PLoS ONE: miRNA-27b Mål Vaskulær endotel vækstfaktor C til hæmme tumor Progression og angiogenese i kolorektal Cancer

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest udbredte kræftformer globalt og er en af ​​de førende årsager til kræft-relaterede dødsfald på grund af terapi modstand og metastase. Forståelsen af ​​mekanismen bag colorektal carcinogenese er afgørende for diagnose og behandling af CRC. microRNA (miRNA) kan fungere som enten onkogener eller tumor undertrykkere i mange kræftformer. En tumor suppressor rolle for miR-27b er for nylig blevet rapporteret i neuroblastom, mens ingen oplysninger om miR-27b i CRC er tilgængelig. I denne undersøgelse har vi påvist, at MIR-27b-ekspression reduceres i de fleste CRC væv og konstateret, at overekspression af MIR-27b undertrykker vækst CRC celleproliferation, kolonidannelse og tumor

in vitro

in vivo

. Vi identificerede vaskulær endotel vækstfaktor C (VEGFC) som en ny målgen af ​​MIR-27b og besluttet, at MIR-27b fungerede som en inhibitor for tumorprogression og angiogenese gennem målretning VEGFC i CRC. Vi yderligere bestemt, at DNA-hypermethylering af MIR-27b CpG-øer aftager MIR-27b ekspression. Sammenfattende et anti-tumor rolle for MIR-27b og dens hidtil ukendte mål VEGFC

in vivo

kan føre til tumor nekrose og tilvejebringe et rationale for at udvikle MIR-27b som et terapeutisk middel.

citation: Ye J, Wu X, Wu D, Wu P, Ni C, Zhang Z, et al. (2013) miRNA-27b Mål karendotelvækstfaktor C til hæmme tumor Progression og angiogenese i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (4): e60687. doi: 10,1371 /journal.pone.0060687

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: November 14, 2012; Accepteret: 1 Marts 2013; Udgivet: 12 april, 2013 |

Copyright: © 2013 Ye et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 91.019.005), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (nr Y2110034), den 151 Talent Projekt i Zhejiang-provinsen (HJ) og Videnskab og Teknologi Bureau of Zhejiang-provinsen (nr 2011C37004). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) rangerer som den tredje mest udbredte kræft på verdensplan. Trods den kliniske gennemførelse af talrige terapeutiske strategier er det fortsat en førende årsager til cancerrelaterede dødsfald på grund af terapi modstand og metastase [1] – [3]. Derfor forståelsen af ​​mekanismen underliggende colorektal carcinogenese er afgørende for diagnose og behandling af CRC. Interaktioner mellem tumorer og stroma anerkendes som kritiske komponenter i tumor progression i CRC [4]. På det seneste er det tegn på, at chemokiner produceret i tumormikromiljøet såsom vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), fibroblastvækstfaktor (FGF), og blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) spiller en afgørende rolle i patogenesen af ​​CRC stigende [5], [6].

microRNA (miRNA) er en klasse af små, endogene, ikke-kodende RNA, som spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​target gener ved komplementær parring i mRNA 3 ‘uoversatte region (3’UTR), der fører til translationel undertrykkelse eller mRNA nedbrydning [7]. miRNA er kendt for at fungere i forskellige biologiske processer, herunder udvikling, celleproliferation, differentiering, apoptose, og kræft initiering eller progression [8], [9]. Ved cancer, kan miRNA fungere som enten et onkogen eller et tumor-suppressor, som det fremgår af MIR-130b fremme leverkræft stamceller (CSCS) vækst og selvfornyelse via målretning TP53INP1 [10], MIR-34a inhiberende prostatacancer metastaser ved direkte undertrykke CD44 [11], og mIR-7 inhibering af tumorvækst og metastase ved at påvirke den phosphoinositoide-3-kinase (PI3K) /AKT pathway i hepatocellulært carcinom [12]. Disse resultater tyder på, at det er af afgørende betydning for at afklare miRNA funktioner og lovgivningsmæssige kredsløb til at formulere terapeutiske strategier.

