PLoS ONE: Klinisk Klassifikation af Cancer kakeksi: Fænotypiske korrelerer i Human Skeletal Muscle

Abstrakt

Baggrund

Kakeksi påvirker de fleste patienter med fremskreden kræft og er forbundet med en reduktion i behandling tolerance , respons på behandlingen, og varigheden af ​​overlevelse. En hindring til effektiv behandling af kakeksi er et valideret klassificeringssystem.

Metoder

41 patienter med resektabel øvre gastrointestinal (GI) eller kræft i bugspytkirtlen undergik karakterisering for kakeksi baseret på vægttab (WL ) og /eller lav muscularity (LM). Fire diagnostiske kriterier blev anvendt 5% WL, 10% WL, LM, og LM + 2% WL. Alle patienter gennemgik biopsi af rectus muskel. Analyse inkluderet immunhistokemi for fiber størrelse og type, protein og nukleinsyre koncentration, Western blots for markører for autophagy, SMAD signalering, og inflammation.

Resultater

Sammenlignet med ikke-kakektiske kræftpatienter, patienter med LM eller LM + 2% WL, middeldiameter muskelfiber blev reduceret med ca. 25% (p = 0,02 og p = 0,001 henholdsvis). Ingen signifikant forskel i fiberdiameteren blev observeret, hvis patienterne havde WL alene. Uanset klassificering, var der ingen forskel i fiber antal eller andel af fibertype tværs af alle myosin tung kæde isoformer. Mean muskelprotein-indholdet blev reduceret, og forholdet mellem RNA /DNA nedsat hos patienter med enten 5% WL eller LM + 2% WL. Sammenlignet med ikke-kakektiske patienter blev SMAD3 proteinniveauer øget hos patienter med 5% WL (p = 0,022), og med 10% WL, beclin (p = 0,05) og ATG5 (p = 0,01) protein niveauer blev forøget . Der var ingen forskel i phospho-NFkB eller phospho-STAT3 niveauer på tværs nogen af ​​grupperne.

Konklusion

muskelfiber størrelse, kan biokemiske sammensætning og sti fænotype variere efter, om de diagnostiske kriterier for kakeksi er baseret på vægttab alene, et mål for lav muscularity alene eller en kombination af de to. For interventionsforsøg, hvor det primære endepunkt er en ændring i muskelmasse eller funktion, kan brug af kombinerede diagnostiske kriterier tillade identifikation af en mere homogen patient kohorte, reducere den nødvendige stikprøvestørrelse for og forbedre tidshorisont, inden for hvilken der kan gennemføres forsøg.

Henvisning: Johns N, Hatakeyama S, Stephens NA, Degen M, Degen S, Frieauff W, et al. (2014) Klinisk Klassificering af kræft kakeksi: Fænotypiske korrelerer i human skeletmuskulatur. PLoS ONE 9 (1): e83618. doi: 10,1371 /journal.pone.0083618

Redaktør: Imed Eddine Gallouzi, McGill University, Canada

Modtaget 2 oktober, 2013; Accepteret: 5. november 2013; Udgivet: 3 jan 2014

Copyright: © 2014 Johns et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne »modtaget et mindre tilskud fra Royal College of Surgeons: https://www.rcsed.ac.uk/fellows-members/awards-and-grants/grants/small-research-grants.aspx. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Shinji Hatakeyama, Martin Degen, Simone Degen, Wilfried Frieauff, Christian Lambert, Ronenn Roubenoff David Glas og Carsten Jacobi er alle medarbejdere i Novartis. Med hensyn til de ansatte i Novartis, ændrer det ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft kakeksi er blevet defineret for nylig som en multifaktoriel syndrom karakteriseret via en løbende tab af skeletmuskulatur masse (med eller uden tab af fedtmasse), som ikke fuldt ud kan vendes ved konventionel ernæringsmæssig støtte og fører til progressiv funktionsnedsættelse [1]. Cachexi påvirker størstedelen af ​​patienter med fremskreden cancer og er forbundet med en reduktion i behandling tolerance, respons på behandlingen, livskvalitet og varigheden af ​​overlevelse. Skeletal muscle tab synes at være den mest betydningsfulde begivenhed i cancer cachexia og er forbundet med en dårligt resultat [1], [2]. Den internationale enighed om klassifikation af kræft kakeksi foreslog, at diagnostiske kriterier bør tage hensyn ikke blot, at vægttab er et signal tilfælde af kakektisk processen, men at den oprindelige reserve af patienten også bør overvejes (enten lav BMI eller lavt niveau af muskularitet). Selv om sidstnævnte begreb har nogle validering i form af klinisk risiko [2], har der ikke været nogen vurdering af de biologiske korrelater i form af ændringer inden selve skeletmuskulatur.

