PLoS ONE: Anti-Heparanase Aptamere som potentielle diagnostiske og terapeutiske midler til mundtlig Cancer

abstrakt

Heparanase er en endoglycosidase enzym til stede i aktiverede leukocytter, mastceller, placentavæv, neutrofiler og makrofager, og er involveret i tumormetastase og vævsinvasion. Det præsenterer et potentielt mål for kræftbehandling og forskellige molekyler er blevet udviklet i et forsøg på at inhibere den enzymatiske virkning af heparanase. I et forsøg på at udvikle en hidtil ukendt terapeutisk med en tilhørende diagnostisk assay, har vi tidligere beskrevne høj affinitet aptamerer udvalgte mod heparanase. I dette arbejde har vi vist, at disse anti-heparanase aptamerer kan inhibere vævsinvasion af tumorceller forbundet med oral cancer og verificeret, at en sådan inhibering skyldes hæmning af enzymet og ikke skyldes andre potentielt cytotoksiske virkninger af aptamererne. Vi har endvidere identificeret en kort 30 baser aptamer som en potentiel kandidat til yderligere undersøgelser, da dette viste en højere evne til at inhibere vævsinvasion end dens længere modstykke, samt et reduceret potentiale for kompleksdannelse med andre ikke-specifikke serumproteiner. Endelig blev aptamer sig at være stabile og derfor velegnet til anvendelse i humane modeller, da det viste ingen nedbrydning i nærvær af humant serum, hvilket gør det til en potentiel kandidat til både diagnostisk og terapeutisk anvendelse

Henvisning.: Simmons SC, Jämsä H, Silva D, Cortez CM, McKenzie EA, Bitu CC, et al. (2014) Anti-Heparanase Aptamere som potentielle diagnostiske og terapeutiske midler til mundtlig Cancer. PLoS ONE 9 (10): e96846. doi: 10,1371 /journal.pone.0096846

Redaktør: Sophia N. Karagiannis, Kings College London, England

Modtaget: 27. september 2013; Accepteret 11. april 2014 Udgivet: 8 oktober 2014

Copyright: © 2014 Simmons et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dr. Bonacossa blev understøttet af en ph.d.-stipendium fra Conselho Nacional de Pesquisa Científica – CNPq, om omfanget af programmet Science uden Grænser, MCTI, Brasilien. Dr. Missailidis vil gerne anerkende den økonomiske støtte fra Conselho Nacional de Pesquisa Científica – CNPq, om anvendelsesområdet for en højtstående gæsteforsker program på Fiocruz for en del af dette projekt. Forskergruppen af ​​Prof. Salo blev støttet af Finlands Akademi, den finske Cancer Organisationer, Finsk Dental Society Apollonia og Oulu Universitetshospital Kevo tilskud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Heparanase er en β-1,4-endoglycosidase enzym [1], der deltager i ekstracellulær matrix (ECM) nedbrydning og remodellering [1]. Den heparanase genet blev først klonet i 1999 af Vlodavsky og Parish grupper i den skelsættende tilbage til tilbage Nature Medicine papirer [2], [3].

Den spirende polypeptid er et 543 aminosyre pre-proenzym, som efter fjernelse af signalpeptidsekvensen i det endoplasmatiske reticulum, undergår proteolytisk processering i sene endosomer /lysosomer ved cathepsin-L lignende proteaser [4] på steder Glu109-Ser110 og Gln157-Lys158, hvilket gav en N-terminal 8 kDa polypeptid, et C terminale 50 kDa polypeptid og mellem dem et 6 kDa-polypeptid-linker [3]. 50 og 8 kDa polypeptider associerer til dannelse af et heterodimert aktivt enzym, mens 6 kDa linker udskæres og nedbrydes [5], [6].