Vi hypotesen, at molekylære forskelle mellem CSCS og differentierede kræftceller kan identificere et centralt molekyle i tumorvækst og progression, og i denne undersøgelse, undersøgte forskelle i miRNA udtryk mellem CSCS og differentierede CRC celler ved hjælp miRNA microarrays. Vi fandt, at MIR-27b-ekspression i det væsentlige er nedsat hos CSC-lignende celler og i CRC væv. MIR-27b er placeret på kromosom 9 og er blevet vist at fungere som en tumorsuppressor i neuroblastom via målrette peroxisomproliferatoraktiverede receptor γ (PPARy) [13]. Det er også blevet rapporteret, at MIR-27b kan fungere som en angiogen omskifter ved at fremme endothelial spids celle skæbne og spiring [14], [15]. De specifikke funktioner og potentielle mål for MIR-27b i CRC celler er uudforsket. Vi bekræftede, at vaskulær endotelvækstfaktor C (VEGFC), som spiller en rolle i tumorprogression, er et hidtil ukendt mål for MIR-27b. Et stort antal kliniske undersøgelser har vist, at stigende ekspression af VEGFC i primære tumorer korrelerede med øget udbredelse af tumorceller til regionale lymfeknuder i en række humane carcinomer [16] – [18]. For nylig havde den regulerende rolle VEGFC som initiativtager og potensere neo-angiogenese blevet afsløret [19]. Vi opdagede, at MIR-27b kunne blokere CRC-celleproliferation, kolonidannelse og tumorvækst og at den fungerer som en angiogeneseinhibitor ved at målrette VEGFC og nedregulering DNA hypermethylering. Forståelse af de mekanismer, som miR-27b hæmmer tumorvækst og angiogenese etablerer et stærkt rationale for dens udvikling som en terapeutisk anti-tumor agent.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne forskning blev godkendt af Institutional Review Boards of Second Affiliated Hospital i Zhejiang University School of Medicine. Alle deltagere gav skriftligt samtykke fra deres oplysninger, der skal lagres på hospitalet databasen og bruges til forskning.

Alle Animal værker var blevet gennemført i overensstemmelse med relevante nationale og internationale retningslinjer. Denne forskning blev godkendt af Institutional Review Boards of Second Affiliated Hospital i Zhejiang University School of Medicine.

cellelinier

humane kolorektale cancer cellelinjer, SW620, SW480, RKO, HT29 og 293T blev købt fra cellen banken på Kina Academy of Medical Science (Kina). SW620 og SW480-celler blev dyrket i Leibovitz L15 medium (Gibco, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco). RKO, HT29 og 293T-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco) suppleret med 10% FBS. Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære.

miRNA Expression microarray analyse

Totalt RNA blev isoleret fra CD133

+ og CD133

– CRC celler under anvendelse TRIzol® reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol. Mængden og kvaliteten af ​​RNA blev vurderet ved anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Worcester, MA, USA). Den miRNA udtryk profil af hver prøve blev vurderet ved hjælp af en Affymetrix miRNA array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA).

Kvantitativ PCR analyse

Total RNA fra cellelinier, friske CRC væv eller xenograft væv blev isoleret ved anvendelse TRIzol® reagens (Invitrogen). Total RNA fra paraffinindlejrede væv blev isoleret ved RECOVERALL ™ samlede Nucleic Acid Isolation Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og behandlet med RNase-fri DNase I (Qiagen, Valencia, CA, USA) i overensstemmelse med producentens instruktioner . Mængden og kvaliteten af ​​RNA blev vurderet ved anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer. TaqMan miRNA ekspressionsassays (Applied Biosystems) blev anvendt til at kvantificere miRNA ekspression under anvendelse af StepOnePlus ™ -systemet (Applied Biosystems). Alle prøver blev kørt tredobbelt, og MIR-27b niveauer i hver prøve blev normaliseret til den for U6.

proliferationsassav

Celler blev podet ved en densitet på 3 x 10

3 brønd i en plade med 96 brønde indeholdende 0,2 ml Leibovitz L15 medium med 10% FBS. MTS (3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -5- [3-carboxymethoxyphenyl] -2- [4-sulfophenyl] -2H-tetrazolium-salt) reagens (Promega, Madison, WI, USA) (20 pi ) blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Absorbansværdierne blev målt ved 490 nm på en mikropladelæser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og vurderes løbende i 7 dage.