Menneskelig skeletmuskel består af muskelfibre, der er klassificeres afhængigt af deres hastighed sammentrækning og fremherskende form for energi metabolisme. Muskelfibre kan klassificeres som type I (slow-twitch) og type II (fast-twitch) fibre baseret på deres fremherskende myosin tung kæde (MyHC) isoform indhold. Generelt type I og type IIa fibre udnytte oxidativ fosforylering, mens skrive IIx og IIb fibre udnytte primært anaerob metabolisme til at generere ATP. Både den procentdel og strukturelle morfologi fibertype vil bestemme den fænotypiske kapacitet og funktionelle ydeevne af enhver given muskel. Miljømæssige faktorer i både sundhed og sygdom har en direkte indvirkning, der fører til ændringer i fibertype /morfologi og deraf følgende funktionalitet; sådanne processer omfatter aldring, motion, kronisk sygdom, og kakeksi [3] – [7]. Ændringen, konservering eller tab af fibre kan påvirke kliniske symptomer, og der er tegn på, at alle typer af MyHC er målrettet selektivt i kræft kakeksi [8]. Løbende tab af protein i muskelvæv kan føre til muskelfibrene krympning og en reduktion i tværsnitsareal (CSA). Tilsvarende kan tab af muskelfiber CSA føre til tab af aerobe kapacitet (VO

2 max) hos raske forsøgspersoner samt kræftpatienter [5], [9].

Selvom systemisk inflammation er generelt menes at være en vigtig opstrøms mediator af cancer kakeksi [10], den præcise molekylære mekanismer, som medierer ændringerne i proteinsyntese og nedbrydning der til sidst fører til atrofi af muskelfibre i cancer kakeksi hos mennesker er ikke kendt. For hvert dyr model, der er blevet undersøgt, har forskellige veje blevet impliceret. Fra sådanne dyremodeller er der en fremherskende indtryk, at øget nedbrydning via aktivering af ubiquitinpromotoren proteasomforløb (UPP) vigtig [10]. I modsætning hertil humane data er meget begrænset. Aktivering af proteinnedbrydning via UPP har ikke været gennemgående fund [11] [12]. Dette har ført til forslag om, at autophagy kan være vigtige, eller at veje, der kan påvirke både syntese og nedbrydning kan være vigtige (f.eks TGF-β /SMAD signalering) [13].

I den foreliggende undersøgelse valgte vi at evaluere forholdet mellem de forskellige cachexia definitioner, systemisk inflammation (serum C-reaktivt protein) og potentielle inflammatoriske signalveje inden muskel (phospho-STAT3 og phospho-NFkB). Vi har også undersøgt for potentielle associationer mellem de forskellige cachexia definitioner og aktivering af autofagi veje eller TGF-β /SMAD signalering.

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge ændringerne i muskelfibrene biologi med hensyn til morfologiske struktur og sammensætning, for at studere ændringer i forskellige veje, der kan tegne sig for ændrede fiber størrelse og relatere disse ændringer til de forskellige diagnostiske kriterier, der er blevet foreslået som en del af den seneste internationale konsensus om klassifikation af kræft kakeksi [1].

Materialer og metoder

Patient Rekruttering, Identification, samtykke og etik

Patienter med resektabel sygdom og egnet til undersøgelsen blev identificeret via den øvre gastrointestinal cancer tværfagligt team (MDT) møder på Royal Infirmary, Edinburgh, UK. Skriftligt samtykke blev givet forud for indtræden i undersøgelsen. Alle procedurer blev godkendt af NHS Lothian lokale videnskabsetisk komité. Undersøgelsen var i overensstemmelse med de standarder fastsat af Helsinki-deklarationen.