Heparanase aktivitet er forbundet med aktiverede leukocytter, mastceller, placentavæv og makrofager og enzymet secerneres af aktiverede CD4 + -T-celler [7], [8], [9], blodplader [3], neutrofiler og metastatiske celler [10]. Efter udskillelse af heparanase fra metastatiske tumorceller, enzymet hydrolyserer glycosidbindinger af heparansulfat kæder bundet til proteoglycaner til et produkt af 10-20 sukkerenheder i længde [11], hvilket fører til indtrængen af ​​endotelceller i blodkar og målorganer af tumorcellen. Liberation af bundne cytokiner og vækstfaktorer sekvestreret af heparansulfat kæder i væv [12] letter yderligere vækst af tumoren og fremmer angiogenese og proliferation af sekundære tumorer [13]. Niveauer af heparanase udtryk i tumorceller korrelerer med deres metastatiske potentiale; forhøjede niveauer af heparanase mRNA og protein er blevet fundet i kræftpatienter, der viser signifikant kortere postoperative overlevelsestid end patienter, hvis heparanase niveauer er normal [13], [14].

Heparanase opregulering i kræftceller fra myelom, lymfoblastoidt og brystkræft afspejler forøgelse af exosome sekretion med en forbedret indhold af syndecan-1, VEGF og HGF hvis roller er tæt knyttet til tumor aggressivitet [15]. Ud over sin funktion i kræft progression, heparanase enzym spiller også en stor rolle i inflammation

per se

carcinogenese relateret til inflammatoriske proces [16]. Enzymet er blevet påvist i en række af immunceller, herunder T- og B-celler, makrofager, neutrofiler og mastceller. Det er blevet vist at mediere ekstravasation gennem endothelial barriere via ombygning af ECM heparansulfat, som derefter giver trafficking til stederne for inflammation [10], [17], [18]. Heparanase ekspression er blevet forbundet med tumorigenese i en række forskellige kræftformer, for eksempel, akut myeloid leukæmi [19], blære, hjerne [20], bryst [21], colon [22], gastrisk [23], øsofageal [24] , oral [25], pancreas [14], og livmoderhalskræft [26], hvilket antyder, at det kan være et egnet mål for lægemiddelterapi. For tiden tilgængelige inhibitorer af heparanase omfatter neutraliserende antistoffer [27], peptider [28] og små molekyler [29], [30].

En række modificeret hepariner og sulfaterede oligosaccharider har også vist sig at være potente inhibitorer heparanase med lovende anti-tumor aktiviteter og har nu avanceret til de kliniske testningen. Eksempler på disse omfatter SST0001, M402, PI-88 og PG545. SST0001 er et fuldt N-acetyleret modificeret heparin, som mangler antikoagulerende aktivitet og viste sig at være en selektiv heparanase inhibitor. Det er i øjeblikket i fase I /II kliniske forsøg til behandling af myelom-patienter. M402 er en N-sulfateret modificeret heparin, der binder en bredere vifte af vækstfaktorer i forhold til SST0001. Dette har udviklet sig til fase I /II kliniske undersøgelser som en kombinationsbehandling med kemoterapimidlet gemcitabin til behandling af metastatisk pancreascancer. PI-88 er et sulfateret polysaccharid med potent antiangiogen og anti-metastatisk aktivitet og med reduceret uønsket antikoagulerende aktivitet. Det har nået fase III kliniske forsøg for post-resektion hepatocellulært carcinom. PG545 er et tetrasaccharid der har overlegne farmakokinetiske egenskaber på grund af sin høje grad af lipofilicitet. Det har vist sig potent anti-tumor aktivitet i PI88 resistente modeller, dog kliniske fase I forsøg i slutningen af ​​2010 blev opgivet på grund af uventede reaktioner på injektionsstedet [31].