Soft-agar koloniassay

Celler blev podet ved en densitet på 300 per brønd på det øverste lag af 0,3% lavtsmeltende agarose (Sigma, St. Louis, MO, USA) i plader med 12 brønde med et bundlag på 0,5% agarose i Leibovitz L15-medium indeholdende 10% FBS. Efter inkubation ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære inkubator i 2 uger blev kolonier indeholdende 20 celler visualiseret under et omvendt mikroskop og talt.

tumorigenese Assay

Celler suspenderet i 100 pi Leibovitz L15-medium blev implanteret i bagsiden af ​​4 uger gamle nøgne hunmus at vurdere deres evne til at initiere tumorxenoplantater. Tumorer blev målt ugentligt og deres volumen beregnet som længde x bredde x bredde /2.

MIR-27b Therapy

SW620 celler (5 x 10

6) blev injiceret i bagsiden af 4 uger gamle NOD /SCID-mus, som alle udviklede tumorer in 1 uge med et volumen på -200 mm

3. Fem mus blev randomiseret til hver af den negative kontrol (NC) og MIR-27b grupper. Alle mus blev injiceret med intratumoralt kolesterol-konjugeret efterligner (1 OD efterligner /tid /mus) (GenePharma Tech, Shanghai, Kina) to gange om ugen og tumorer målt hver 4. dag. Musene blev aflivet ved cervikal dislokation 5 uger efter den tiende injektion og transplanterbare tumorer blev isoleret og vurderes.

Immunofluorescens Assay

Alle xenograft væv blev formalinfikseret og paraffinindlejret til sektionering på en Leica mikrotom. Fire-mikron snit blev fremstillet og antigen-genvinding udføres ved kogning af prøverne i 15 minutter ved 100 ° C i 10 mmol /l natriumcitrat. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 0,3% hydrogenperoxidase i 20 minutter, og prøver blev blokeret med PBS indeholdende 1% FBS. Polyklonalt kanin-anti-muse CD31 IgG (Abcam, Cambridge, MA, USA) blev fortyndet 1:200 og tilsat som det primære antistof; Prøverne blev derefter inkuberet ved 4 ° C natten over. Prøver blev efterfølgende inkuberet med det passende sekundære antistof konjugeret til fluoresceinisothiocyanat (FITC) (Multisciences Biotech, Hangzhou, Kina).

Luciferase Assay

pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspressionsvektor (Promega ) indeholdt VEGFC mRNA 3’UTR af mIR-27b målsted eller et muteret mIR-27b målsted (se File S1). PRL-TK plasmider (Promega) blev co-transficeret ind i 293T-celler med enten den negative kontrol mimic (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘), MIR-27b mimic (5′-UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3′), eller anti-miR- 27b mimic (5’-GCAGAACUUAGCCACUGUGAA-3 ‘) (GenePharma Tech, Shanghai, Kina) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Forholdet mellem ildflue til

Renilla

luciferaseaktivitet blev bestemt under anvendelse Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) 48 timer efter transfektion i et luminometer.

Western Blotting

Samlet protein blev ekstraheret fra celler lyseret med M-PER pattedyrprotein Extraction Reagent (Thermo) suppleret med cocktail af proteaseinhibitorer (Sigma). Efter blokering med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand med Tween-20 (TBST) i 60 minutter blev membranen inkuberet med de primære antistoffer anti-human-VEGFC (cellesignalering teknologi, Danvers, MA, USA) ( 1:2000) eller anti-humant GAPDH (KangChen, Shanghai, Kina) opløst i 5% bovint serumalbumin i TBST natten over ved 4 ° C.

Klinisk CRC Sample Analysis

Prøver blev opsamlet mellem 2008,1 og 2010,12 på Second Affiliated Sygehus, Zhejiang University School of Medicine og bekræftet patologisk. Tumorer blev iscenesat hjælp Den Internationale Union Against Cancer (UICC) tumor staging-system (tabel S1).