Beregning af vægttab

Pre-morbid vægt blev mindes af patienten og kontrolleres så vidt muligt fra de medicinske noter. Selv om der kan være recall bias, at beviser understøtter pålideligheden af ​​selvrapporteret vægt og vægt historie [14], [15] er veldokumenteret. Individuel vægttab blev beregnet og udtrykt som procent af præ-morbid kropsvægt tabt

Klassificering af kræft Kakeksi

Vægttab . 5% i seneste 6 måneder (i fravær af simpel sult) (WL 5%)

Vægttab 10% i løbet af de seneste 6 måneder (i fravær af simpel sult) (WL 10%)

Stature justeret skeletmuskulatur indeks overens med lav muscularity (LM) (se ‘CT-billedanalyse’ for cut-offs)

Stature justeret skeletmuskulatur indeks i overensstemmelse med lav muscularity og enhver grad af vægttab 2% (LM + 2% WL)

Rectus abdominis muskel biopsi og opbevaring for Biokemisk Analyse

Alle biopsier blev taget ved starten af ​​åben abdominal kirurgi under generel anæstesi. Patienterne havde fastet natten over før kirurgi. Kanten af ​​rectus abdominis blev udsat, og en 1 cm

3 eksemplar fjernes med skarp dissektion. Den biopsi blev renset for forurening brutto blod. Indlysende fedt /fibrøst væv blev fjernet før placering i en cryotube og bliver snap frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C.

Rectus abdominis muskel Sample Forberedelse til Cryo-sektion

A 0,1-0,5 cm

3 afsnit af muskel blev skåret. Flydende nitrogen blev anvendt til at afkøle isopentan opløsningsmiddel i et rør til en temperatur på ~-190 ° C. Den del af musklen blev syet på et segment af kork. Oktober opløsning blev anbragt ved forbindelsen mellem proppen base og musklen. Dette blev derefter sænket med proppen opad (dvs. muskel først) i afkølet opløsningsmiddel og holdt i ca. 5 minutter (indtil musklen var frosset). Prøverne blev derefter opbevaret ved -80 ° C indtil brug.

CT Image Analysis

CT-scanninger, der anvendes til analysen blev udført udelukkende til rutinemæssig kræftbehandling. En tværgående CT billedet fra den tredje lændehvirvler (L3) blev vurderet for hver scanning dato og væv mængder anslås [16]. Alle CT billeder blev analyseret af en enkelt uddannet observatør. Ledertværsnit for muskel og fedtvæv blev normaliseret til statur (cm

2 /m

2).

Skøn over hele kroppen butikker blev genereret fra de rå data (cm

2 ) ved hjælp af regression ligninger ved Mourtzakis et al. [17], som viser en tæt sammenhæng mellem muskel og fedt områder i CT-billeder på den tredje lændehvirvler og hele kroppen rum i fedtfri masse (FFM) og fedtmasse (FM) respectively.The respektive indeks for FFM og FM ( kg /m

2) blev beregnet.

Cutoffs for lav muscularity var baseret på en CT-baserede sarcopenic fedme undersøgelse af kræftpatienter ved Prado et al. (Dvs. L3 skeletmuskulatur indeks: ≤38.5 cm

2 /m

2 for kvinder og ≤52.4 cm

2 /m

2 for mænd). [18]

CT-scanninger bruges var rutinemæssige diagnostiske iscenesættelse CT-scanninger, som blev udført inden for 30 dage af en diagnose af kræft og alle var i tidligere ubehandlede patienter. Den mediane tid til biopsi efter CT-scanning var 18 dage.

Immunhistokemi

De frosne muskel sektioner blev co-farvet for laminin (L9393, Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz) og myosin tung kæde type i eller II til at skelne hver type fiber (BA-D5 for type i, SC-71 for type IIa). De paraffinsnit blev farvet for phospho-STAT3 (D3A7, cellesignalering Technologies, Danvers, MA, USA) med en Ventana opdagelse XT (Roche-koncernen, Tucson, USA). Billeder af hele vævssnit blev erhvervet ved hjælp af en VS120 slide scanner (Olympus, Tokyo, Japan). Fordelingen af ​​myosin tung kæde fibertyper, tværsnitsarealet af de individuelle fibre i sektionen, og phospho-STAT3 positive kerner og farvning densitet blev analyseret under anvendelse af proprietære billedanalyse platform ASTORIA (Automated Lagret Image Analysis) udviklet af Novartis /Prækliniske sikkerhedsdata.