Aptamere er korte DNA- eller RNA-oligonukleotider udviklet til diagnostisk og terapeutisk anvendelse, der viser høj bindingsaffinitet og specificitet for målmolekyler [32] – [34]. Affiniteten af ​​aptamerer er blevet sammenlignet med den for antistoffer (dvs. i det nanomolære område), men som aptamerer er mindre (8-25 kDa sammenlignet med 150 kDa størrelse af antistoffer), kan de begge trænge væv og blive fjernet fra plasma i løbet af minutter intravenøs indgivelse uden at udløse et immunrespons, som kan være nyttigt, når bruger dem som diagnostiske midler [35]. Til terapeutisk anvendelse er de i stand til at bevare deres funktion og bindingskarakteristika upon modificering med andre dele, for at forbedre deres stabilitet og opløselighed, samtidig med at deres toksicitet og plasma clearance [35] – [38], [39] – [41]. Typisk, aptamerer er fra 22 til 100 baser i længden, og indeholder en region af variabel sekvens, flankeret af kendte sekvenser, som anvendes til amplifikation og identifikation. Et stort repertoire af forskellige sekvenskombinationer (typisk i området 10

15) i den centrale domæne skaber mange forskellige folde arrangementer, specificitet og bindingsaffinitet for forskellige molekyler. Aptamerer fremstilles typisk baseret på SELEX (systematisk evolution af ligander ved eksponentiel berigelse) procedure [42], selv om en række andre udvælgelseskriterier metoder er i øjeblikket tilgængelige [43] -. [45]

aptamerer tidligere var genereret mod aktivt humant rekombinant heparanase anvendelse af en modificeret SELEX protokol og salteluering serien. Valg gav tre aptamerer, ‘1,5 M korte’, en 30 bund afkortet udgave af ‘1,5 M lang’ (73 baser), og ‘3,0 M’ (55 baser). ELISA og fluorescens titreringer adskilt de to længere aptamerer som viser højere affinitet og anerkendelse af heparanase i placenta celler, hvorimod placenta væv farvning begunstiget ‘1,5 M lang «. Dette blev bekræftet i en Matrigel invasion under anvendelse ovariecancer celler tidligere har vist at kræve heparanase for invasion [46]. To yderligere aptamerer, der betegnes “pink” og “gul” blev selekteret mod linkerpeptidet sekvensen af ​​pro-heparanase, da disse kan have en funktion til inhibering af dannelsen af ​​den aktive heterodimer enzym, ved at blokere peptid protease excision.

I denne undersøgelse blev gjort en indsats for yderligere at karakterisere de tidligere valgte aptamerer og vurdere deres potentiale som et diagnostisk eller terapeutisk middel. Stabiliteten af ​​aptamer blev vurderet ved inkubation over forskellige tidspunkter med humant og muse serum og polyacrylamidgelelektroforese anvendes til at bestemme omfanget af dets nedbrydning med nukleaser til stede i serummet. En yderligere invasion assay, foruden den foregående mus EHS-tumor afledt Matrigel invasion assay blev udført under anvendelse af humant uterusleiomyom væv og heparanase-udtrykkende humane orale skællede carcinomceller (HSC-3), dette forsøg repræsenterer en mere autentisk billede hvad der sker i humant væv. Endvidere blev en celle cytotoksicitet /celleproliferationsassay udført for at verificere, at enhver inhibering af invasion observerede var ikke et resultat af cytotoksicitet hos aptamererne. Endelig blev interaktionerne mellem aptamererne med serumproteiner undersøgt både verificere specificitet aptamerer og studere deres potentielle transport af sådanne proteiner i blodet. Stigende litteratur i DNA aptamer felt har vist, at disse molekyler har enormt terapeutisk potentiale i kræftbehandling behandling og er allerede blevet anvendt som såkaldte escort molekyler til at levere medicin til kræftceller (anmeldt i [47]). AS1411 er et eksempel på en DNA-aptamer, der har udviklet sig til kliniske forsøg afprøvning. Aptameren i dette tilfælde rettet mod specifikt nucleolin protein og er blevet trialed med metastatisk, klar-celle, renal celle carcinom patienter, som har været refraktære over for kendte tyrosinkinaseinhibitorer [48].