Statistisk analyse

Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). De qPCR resultater fra parrede kliniske prøver blev analyseret af en to-tail parret Students

t

-test og de andre resultater ved en to-tail uparret Students

t

-test.

P

værdier. 0,05 angivet statistisk signifikans

Andre metoder

, herunder celle sortering, plasmid byggeri, etablering af miR-27b, anti-miR-27b, eller VEGFC knockdown (VEGFC-shRNA anti-mIR-27b stabile SW620 celler), ELISA, hematoxylin og eosin (HE) -farvning, og methylering specifik polymerasekædereaktioner (MSP), er beskrevet i File S1.

Resultater Salg

miR-27b niveauet falder både i kolorektal CSCS og de fleste Kræft væv

CSCS spiller en afgørende rolle i carcinogenese og er forbundet med gentagelse, metastaser og terapi modstand [20] – [22]. Der kan anvendes en række overflademarkører for CSCS sortering, herunder CD24, CD44, CD166 og CD133 [22]. Af disse, CD133 er en god CSCS markør for CRC [5], [22] – [25]. Vi observerede CSCS ejendomme i CD133

+ SW620-celler (Figur S1) og vurderede miRNA udtryk profiler i CD133

+ og CD133

– celler til at identificere miRNA er involveret i tumor progression. Microarray analyse opdaget fire opreguleret (miR-1308, miR-720, miR-132-stjerne og miR-181a-star) og 14 nedreguleret (miR-27b, miR-193b, miR-595, miR-27a- stjerne, miR-1307, miR-502-3p, miR-652, miR-200b, miR-31, miR-1247, miR-200a, miR-200b-star, miR-362-5p, miR-210) miRNA i CD133

+ -celler (figur 1A). Når disse resultater blev kombineret med tidligere miRNA microarray data (data ikke vist), kun MIR-27b-ekspression var forskellig. Dette blev bekræftet af qPCR, som viste en 2,77-gange ændring i miR-27b udtryk i CD133

+

versus

CD133

-. Celler (figur 1B)

(A ) udtrykkes forskelligt miRNA i CD133

+ og CD133

– celler. Rød angiver høj og grøn betegner lave niveauer af udtryk. (B) miR-27b udtryk i CD133

+ og CD133

– celler blev vurderet ved qPCR. Y-aksen viser fold ændring. (C) MIR-27b-ekspression vurderet ved qPCR i friske CRC væv sammenlignet med tilstødende normale væv fra seks patienter. Y-aksen viser fold ændring. (D) miR-27b udtryk vurderet af qPCR i 80 parrede paraffinindlejret CRC og tilstødende normale væv. MIR-27b niveauer blev normaliseret til U6 og udtrykkes i tærskelcyklus (C

t) -forhold. Fejl søjler repræsenterer midler ± SEM, *

P

0,05, **

P

. 0,01

Vi målte også miR-27b udtryk i CRC vævsprøver. I det begrænsede antal af tilgængelige friske vævsprøver (n = 6), MIR-27b-ekspression blev nedreguleret 1,5-5,5-fold i CRC væv sammenlignet med tilstødende normale væv (figur 1C). I et større antal parrede paraffinindlejrede væv, den miR-27b til U6 tærskel cyklus (C

t) værdi nøgletal var signifikant højere i tumorvæv, hvilket indikerer lavere miR-27b-ekspression i CRC (Figur 1D). Faktisk qPCR data på 80 parrede paraffinindlejret CRC og tilstødende normale væv viste, at MIR-27b ekspression faldt i 60% CRC sammenlignet med 15% forhøjet. MIR-27b er for nylig blevet rapporteret at være en tumor suppressor i neuroblastom; derfor fokuserer vi resten af ​​vores undersøgelser om bestemmelse af de biologiske funktioner og reguleringsmekanismer af miR-27b i CRC.

