 timer og 48 timer i doxycyclin-behandlede H1299-IL24 celler, men ikke i doxycyclin ubehandlede kontrol celler.

C

, IL-24 reduceret GRK6, phosphoryleret (p) CXCR4 og total CXCR4 ekspression i doxycyclin-behandlede H1299-IL24 celler sammenlignet med ekspression af disse proteiner i doxycyclin ubehandlede H1299-IL24 celler.

D

, Immunocytokemi viser doxycyclin-induceret IL-24-ekspression i H1299-IL24 cellelinie reduceret CXCR4 ekspression. Celler, som ikke blev behandlet med doxycyclin tjente som kontrol.

Forstørrelse

IL-24- X 30; CXCR4- X 40.

E

viste Time-retters undersøgelse CXCR4 ekspression blev reduceret så tidligt som 4 timer efter IL-24-ekspression og den hæmmende aktivitet blev opretholdt op til 24 timer i doxycyclin-behandlede H1299-IL24 celler . Beta actin blev anvendt som protein lastning kontrol i Western blot analyser.

IL-24 nedregulerer CXCR4 men ikke CXCR7 udtryk

For at bestemme den hæmmende virkning af IL-24 på CXCR4, vi først genereret en IL-24 inducerbar cellelinje af H1299, der blev transficeret med en doxycyclin inducerbar plasmidvektor (pTET-

IL-24

) og har valgt at udtrykke IL-24 ved tilsætning af doxycyclin. Den således skabte cellelinje blev mærket “H1299-IL24” og anvendes i den foreliggende undersøgelse. Bemærk: H1299 celler udtrykker ikke endogen IL-24-protein og dermed enhver IL-24 protein påvist ved tilsætning af doxycyclin tilskrives induktionen af ​​IL-24

Behandling af H1299-IL24 celler med doxycyclin (. 1 ug /ml) resulterede i IL-24-ekspression ved 24 timer og 48 timer (fig. 1B). Forbundet med IL-24-ekspression var en markant reduktion i CXCR4 ekspression ved begge testede tidspunkter (fig. 1b). Da aktivering af CXCR4 vej involverer CXCR4 phosphorylering (p) i serin 324/325 og Serine 339 af G-protein-koblede receptorer (GPCR’er) kinase (GRK) -6 [33-35], undersøgte vi den inhiberende virkning af IL-24 på GRK6, pCXCR4

S324 /325 og pCXCR4

S339. IL-24 reducerede udtryk for GRK6, pCXCR4

S324 /325, pCXCR4

S339 og total CXCR4 udtryk (Fig. 1C). Immuncytokemisk farvning viste doxycyclin-behandlede H1299-IL24 celler udtrykte IL-24 og havde reduceret CXCR4 (fig. 1D) sammenlignet med celler, der ikke blev behandlet med doxycyclin (kontrol). Denne observation tilsluttede vores Western blotting resultat. Vi næste gennemført en tidsforløbet undersøgelse for at afgøre, hvor tidligt IL-24-ekspression kan reducere CXCR4 udtryk. IL-24-protein-ekspression var påviselig så tidligt som 2 timer efter doxycyclinbehandling, og dets ekspression steget over tid (fig. 1E). Parallelt blev inhibering af CXCR4 observeret at forekomme begyndende ved 4 timer og den inhibitoriske aktivitet blev opretholdt til 24 timers test (fig. 1E). Disse resultater viste, at IL-24 inhiberede effektivt CXCR4 ekspression i en tidsafhængig måde.

For at bestemme om den observerede IL-24-medieret inhibering på CXCR4 var unikke for H1299-celler, vi udført eksperimenter i en yderligere lunge cancercellelinie, A549. H1299 og A549-celler blev transient transficeret med en IL-24 udtrykkende plasmid DNA-vektor og cellelysaterne opsamlet ved 24 timer efter transfektion blev analyseret ved Western blotting. Celler, som ikke blev transficeret med plasmidvektoren tjente som kontrol. IL-24-ekspression var påviselig i både de cellelinier, som blev transfekteret med IL-24-plasmid-DNA, mens ingen IL-24-protein-ekspression blev detekteret i kontrolcellerne (S1 Fig.). Forbundet med IL-24-ekspression var en markant reduktion i CXCR4 proteinekspression i begge cellelinier. Derudover reduktion i phosphoryleret AKT

S473, en nedstrøms mål for CXCR4 blev også observeret i celler, der udtrykker IL-24, men ikke i kontrolceller. Vores undersøgelse resultater viser, at IL-24-medieret inhiberende virkning på CXCR4 ikke er begrænset til én cellelinje, og at der kan opnås den inhibitoriske aktivitet på CXCR4 via inducerbar eller forbigående IL-24-ekspression.