Materialer og metoder

Cell kultur

menneskelige tunge pladecarcinom celler, HSC-3 (JCRB 0623; Osaka National Institute of Health Sciences, Osaka, Japan), blev dyrket i vækstmedier: 50% DMEM 50% Hams F-12 (Sigma Aldrich) og yderligere suppleret med 50 ug /ml ascorbinsyre, 250 ng /ml amphotericin B, 5 ug /ml insulin (bovin pancreas), 0,4 ng /ml hydrocortison og 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum. Kulturen supplement blev købt fra Sigma-Aldrich. Alle cellekulturer blev udført ved anvendelse af forvarmet reagenser. Celler blev inkuberet i 95% luft /5% CO

2 ved 37 ° C. Celler blev passeret ved fjernelse medier og vask med HBSS (Sigma-Aldrich), derefter tilsætning af 3 ml 1 x Trypsin-EDTA (Sigma Aldrich) og inkubering i 5 minutter. Den trypsin-EDTA blev inaktiveret ved tilsætning af 7 ml vækstmedier og fjerne eventuelle celleklumper. 1 ml cellesuspension (plus 24 ml frisk vækst medier) blev bibeholdt i kolben til opretholdelse af lagre, og de resterende 9 ml blev talt og anvendt til eksperimenter.

organotypiske invasion assay og analyser af inhibitorer på invasion

organotypisk invasion assay og kvantificering af resultaterne blev udført som beskrevet i Nurmenniemi

et al

. (2009) [49]. Kort fortalt 7 × 10

5 HSC-3 celler suspenderet i medier, der indeholder det passende aptamer (forretningsmæssigt forbundet, 1,5 M kort, 1,5 m lang, 3 M, pink og gul), eller et antistof mod heparanase (Hpa Ab, 0,7 mM) . Også (2- {4 – [(E) -3- (4-bromphenyl) acryloylamino] -3-fluorphenyl} benzooxazol-5-yl) eddikesyre, forkortet BAFB, blev anvendt, da dette har vist sig at have inhibitoriske virkninger ved heparanase i tidligere undersøgelser [29] (tabel 1). Hver aptamer eller antistof ved 1 uM tilsat til HSC-3 cellesuspension i begyndelsen af ​​undersøgelsen og i HSC-3 cellekulturmediet under hele forsøget. Myoma diske uden HSC-3-celler og HSC-3-celler uden inhibitor blev også medtaget i assayet som kontroller. Skiverne blev inkuberet i 14 dage ved 37 ° C med 5% CO

2 med medier indeholdende de passende inhibitorer. Medierne blev indsamlet, centrifugeres, og friske medier med inhibitorer blev ændret på dag 4, 7, 10 og 14. Fra de indsamlede medier supernatanterne, nedbrydningsprodukter af myoma vævstype III collagen blev analyseret ved hjælp af SP99 radioimmunoassay (RIA) for C- terminal telopeptid (IIICTP), og N-terminal telopeptid (IIINTP) indirekte enzymimmunassays (VVM) for N-terminale telopeptid, efter de metoder, der er beskrevet i Nurmenniemi

et al

. ([49] for RIA og [50] for VVM). På dag 14 blev myoma diske fikseret i 4% paraformaldehyd og forberedt til immunhistologisk analyse. Seks um histologiske sektioner af myoma skiver blev farvet med monoklonalt pancytokeratin antistof (DAKO, klon AE1 /AE3 ved en 1:150 fortynding) og betragtes under et mikroskop ved 100 x forstørrelse. Ni repræsentative billeder blev taget fra hver af de tre gentagelser af hver behandling. Billeder blev analyseret som beskrevet i Nurmenniemi

et al.

(2009) [49]. Forskelle i invasionen område og dybde blev evalueret under anvendelse af en t-test og Mann-Whitney-test og p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Celleproliferationsassay

for at bestemme virkningen af ​​»1,5 M short ‘aptamer på HSC-3-celleproliferation, anvendte vi CellTiter 96 Aqueous celleproliferationsassay (Promega), en MTS-assay. Ca. 1 x 10

4-celler blev podet i tre eksemplarer i en plade med 96 brønde med 1 pM af den korte aptamer. Efter 24, 48 og 72 timer blev 20 ml CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Absorbansen registreret ved 490 nm på en Fluostar Optima pladelæser anvendtes som en repræsentation af det relative antal af levende celler i kultur.