miR-27b Hæmmer tumorvækst og angiogenese i CRC

Vi har etableret både miR- 27b og anti-miR-27b SW620 stabile cellelinier (se File S1) for at studere de biologiske funktioner af miR-27b (figur 2A) ved at bestemme proliferation og kolonidannelse

in vitro

tumorigenese

in vivo

. Vi fandt, at overekspression af MIR-27b undertrykt celleproliferation, hvorimod inhibering MIR-27b gennem stabil ekspression af et anti-MIR-27b svamp fremmes celleproliferation (figur 2B). En blød-agar koloniassay indikerede, at øget MIR-27b-ekspression betydeligt forbudt kolonidannelse, kendt som selvfornyelse, hvorimod anti-MIR-27b-celler dannet større og større antal sfærer end den negative kontrol (figur 2C og D). Hvad vigtigere er, i en tumorigenese assay initieres ved subkutan injektion af 1 x 10

6 CRC-celler, fandt vi, at MIR-27b kunne stærk undertrykke tumorvækst, mens anti-MIR-27b fremmet vækst (figur 2E og F).

(A) mIR-27b ekspression i negativ kontrol (NC), blev mIR-27b og anti-mIR-27b SW620 cellelinier vurderes ved qPCR. Y-aksen viser fold ændring. (B) Cell proliferationshastighed detekteres ved måling af absorbansen ved 490 nm i en MTS-assay. (C og D) Resultater af en blød-agar koloni assay. Kolonier blev visualiseret ved mikroskopi efter 2 ugers inkubation. Kolonier, der indeholder 20 celler blev talt. Scale barer = 200 um. (E) Resultater fra en tumorigenese assay. Et repræsentativt billede af xenotransplantattumorer i nøgne mus injiceret subkutant med 1 x 10

6 CRC-celler. (F) Sammenligning af xenograft dannelse

in vivo

. Tumorvolumener blev målt hver uge. Fejl søjler repræsenterer midler ± SEM, *

P

. 0,05

Vi undersøgt yderligere anti-tumor effekt af miR-27b

in vivo

i et humant CRC-bærende musemodel. Musene blev randomiseret i den negative kontrol (NC) eller MIR-27b grupper med fem mus pr gruppe. Kolesterol-konjugeret NC eller MIR-27b efterligner blev injiceret i tumorerne. To mus i NC-gruppen døde efter 4 ugers behandling; dog var dødsårsagen ikke bestemt. I MIR-27b gruppe, en xenograft forsvandt efter 4 ugers behandling (figur 3A og B), mens de andre fire xenotransplantater var bløde at røre ved og alvorlige tumor nekrose blev observeret ved patologisk undersøgelse (figur 3C). Immunofluorescensassays afslørede, at xenotransplantater i MIR-27b gruppe havde mindre kapillære blodkar end i NC-gruppen (figur 3D), og qPCR resultater bekræftede, at MIR-27b-niveauer var forhøjet betydeligt i MIR-27b xenotransplantater (figur 3e). Alle disse resultater støtter en tumor undertrykkende rolle for MIR-27b i CRC og foreslå dets potentiale som et anti-CRC lægemiddel.

(A og B) Colorectal cancer (CRC) bærende NOD /SCID-mus blev injiceret intratumoralt med kolesterol-konjugeret negativ kontrol (NC) eller mIR-27b efterligner. Skorper blev observeret i fire tumorer fra MIR-27b gruppe (fin pil). En tumor fra miR-27b gruppe forsvandt helt med kun en sårskorpe tilbageværende (tyk pil). (C) hematoxylin og eosin (HE) -farvning af xenograft væv viser nekrotiske områder i MIR-27b gruppe. (D) Et repræsentativt immunofluorescensanalyse viser CD31-protein i xenograft væv fra NC og MIR-27b (n = 3). Scale barer = 200 um. (E) miR-27b udtryk i xenotransplantater fra NC og miR-27b efterligner blev vurderet ved qPCR. Fejl søjler repræsenterer midler ± SEM, *