tissue Forberedelse til DNA, RNA og protein Udtræk

Skeletal muskelvæv blev hakket og jord på tøris. Alikvoter blev vejet ved anvendelse af en analysevægt (Mettler Toledo) og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

DNA og RNA Ekstraktion og linearitet ekstraktionsmetode

DNA og RNA fra human skeletmuskel væv blev ekstraheret og oprenset med det automatiserede Maxwell 16-systemet (Promega, Duebendorf, Schweiz). For at bestemme lineariteten af ​​de udvindingsmetoder hjælp af Maxwell 16 systemet, DNA og RNA blev ekstraheret fra 4 mg, 6 mg, 8 mg, og 10 mg muskel hhv. Beregning af de samlede DNA og RNA-indhold pr vådvægt (som i en lineær ekstraktionssystem bør være ens for alle alikvoter), tilladt os at definere det lineære område af Maxwell 16 ekstraktionssystem. Baseret på disse præliminære undersøgelser blev portioner af 4-8 mg human skeletmuskel væv, der anvendes til alle efterfølgende DNA- og RNA-ekstraktioner. Brug af mere udgangsmateriale drastisk reduceret det totale DNA og RNA-indhold pr vådvægt (data ikke vist).

I DNA ekstraktion blev Maxwell 16 LEV Blood DNA Kit (Promega) anvendt med en lettere tilpasset protokol i forhold til håndbogens instruktioner. Kort beskrevet blev 300 pi Tail Lysis Buffer fra kittet ReliaPrep gDNA Tissue Miniprep System (Promega) tilsat til hakket og formalet human skeletmuskel væv i Precellys 24 lyserende kit rør. Væv blev yderligere homogeniseret under anvendelse af high-throughput homogenisator Precellys 24, i 10 s. Efter afkøling på is i 5 minutter, 30 pi af proteinet K og 5 pi af 1-Thiolglycerol opløsning blev tilsat. Denne blanding blev inkuberet ved 56 ° C i 2 timer. Derefter blev lysatet overført til brønd 1 i LEV Blood DNA patron, og fortyndet med 300 pi nuclease-frit vand. I elueringen blev 50 pi elueringspuffer tilsat til elueringsrørene. The Maxwell 16 instrument blev startet ved hjælp af DNA-Blood-programmet.

For RNA ekstraktion blev Maxwell 16 LEV simplyRNA Tissue Kit bruges (Promega) efter manuelle anvisninger. Kort fortalt, hakket, formalet human muskel væv blev inkuberet i 200 pi kølede 1-Thioglycerol /Homogenisering opløsning og homogeniseres yderligere ved hjælp af Precellys 24 (se DNA). Bagefter blev prøverne opvarmet til 70 ° C i 2 min, derefter lysaterne fik lov til at køle ned. 200 pi lysepuffer blev tilsat til den afkølede homogenat, blandet kraftigt, efterfulgt af overførsel af de samlede 400 pi i brønd 1 i Maxwell 16 LEV patron. 5 pi DNAse blev tilsat til brønd 4 af patronen, og 50 pi RNAse-frit vand blev sat til 0,5 ml elueringsrørene og RNA-ekstraktion programmet blev startet ved Maxwell 16 instrument.

ekstraherede DNA og RNA blev målt spektrometrisk bruger en Trinean DropSense instrument (Trinean, Gentbrugge, Belgien) i mængde og kvalitet.

protein Udtræk

for at udvinde proteiner, 300 pi PhosphoSafe Extraction Reagent (Millipore) tilsat til et specifikt beløb (mellem 8 og 18 mg) af homogeniseret human skeletmuskulatur væv. For yderligere at homogenisere prøverne blev Precellys 24 system, der anvendes (se afsnittet ovenfor). Efter inkubation på is i 5 min blev lysaterne centrifugeret ved 800 x g i 5 min ved 4 ° C. Supernatanter blev overført til nye rør og centrifugeret i yderligere 12 minutter ved 1600 x g ved 4 ° C. Supernatanter blev opsamlet, og proteinkoncentrationer måles under anvendelse af BCA Protein Assay Kit (Pierce) med BSA som en standard. Derefter blev phosphatase inhibitor cocktail (Roche) tilsat, og prøverne blev opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