Serum stabilitet assay

Aptamerer ‘1,5 M korte’, ‘ 1,5 m lang “og” 3,0 M ‘blev inkuberet ved en koncentration på 5 uM med humant og muse serum i 30, 60, 120, 180, 240 og 300 minutter ved 37 ° C. Reaktionen blev derefter stoppet ved tilsætning af 100 mM EDTA og produkterne modtog en 12% nativ polyacrylamidgel ved siden af ​​en 25 bp DNA-markør stigen. Geler blev farvet under anvendelse af ethidiumbromid og set under UV-lys.

Serum albumin binding

bovint serumalbumin (BSA) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich Ltd (Gillingham, UK, produktkode A7030 10 g ). UV eksperimenter blev udført på en Bio-Tek Uvikon XL med en Peltier termosystem for temperaturkontrol og omrøring facilitet, tilsluttet til pc’en udnytte Lab Power Junior software til indsamling og analyse af data. Fluorimeter anvendte var en Horiba Jobin Yvon Fluoromax-P er udstyret med en foton tæller og Peltier-system til temperaturkontrol og omrøring facilitet, koblet til en pc udnytte Datamax software til spektralanalyse. Indledende målinger blev taget for at kontrollere tilstedeværelsen eller fraværet af fluorescens-emission af begge aptamerer for excitationsbølgelængde på 290 nm (selektiv for tryptophanrester) og emissionsbølgelængder mellem 300 og 400 nm. Begge aptamerer blev titreret i vand og 10 mM phosphat bufferopløsninger pH 7,4, ved 37 ° C. 1,5 M korte aptamer koncentrationen være mellem 0,3 til 8,0 uM, og den 1,5 m lange aptamer varierede fra 0,5 til 8,0 uM, der viser den iboende fluorescens af disse aptamerer. Begge aptamerer præsenteret fluorescensemissionsspektrer i dette interval. Tidligere tests viste, at aptamer koncentrationer i området fra 0,1 ug /ml til 8 ug /ml interfererede ikke i evalueringen af ​​albumin quenching [51]. Afkølende målinger blev taget i 1 ml 6 uM albuminer i fosfatbuffer pH 7,4. Emissionsspektre blev registreret fra 300 til 400 nm bølgelængde, efter en reaktionstid på 90 sekunder fra hver aptamer tilsætning. Både emission og excitation båndbredde blev indstillet til 3 nm. Aptamer blev tilsat fra en koncentreret stamopløsning således at volumenet tilvækst var ubetydelig. Eksperimenter blev udført ved 37 ° C, pH 7,4.

For at vurdere eventuelle eksisterende primære og /eller sekundære indre filtereffekter (IFES), blev korrektion procedurer baseret på absorbansmålinger af løsninger udført ved excitation og emission bølgelængder af albumin . Denne effekt består på absorptionen af ​​spændende og /eller udsendt stråling ved opløste arter, herunder fluoroforen selv [52]. Absorbans måling af aptamerer /albumin løsninger på excitation og emission bølgelængder af albumin viste, at indre filter effekt forårsaget af absorption af udsendt stråling var ubetydelig.