P

. 0,05

VEGFC er en roman Target af miR-27b i CRC

miRNA fungerer primært som mediatorer af gene silencing. Mål af miR-27b i CRC blev efterfølgende analyseret ved hjælp af data forudsagt fra Targetscan database (www.targetscan.org). Hundredvis af forudsagte miR-27b mål blev udsat for yderligere berigelse analyse af celle signalveje ved hjælp af Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) pathway database (www.genome.jp/kegg/). Under anvendelse af denne fremgangsmåde blev MIR-27b forudsiges at målrette kræftrelaterede signaleringsveje herunder VEGF, Wnt og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK). I sidste ende har vi fokuseret på VEGF signalering siden Wnt og MAPK ikke var naturligvis påvirket i CRC (data ikke vist). Vi yderligere identificeret VEGFC som et funktionelt nedstrøms mål for miR-27b. Den VEGFC 3’UTR indeholder stærkt konserveret MIR-27b bindingssteder (figur 4A), der reagerer på MIR-27b i en dual luciferase reporter assay. Vi fandt, at aktiviteten af ​​en luciferase reporter indeholdende VEGFC 3’UTR faldt med -70% ved cotransfektion med MIR-27b mimic, men steg med -100% ved cotransfektion med anti-MIR-27b mimic. Desuden blev ingen ændring identificeret ved co-transfektion af det mutante reporterplasmidet med enten MIR-27b eller anti-MIR-27b efterligner (figur 4B). VEGFC proteinniveauer var også faldet i celler og dyrkningsmedium ved transfektion med en MIR-27b mimic, mens VEGFC niveauer steg ved transfektion af et anti-MIR-27b mimic (figur 4C og D).

In vivo

, VEGFC protein var lavere i miR-27b xenografter forhold til i NC-gruppen (figur 4E).

(A) VEGFC forudsiges som en ny mål for miR-27b . (B) 293T-celler blev co-transficeret med tomme pmirGLO Dual-Luciferase reporter plasmider eller VEGFC 3’UTR ildflueluciferase reporterplasmider og pRL-TK-luciferase plasmider sammen med MIR-27b efterligner eller anti-MIR-27b. Efter 48 timer, ildflueluciferase blev målt og normaliseret med den for Renilla luciferase. (C) CRC-celler blev transficeret med NC, MIR-27b eller anti-MIR-27b efterligner og ekspression af VEGFC blev detekteret ved western blotting. (D) CRC-celler blev transficeret med NC, MIR-27b eller anti-MIR-27b efterligner og VEGFC i dyrkningsmediet blev påvist ved ELISA. (E) VEGFC protein i xenotransplantater fra negativ kontrol (NC) og MIR-27b efterligner blev detekteret ved western blotting. Fejl søjler repræsenterer midler ± SEM, *

P

. 0,05

VEGFC Afspiller Tumor-fremmende rolle i CRC

Mange undersøgelser har rapporteret, at VEGFC korrelerer med tumorvækst og metastase i en række forskellige cancere, herunder CRC [16] – [18]. Vi har etableret VEGFC-Knockdown anti-MIR-27b SW620 celler gennem ekspression af en inhibitorisk shRNA (se File S1) (figur 5A). VEGFC-knockdown undertrykt celleproliferation sammenlignet med NC-celler (figur 5B), signifikant inhiberede kolonidannelse (figur 5C og D) og reduceret tumorvækst (figur 5E og F). Kollektivt, disse observationer antyder kraftigt, at VEGFC spiller rolle i at stimulere proliferation og fremme tumorigenese i CRC. Selv om der er et sæt af forudsagte miR-27b mål, VEGFC som et funktionelt nedstrøms mål for miR-27b kan være fuldt bekræftet i vores eksperimenter.

(A) VEGFC knockdown i anti-miR-27b stabile celler var bekræftet ved western blotting. (B) Celleproliferation blev bestemt ved at måle absorbansen ved 490 nm i en MTS-assay. (C og D) Resultater af en blød-agar koloni assay. Kolonier blev visualiseret ved mikroskopi efter 2 ugers inkubation. Kolonier, der indeholder 20 celler blev talt. Scale barer = 200 um. (E) Resultater af en tumorigenese assay. Et repræsentativt billede af xenotransplantattumorer i nøgne mus subkutant injiceret med 1 × 10