Siden SDF-1 kan binde til både CXCR4 og CXCR7, vi bestemt CXCR7 udtryk i lungekræft-cellelinjer, og om IL-24 hæmmede CXCR7 i H1299-IL24 cellelinje. Endogene CXCR7 protein ekspressionsniveauer varierede blandt de testede lungekræft cellelinier (S2 Fig.). Men induktion af IL-24-ekspression i H1299-IL24 cellelinie ikke inhiberer CXCR7 (S2 fig.) Sammenlignet med kontrolceller. Vores undersøgelse resulterer således vise, at IL-24 hæmmer selektivt CXCR4 og ikke CXCR7 i H1299 celler.

IL-24-medieret CXCR4 hæmning resulterer i reduceret migration af tumorceller og invasion

Da CXCR4 har været vist at spille en rolle i tumormetastase ved at fremme cellemigration og invasion undersøgte vi, om dæmpningen af ​​CXCR4 ekspression ved IL-24 havde en deraf følgende biologisk virkning. IL-24-induktion i H1299-IL24 celler signifikant reduceret cellemigration så tidligt som 6 timer og blev opretholdt indtil 48 timer sammenlignet med kontrollen (figur 2A;.

P

0,05). Den mulighed, at den inhiberende aktivitet skyldtes celledrab blev elimineret som ingen cytotoksicitet blev observeret ved 6 timer, en iagttagelse, der var enig med vores tidligere undersøgelser under anvendelse af adenovirus (Ad) -IL-24 [25].

H1299 -IL24 celler blev enten ikke behandlet eller behandlet med doxycyclin og observeret for cellemigrering og invasion. IL-24 inhiberede tumorcellemigration (A) og invasion (B) ud fra 6 timer og opretholdt sin inhiberende aktivitet indtil 48 timer, hvorefter punkt Eksperimentet blev afsluttet (

P

0,05). Barer betegner standardafvigelse (SD).

Den mulighed, at doxycyclin behandling alene kunne producere en direkte hæmmende effekt på celle migration [36] blev også udelukket ved at behandle naive H1299 celler med doxycyclin (1 pg /ml ). Doxycyclin behandlede naive H1299 celler viste ingen inhiberende virkning på cellemigrering i forhold til kontrolceller (S3 Fig.).

A tumorcelleinvasion assay viste også, at IL-24 signifikant reducerede antallet af celler invaderer gennem Matrigel sammenlignet at kontrollere celler på alle-tidspunkter testet (figur 2B;.

P

0,05). Vores resultater indikerer, at afbrydelse af CXCR4 signalering ved IL-24 resulterer i hæmning af både tumorcellemigration og invasion.

Inhibering af CXCR4 af IL-24 påvirker AKT-mTOR signalering

Ekspression og aktivering af CXCR4 har vist at have en positiv regulere flere udviklingsmæssige og onkogene signalveje i mange cancertyper [13, 37, 38]. De seneste tal viser, at SDF-1 /CXCR4 akse og PI3K /AKT akse funktionelt interagere og spille en betydelig rolle i tumorvækst, metastase og terapi modstand [39]. Derudover AKT /mTOR pathway er nedstrøms for CXCR4 og har vist sig at være reguleret af CXCR4-aktivering [40]. Eftersom IL-24 inhiberede CXCR4 og følgelig inhiberede celle migration og invasion, vi næste undersøgt de inhibitoriske virkninger af IL-24 på AKT /mTOR pathway. Ekspression af IL-24 i H1299-IL24 celler resulterede i en markant reduktion i Pakt

S473 proteinekspression forhold til at styre celler på både 24 timer og 48 timer (Fig 3;.

P

0,05) . Samtidig med nedsættelsen Pakt

S473 ekspression var den reducerede ekspression af pPRAS40

T246, som er en direkte substrat for AKT. Desuden udtryk for pmTOR

S2448 og HIF-1α blev også markant reduceret med IL-24-induktion (figur 3;.

P

0,05). Disse data demonstrerer, at IL-24-medieret CXCR4 inhibering effektivt reducerer ekspression af signalmolekyler, som er nedstrøms for CXCR4 og er involveret i tumor celle migration og invasion.

Western blotting viste induktion af IL-24-protein-ekspression i H1299 -IL24 celler resulterede i markant reduktion i ekspressionen af ​​fosforyleret (p) AKT

S473, pmTOR

S2448 og pPRAS40

T246 og HIF-1α på 24 timer og 48 timer efter doxycyclin behandling. Beta actin blev anvendt som protein loading kontrol.