Western blots

20 ug human skeletmuskulatur proteinekstrakter (se ovenfor) reducere Laemmli SDS-prøvebuffer blev kogt i 5 minutter ved 95 ° C og derefter separeret ved SDS-PAGE på 4-20% gradient-geler (Bio-Rad, Cressier, Schweiz), blottet til nitrocellulose membraner (Bio-Rad) ved anvendelse af trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad), blokeret i 1 time i 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand + 0,05% Tween-20, inkuberet natten over med primært antistof, skyllet og inkuberet i 1 time med peroxidase -konjugeret gede-anti-kanin IgG (1:5000) (Santa Cruz, Heidelberg, Tyskland) ved stuetemperatur. Blots blev udviklet ved anvendelse af ECL (Roche, Rotkreuz, Schweiz) eller SuperSignal West Femto substrat (Thermo Scientific, Wohlen, Schweiz) og eksponeret for Kodak film (Kodak, Rochester, NY, USA).

Kanin monoklonale antistoffer anvendes var: Beclin-1 (klon D40C5), Atg5 (klon D1G9), Atg7 (klon D12B11), Atg12 (klon D88H11), SMAD3 (klon C67H9), phospho-NF

κ

B p65 (Ser536) ( klon 93H1) og α-tubulin (klon 11H10) (alle fra cellesignalering Technologies, Danvers, MA, USA), phospho-SMAD3 (Ser423 /Ser425, klon EP823Y) (Millipore, Billerica, MA, USA). Kanin polyklonale antistoffer blev anvendt, var:. Gelsolin (cellesignalering Technologies)

Western blots blev analyseret densitometrisk ved hjælp ImageJ software-version 1.45 (NIH, Bethesda, MD, USA; https://rsbweb.nih.gov/ij) . Båndintensitet af hver prøve blev normaliseret til den for α-tubulin

C -. Reaktivt protein (CRP)

Serum CRP-koncentrationen blev målt med en automatiseret immunturbidimetrisk assayet ved klinisk kemi afdeling, Royal Infirmary Edinburgh, bruge blod opsamlet fra patienter på tidspunktet for rekruttering og før nogen terapeutisk intervention.

Statistisk analyse

Resultaterne er udtrykt som middelværdi (± SEM). Sammenligninger mellem grupper blev udført ved hjælp af uparrede Students t test, mens mulige relationer blev evalueret ved hjælp af Pearsons korrelationer. Resultater blev betragtet som signifikante, hvis p-værdier var mindre end 0,05. Programmet SPSS (version 20, SPSS, Chicago, IL, USA) blev anvendt til alle de statistiske test.

Resultater

Patient Demografi

I alt 41 kræftpatienter med operérbar UGI eller kræft i bugspytkirtlen blev rekrutteret. Generelt patienter var over 65 år, overvejende mandlige og havde lidt i gennemsnit 5% vægttab sammenlignet med præ-sygdom niveauer (tabel 1). Patienterne blev grupperet baseret på begreberne international klassificering Framework [1] i henhold til vægttab eller vægttab i forbindelse med lav muscularity. De specifikke fænotyper betragtes var vægttab 5% (WL 5%), vægttab 10% (WL 10%), lav muscularity (LM), og LM med vægttab 2% (LM + 2% WL). Selvom BMI blev reduceret i alle grupper, der er klassificeret som kakektiske, kun LM og LM + . 2% WL-grupper havde en signifikant lavere fedtfri mass index (tabel 1)