6 CRC celler. (F) Sammenligning af xenograft dannelse

in vivo

. Tumorvolumener blev målt hver uge. Fejl søjler repræsenterer midler ± SEM, *

P

. 0,05

DNA Hypermethylering Reducerer miR-27b Expression

Både transkriptionelle og epigenetiske veje regulerer genekspression . Epigenetiske mekanismer omfatter DNA-methylering, histonacetylering og ikke-kodende RNA’er [26]; silencing af nogle miRNA er forbundet med CpG island hypermethylering i en række forskellige cancere [27] – [29]. For at bestemme om epigenetiske mekanismer medieret MIR-27b funktion, vi dyrkede celler i nærvær af histondeacetylaseinhibitoren Trichostatin A (TSA) (Sangon Biotech, Shanghai, Kina) eller methyltransferase inhibitor 5-aza-dC (5AZA) (Calbiochem, San Diego, CA, USA). MIR-27b niveauer var uændrede i celler dyrket med 1 nmol /ml TSA i 3 dage. Men behandling med 5 nmol /ml 5AZA markant forhøjet MIR-27b-ekspression (figur 6A). Disse resultater antyder, at DNA-hypermethylering spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​MIR-27b. Den forudsagte promotor site af MIR-27b i chromosom 9 blev klonet ind i en luciferase-vektor (se File S1) og kontrolleres under anvendelse luciferase assays (figur 6B). MSP resultater viste miR-27b CpG ø hypermethylering i flere CRC cellelinjer (figur 6C).

(A) Niveauerne af miR-27b udtryk i kolorektal cancer (CRC) cellelinjer blev bestemt ved qPCR efter behandling med 5AZA eller TSA i 3 dage. (B) Resultater af luciferaseaktivitet analyser efter transfektion med den forudsagte miR-27b promotor normaliseret til pRL-TK Renilla luciferase. (C) MSP analyse af MIR-27b CpG ø i et sæt af CRC cellelinier. Bands i den “M” baner opnås PCR-produkter ved hjælp af methylering-specifikke primere og dem i ‘U’ baner er produkter fremstillet ved hjælp af umethylerede-specifikke primere.

Diskussion

CSCS hypotese er blevet påvist i en lang række faste tumorer [20], [21], og den nuværende litteratur er fokuseret på den rolle, miRNA i human cancer. miRNA anses for at have udbredt regulatorisk aktivitet i en bred vifte af udviklingsprocesser og er impliceret i forskellige sygdomme, herunder kræft [8].

Vi søgte at undersøge funktionen af ​​miRNA i CRC. Vi antager, at de molekylære forskelle mellem CSCS og differentierede cancerceller kan identificere den nøglemolekyle ansvarlig for tumorvækst og progression. Begge

in vitro

og

in vivo

undersøgelser fastslået, at CD133

+ celler i CRC kunne klassificeres som CSCS-lignende celler baseret på deres stamceller egenskaber. Denne CSCS model blev brugt til at screene og identificere 18 forskelligt regulerede miRNA. MIR-27b var den eneste miRNA identificeret gentagne gange i disse forsøg; ingen oplysninger om den rolle, som denne miRNA i CRC er blevet rapporteret. Vi fandt, at miR-27b ikke påvirkede CRC stamcelledifferentiering ved at ændre udtryk for stamcelleforskning associerede gener

Nanog, Oct4, Sox2, Bmi1

(data ikke vist). Yderligere undersøgelse viste nedsat miR-27b udtryk i de fleste CRC væv.

Vi næste undersøgt funktionen af ​​miR-27b i CRC og viste, at det i væsentlig grad kan undertrykke selvfornyelse