Resultater

Anti-heparanase aptamerer hæmmer invasion karcinom celle

invasionen af ​​HSC-3 celler blev undersøgt med en menneskelig myoma organotypiske model [49] udsætte carcinomacellerne til forskellige aptamerer (Uafhængige, 1,5 M kort, 1,5 m lang, 3 M, Pink, og gul) eller heparanase antistof (Hpa Ab) (fig. 1A). Virkningerne af disse forbindelser sammenlignet med kontrol (ingen inhibitor) om invasion (beregnet på grundlag af um-området af invasive celler) og dybden af ​​invasion (afstanden fra den nedre overflade af den noninvasive cellelag til den dybeste invaderede celle) var analyseret (fig. 1B og C). Aptamer 1,5 M Short faldt betydeligt den samlede invasion område (p = 0,0001) ligner HpaI Ab, som blev anvendt som en positiv invasion inhibitor kontrol [27]. Tværtimod ingen af ​​de andre forbindelser havde en virkning på HSC-3 invasion (figur 1). Invasionen dybde faldt signifikant efter Hpa Ab behandling (p = 0,0001) (fig 1C). Baseret på vores tidligere resultater, nedbrydningen af ​​type III collagen af ​​HSC-3 celler målt med RIA toppe fra dag 7 til 11 [49]. Tilsvarende de analyserede ved RIA fra dag 4 viste ikke forskel mellem nogen af ​​behandlingerne medier (ikke vist). Medierne ændring ved ophør af forsøget på dag 14 viste kun statistisk signifikans fra behandling med tilføjet nogen celler (p = 0,001; ikke vist). Nedbrydning af type III collagen uden inhibitorer var højest på dag 7 (ikke vist) og 10 (figur 2A-D). På dag 10, behandling med heparanase antistof inhiberede signifikant nedbrydning sammenlignet med ubeslægtet kontrol (p = 0,07 i RIA, og p = 0,03 i EIA). På dag 10 var der en signifikant inhibering med 1,5 M Short (p = 0,004 i RIA, og p = 0,007 i VVM) og 1,5 m lang (p = 0,02 i RIA, og p = 0,03 i EIA) sammenlignet med HSC-3 kontrol . Men 3 M, Pink og Gul aptamerer, samt BAFB viste ingen signifikant fald i mængden af ​​kollagen nedbrydningsprodukter, hvilket indikerer, at de ikke var succesfulde hæmmere af invasion

A:. Paraffin-embedded 14- dag myoma organotypiske snit blev farvet for pancytokeratin markør AE1 /AE3 at analysere HSC-3 invasion efter forskellige behandlinger: ingen inhibitor, Hpa Ab, (det polyklonale heparanase antistof som en positiv kontrol), ubeslægtet aptamer, (udvalgt forhold til et mål involveret i Alzheimers sygdom), anti-heparanase aptamerer 1,5 M Short, 1,5 M lang og 3 M; linker peptidaptamerer pink og gul. Scale bar er 100 pm. Forskellene i invasion område (B) og invasion dybde (C) efter forskellige behandlinger (n = 27 /behandling). Statistikken blev udført som to-stikprøve

t

-test og Mann-Whitney test

A:. EIA (IIINTP indirekte enzymimmunassays) påvisning N-terminale telopeptid fra kollagen type III nedbrydningsprodukter på dag 10 media forandring. Stigende absorbans betyder mindre kollagen nedbrydningsprodukt stede. Hpa Ab (p = 0,03), 1,5 M Short (p = 0,007) og 1,5 M Long (p = 0,03) viste signifikant stigning i absorbans sammenlignet med ingen inhibitor, tyder de har hæmmet invasionen af ​​HSC-3-celler. B: Grafen viser tidligere VVM-værdier korrigeret for negativ kontrol på dag 10 media forandring. C: RIA (radioimmunoassay for type III collagen) påvisning C-terminale telopeptid på dag 10 media forandring. Stigende niveauer betyder mindre kollagen nedbrydningsprodukt. Hpa Ab (p = 0,07), 1,5 M Short (p = 0,004) og 1,5 M Long (p = 0,02). D: RIA har bekræftet de VVM undersøgelser, som viser signifikant lavere kollagen nedbrydningsprodukter end for væv uden inhibitor tilføjede, hvilket indikerer, at de var vellykkede hæmmere af invasion