Muscle Fibre Størrelse, Antal , og type

Hvis patienter blev klassificeret som kakektiske ved LM eller LM + 2% WL blev fiber størrelse væsentligt reduceret (alle typer af myosin tung kæde fiber) sammenlignet med ikke-kakektiske patienter og kontrolpersoner ( Figur 1A). Foreningen af ​​kakeksi med reduceret fiber størrelse blev ikke observeret, hvis patienterne blev klassificeret i henhold til WL alene. Repræsentative immunhistologiske sektioner demonstrerer forskelle i fiberdiameteren mellem en sund kontrol og en person i gruppe II versus gruppe IV er vist i figur 1B. Immunhistologi for type I og IIa resulterede i komplementær farvning i almindelighed, mens fibertype IIb resulterede i meget lav farvningsintensitet som rapporteret andetsteds [19]; derfor kvantitativ analyse blev udført kun med type I og IIa men ikke med type IIb (tabel 2). Som man kunne forvente fra et fald i fiber størrelse, var der en tendens på tværs af alle grupper for fibertæthed at stige i dem med kakeksi. Men på grund af stor variation, var dette ikke, statistisk signifikant. Der var ingen tegn på selektiv fiber atrofi på tværs af alle grupper klassificeringskriterierne (tabel 2).

(A) Middel (± SEM) fiber størrelse for både MyHC1 og MyHCIIa. Der foretages en sammenligning mellem patienter med den foreslåede kakeksi definition fraværende (mørkegrå), og dem med den foreslåede kakeksi definition stede (lysegrå) for de fire definitionerne i Metoder (I-IV). (*, P 0,05 og **, P 0,01 ved Students t-test). (B) Immunohistologiske sektioner af musklen for et sundt kontrol patient med vægttab alene (10,1%) (gruppe II), og patient med lav muscularity og 2% vægttab (Group IV). Laminin vises i grøn, MyHC1 vist med rødt, og MyHCIIa vises med blåt.

Protein Content

Resultaterne for skelet indhold muskel protein er vist i figur 2 (EN). Sammenlignet med ikke-kakektiske patienter, blev muskelprotein indhold signifikant reduceret (ca. 13%) hos patienter med enten 5% WL eller LM + 2% WL (figur 2A og tabel 3). Men hvis LM kriterier blev anvendt alene blev observeret nogen forskel i proteinindholdet. Desuden patienter med viste 10% WL en reduktion i proteinindholdet 10% sammenlignet med ikke-kakektiske patienter, men denne forskel ikke nåede statistisk signifikans (figur 2A og tabel 3)

En sammenligning er. mellem patienter med den foreslåede kakeksi definition fraværende (mørkegrå), og dem med den foreslåede kakeksi definition stede (lysegrå) for de fire definitionerne i metoder (i-IV). (A) Mean (± SEM) vådvægt proteinindhold. (B) Gennemsnit (± SEM) RNA indhold. (C) middel (± SEM) DNA-indhold. (C) middel (± SEM) RNA /DNA-forhold. (*, P 0,05 ved Students t-test)

RNA, DNA og RNA /DNA Ratio

Resultaterne for skeletmuskulatur DNA og RNA-indhold er også. vist i figur 2 (B, C og D) og tabel 3. RNA-indhold var ikke signifikant forskellig i kakektiske patienter sammenlignet med ikke-kakektiske patienter ifølge ethvert af de diagnostiske kriterier (Figur 2B og tabel 3). I modsætning hertil blev DNA-indhold steg med 50% med 5% WL men faldt med ~ 40% hos patienter med LM (Figur 2C). Forholdet mellem RNA /DNA blev reduceret (ca. 30%) hos patienter med 5% WL og LM + . 2% WL (figur 2D)

Autophagy Pathways

Hos patienter med 10% WL, Beclin og ATG5 proteinniveauer blev signifikant forøget i kakektiske patienter sammenlignet med ikke-kakektiske patienter (figur 3). ATG7 og 12 niveauer var ikke forskellige i kakektiske patienter sammenlignet med ikke – kakektiske patienter ifølge ethvert af de diagnostiske kriterier (tabel 3)

Western blot-analyse med viste antistoffer, α-tubulin blev anvendt som en belastning. kontrol. Grafen viser middelværdien (± SEM) proteinniveau repræsenteret i arbitrære enheder (A.U). (*, P 0,05 og **, P 0,01 ved Students t-test).

SMAD Signalering

Hos patienter med 5% WL, SMAD3 protein niveauer var signifikant forøget sammenlignet med ikke-kakektiske patienter (figur 4). Der var ingen signifikante forskelle i phospho-SMAD3 /SMAD3 tværs nogen af ​​grupperne (figur 4).