in vitro

og tumorgenicitet

in vivo

. Desuden identificerede vi VEGFC som et funktionelt nedstrøms mål for miR-27b ved hjælp af flere metoder. Til vores viden, er dette den første undersøgelse for at rapportere det specifikke funktion og en roman funktionel mål for miR-27b i CRC. VEGFC tilhører blodpladeafledt vækstfaktor familie og dens udtryk korrelerer signifikant med dårligere histologiske kvalitet, lymfe invasion og venøs invasion [16] – [18], [30], og de seneste oplysninger tyder det har en vigtig rolle i angiogenese. [19], [31] Adskillige nyere undersøgelser rapporterer, at autokrine regulering af kræft migration celler via VEGFC /VEGFRs er en vigtig inducer af tumorcelleproliferation, invasion og metastase. [30] Der er også nye dokumentation for en formodet rolle for miRNA som tumorsuppressorer eller onkogener, der kan føre til målrettede kræft behandlingsstrategier [32], [33]. MIR-34a har potente anti-tumor effekt i prostatatumorer og kan repræsentere et terapeutisk middel til prostatacancer [11]. Intratumoral injektion af kolesterol-konjugeret MIR-199a /b-3P efterligner inhiberede tumorvækst og reduceret serum AFP-niveauer i hepatocellulært carcinom [34]. Maligne celler er afhængige af afvigende miRNA udtryk; disse små RNA giver betydelige muligheder for udvikling af fremtidige miRNA-baserede terapier [30], [35], [36]. På grund af de alvorlige bivirkninger ved traditionel kemoterapi, forskning i andre metoder til CRC behandling, såsom genterapi, er tiltalende.

tumorangiogenese er kritisk for tumorvæksten og vedligeholdelse, og mange undersøgelser har vist, at angiogenese hæmmere kan give en betydelig terapeutisk fordel [37], [38]. Her rapporterer vi, at alvorlige nekrose blev observeret i xenografter af miR-27b efterligner, som også udviklede færre kapillære blodkar end NC-gruppen, og i et xenograft helt forsvandt med kun en sårskorpe tilbage. Disse data viser anti-tumor effekt af miR-27b

in vitro

in vivo

, hvilket tyder miR-27b for at være en lovende mål for CRC behandling efter effekten og sikkerheden af ​​genterapi er fastlagt.

de er involveret i reguleringen af ​​transskription mekanismer er varierede, og mens de underliggende miRNA dysregulering i kræft er endnu ikke fuldt forstået, har miRNA-medieret promotor hypermethylering blevet identificeret i de fleste tumorer. Vi fandt, at miR-27b medieret gen-nedregulering i CRC henføres til reversibel hypermethylering af CpG øer og ikke histonacetylering.

Væksten af ​​blodkar er afgørende for vækst og reparation kræft. Nylig dokumentation indikerede, at tumorangiogenese kan induceres ved CSCS grund angiogen faktor ekspression i tumorens mikromiljø [37], [39]. Anti-angiogenese terapi rettet mod VEGF kan nedbryder tumorvaskulaturen og ablatere selvfornyende CSCS [37], [40]. Vores data viser, at miR-27b stammer CSCS fra CRC og fungerer som en vigtig tumor suppressor og angiogen faktor ved at målrette VEGFC. Yderligere undersøgelse af CSCS eller angiogenese ville fremme udviklingen af ​​nye anticancer terapeutiske strategier. miRNA-baserede terapeutiske strategier kan også resultere i en forbedret styring af tumorer i en ikke alt for fjern fremtid [41], [42]. Disse resultater ikke kun mulighed for en bedre forståelse af de mekanismer, der regulerer CRC celler, men også lette den gradvise udvikling af mere effektive behandlinger mod kræft.

Støtte oplysninger

figur S1.

CD133 + SW620 celler udviser karakteristika af CSCS

in vitro

in vivo

. (A) Flowcytometri dot plot, der viser fordelingen af ​​CD133

+ -celler i CRC-cellelinien, SW620. (B og C) Resultater af en blød-agar koloni assay. Kolonier blev visualiseret ved mikroskopi efter 2 ugers inkubering og sådanne indeholdende 20 celler blev talt. Scale barer = 200 um. (D) Resultater fra en tumorigenese assay. Et repræsentativt billede af xenotransplantattumorer i nøgne mus, der blev injiceret subkutant med 5 x 10

4 CD133

– eller CD133

+ SW620 celler. (E) Sammenligning af xenograft dannelse

in vivo

. Tumorvolumener blev målt ugentligt. Fejl søjler repræsenterer midler ± SEM, *

P

0,05

doi:. 10,1371 /journal.pone.0060687.s001

(TIF)

File S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0060687.s002

(DOC)

tabel S1. Salg klinisk-patologisk funktioner i CRC patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0060687.s003

(DOC)

Tak

Vi takker Dr. Zhong Shi for sprog redigering .