Western blot-analyse med viste antistoffer, α-tubulin blev anvendt som en loading kontrol. Grafen viser middelværdien (± SEM) proteinniveau repræsenteret i arbitrære enheder (A.U). (*, P 0,05 ved Students t-test).

inflammatorisk Pathways

Systemisk inflammation blev estimeret ved hjælp af patienternes serum CRP niveauer (tabel 1). Patienterne blev klassificeret som havende systemisk inflammation, hvis deres CRP var ≥10 mg /l. Der var ingen forskel i andelen af ​​patienter med eller uden systemisk inflammation ifølge definitionen af ​​kakeksi. Niveauer af phospho-NFKB og phospho-STAT3 ikke var signifikant forskellig hos patienter med eller uden kakeksi (ved hjælp af nogen af ​​definitionerne: tabel 4). Eller med eller uden systemisk inflammation (figur 5)

(A) vestlige blot analyse i nærvær eller fravær af systemisk inflammation med viste antistoffer, blev α-tubulin anvendt som en loading kontrol. (B) Graf viser middelværdien (± SEM) protein niveau af phospho-NF-KB, repræsenteret i arbitrære enheder (A.U). (C) repræsentant immunhistokemi og kerner optælling af phospho-STAT3 (området vist repræsenterer felt) af en patient med eller uden systemisk inflammation. (D) Graf viser farvningen tætheden af ​​phospho-STAT3 kerner (AU) (± SEM) i nærvær eller fravær af systemisk inflammation.

Diskussion

Fibre Størrelse

Den diagnostiske kriterium for kræft kakeksi har længe været baseret på vægttab alene [1], og kan reflektere tab enten fedt eller magert væv rum. I betragtning af, at nøglen vævstab i kræft kakeksi anses for at være skeletmuskulatur, en nylig konsensus proces foreslog, at de diagnostiske kriterier for kakeksi også bør tage hensyn til lave baseline niveauer af muscularity [1]. I den foreliggende undersøgelse, når patienter blev klassificeret som kakektiske eller ej ifølge ≥5% vægttab var der ingen signifikant forskel i hele kroppen muscularity (FFMI) eller muskelfibrene CSA. I modsætning hertil, når patienter blev klassificeret i henhold til lav muscularity og ≥2% vægttab blev FFMI faldt og fiber tværsnitsareal blev også signifikant reduceret (figur 1). Sådanne resultater viser, at heterogenitet i forhold til lav muscularity og fiber atrofi kan reduceres i overensstemmelse med den kliniske definition af kakeksi. Dette fund kan være vigtigt, især når man overvejer kriterier for kliniske forsøg, der har til formål at teste effektiviteten af ​​lægemidler rettet mod tilbageførsel af muskelsvind hos kræftpatienter inklusion. Reduktionen i fiberstørrelse i alle MyHC isoformer observeret i den foreliggende undersøgelse er i overensstemmelse med tidligere dyr [20] og humane studier af cancer kakeksi [4] – [7]. Rectus muskel af patienter med oesophago-gastrisk cancer kakeksi har vist sig at miste alle typer MyHC indhold samt gennemgå en reduktion i fiberstørrelse [4]. Ligeledes i bugspytkirtlen kræftpatienter med kakeksi blev begge type I og type II MyHC protein niveauer faldt med 45% sammenlignet med kontroller [6].

Fibre Type

For at studere forskelle i muskelfibrene morfologi og sammensætning inden for de forskellige cachexia kategorier, udførte vi immunhistokemisk analyse af humane muskel prøver. Til det, vi først etableret og valideret farvning metoder til myosin tung kæde-antistoffer specifikke for de forskellige fibertyper (I, IIa, og IIb). Farvning for type I og IIa fibre resulterede i stærk specifik farvning specificitet dog kun svag farvning blev observeret mod type IIb MyHC, har dette fund også rapporteret andetsteds [19]. De dominerende typer MyHC fiber i rectus abdominis muskel er I og IIa og kun 8% af typen IIb positive fibre er tidligere blevet beskrevet [21]. Af de voksne skelet isoformer, der hver udtrykkes i varierende omfang i både mus og human skeletmuskulatur. selvom MyHCIIb er kraftigt udtrykt på både messenger-RNA (mRNA) og proteinniveau i murine skeletmuskulatur, beviser til dato tyder på, at denne isoform effektivt kun udtrykkes på mRNA-niveauet i en meget lille delmængde af specialiserede muskler i den voksne menneske [22]. Som nævnt ovenfor, er MyHCIIb udtryk typisk forbundet med høje kræfter sammentrækning kombineret med hurtig kontraktile egenskaber og det er blevet foreslået, at de kontraktile karakteristika MyHCIIb kan være uforenelige med de biomekaniske begrænsninger større muskler [23], der eventuelt tegner sig for manglen af specificitet fundet i rectus muskel i vores patientpopulation.

i kakeksi er der modstridende beviser, hvorvidt der er selektiv tab af fibertype. Der var ingen evidens for selektivt tab af fibertype i den foreliggende undersøgelse (tabel 2). Dokumentation fra dyremodeller tyder på, at type II fibre er målrettet selektivt [24], med relativ bevarelse af type I fibre i fastende [25], udsættelse for glucocorticoider [26], sepsis [27], og i musculus gastrocnemius af C26 model cancer kakeksi [28], [29]. Modeller af hjerte- kakeksi, men har foreslået en tendens til selektivt tab af type I fibre og en stigning i type II fiber [30]. Desuden har ikke alle grupper demonstreret Type I og II fiber forskelle selv i dyr. Faktisk i en nylig undersøgelse af C26 kakektiske musemodel begge til glycolytiske og oxidative fibre af (extensor digitorum longus) EDL muskler undergik spilder [20], mens der i en tidligere undersøgelse under anvendelse af samme musemodel var der en signifikant stigning i mængden af MyHCIIb og et signifikant fald i mængden af ​​type 1 MyHC i soleus muskel [31]. Det er i øjeblikket ikke helt klart, hvilken type fibre påvirkes i human cancer kakeksi, men hos patienter med oesophago-mavekræft kakeksi tidligt tab af alle MyHC isoformer er blevet rapporteret [4].

aktivitet mønstre af en muskel er også nøglen til at bestemme fænotype. Hvis muskelceller ansættes sjældent de udvikler sig til hurtige /glycolytiske enheder hvorimod hvis de ansættes oftere, danner de langsomme /oxidative enheder. I C26 musemodel for cancer kakeksi, har der været rapporter om omskiftning af myosin-isoformer i soleus muskel i kakektiske mus [31]. I bugspytkirtlen kræftpatienter med kakeksi, blev ingen forskel i forholdet hurtig /langsom myosin isoform demonstreret sammenlignet med kontroller [6].

Muskel RNA, DNA, og proteinindhold

I den nuværende undersøgelse, sammenlignet med ikke-kakektiske patienter, blev muskelprotein indhold reduceres væsentligt (ca. 13%), hvis patienterne blev klassificeret som kakektisk enten 5% WL (p = 0,015) eller LM + 2% WL (p = 0,035), og med 10% hos patienter med 10% WL. Proteinindhold udtrykt i forhold til våd vægt af muskelvæv har vist sig at falde gradvis (over 50%) i musculus gastrocnemius af mus med MAC-16 tumor [32]. Dette antyder, at ikke alene er der tab af fiberdiameteren, men at kvaliteten af ​​fiberen ændres med tab af enten sarkoplasmiske eller myofibrillært protein. Sådanne ændringer i fibersammensætningen kan bidrage til reduceret muskel mekanisk kvalitet (kraft pr tværsnitsareal) observeret i human cancer kakeksi [33].

En reduktion i både RNA indhold og aktivitet i skeletmuskulatur har været tilskrives en nedtrykning af proteinsyntese i mus med MAC16 tumoren [32]. I den foreliggende undersøgelse, RNA indholdet var uændret i kakektiske patienter (klassificeret enten med 5% WL eller LM + 2% WL) sammenlignet med ikke-kakektiske patienter. En reduktion i RNA-indholdet i musklen af ​​mus med Ehrlich ascites tumor er også rapporteret, men dette forekom senere end den observerede depression i hastigheden af ​​proteinsyntese [34]. Hvorvidt muskel proteinsyntese er trykket i human cancer kakeksi stadig skal løses [10].

I en murin model af cancer kakeksi DNA-indholdet i musculus gastrocnemius har vist sig at være forholdsvis konstant, trods af, at en falde i protein- og RNA-indhold [32].