Den korte anti-heparanase aptamer ikke udviser nogen. cytotoksicitet

cytotoksiciteten af ​​de udvalgte aptamerer på HSC-3-celler blev undersøgt, at kontrollere, at inhibering af invasion observeret i organotypisk model var et resultat af inhibering af heparanase, som tidligere verificeres [46] og ikke cellecytotoksicitet. MTS-assayet blev udført over 72 timer, med en enkelt tilsætning af aptameren i begyndelsen af ​​assayet, og målinger over perioden intervaller på 24, 48 og 72 timer. Der blev ikke observeret nogen ændring i cellelevedygtighed og cellevækst mellem cellerne, hvor aptamer tilsat, og kontrollen (se figur 3). Kun de aptamerer, der viste inhibering af invasion blev testet for cytotoksicitet, at undersøge, om den inhibitoriske virkning observeret skyldtes cytotoksicitet eller inhibering af heparanase. Aptamerer, der ikke hæmmer celle invasion tydeligvis ikke har nogen virkning på cellerne, og derfor var der ingen grund til at blive yderligere undersøgt for cytotoksicitet.

Tilstedeværelsen af ​​aptamer ved 1 mM koncentration viste sig at have nogen virkning på cellevækst i sammenligning med kontrolgruppen.

den korte anti-heparanase aptamer ikke binder væsentligt til serumproteiner

korte og lange aptamerer 1,5 M blev oprindeligt titreret trinvist i vand og fosfat pufferopløsning, pH 7,4 ved 37 ° C for at undersøge deres iboende fluorescens. Begge aptamerer har iboende fluorescens med toppe ved 380 nm, hvilket øger i fluorescens intensitet på en tilsvarende forøgelse af aptamer koncentration; den korte viser mindre fluorescens end det lange aptamer (figur 4A og B). Vand blev anvendt som et fortyndingsmiddel til at vise, at aptamer og ikke phosphatpufferopløsning var årsagen til fluorescens, selv om fluorescens for korte aptamer forøget ved hjælp phosphatbufferopløsning som fortyndingsmidlet. Men dette var sandsynligvis på grund af en forskel i pH som i fluorescensspektroskopi pH-ændringer har en væsentlig indflydelse på resultaterne.

fluorescensforøgelser upon forøge koncentrationen af ​​aptamer i både phosphat og vand, hvilket viser, at selv om fluorescens er højere i fosfat, aptameren er i virkeligheden årsagen og pH forskel i vand og PBS er den mest sandsynlige årsag til stigningen af ​​fluorescens af aptameren i PBS.

den korte aptamer var i stand til quenche fluorescensen af ​​HSA ved 37 ° C med 1,5% (± 0,03%) og 9% (± 1,2%) ved 1:100 og 1:10 molforhold henholdsvis med quenching af 10% opnås ved en molær koncentration 9,1 gange lavere end HSA (figur 5). Lang aptamer er i stand til at quenche fluorescensen af ​​HSA med 10% ved en koncentration 18,2 gange lavere end HSA, og med 2,4% (± 0,1%) og 16% (± 0,6%) ved 1:100 og 1:10 molforhold. Resultaterne viser, at både aptamerer kan quenche fluorescensen af ​​HSA, selvom den lange aptamer var mere effektiv. HSA quenching indikerer, at aptamerer nå sub domæne IIA, hvor dens eneste tryptofan er placeret. Denne tryptophanrest ligger på sted 214 i subdomæne IIA, inden for hvilket der er en stor hydrofob hulhed med mange argininrester nær overfladen [53], som har vist sig i forskellige undersøgelser for at tjene som forankringspunkter for aptamerer [54].

Excitation bølgelængde 290 nm, [HSA] = 6 uM. Excitationsbølgelængde ved 290 mM i en opløsning af natriumphosphat. Data er gennemsnittet af seks værdier viser ikke større standardafvigelse end 11%. Den quenching effekt er mere betydelig for lang end kort aptamer.

For at få flere oplysninger om type interaktion sted mellem de aptamerer og HSA blev UV spektrometri titreringer udført ved titrering stigende koncentrationer af korte og lange aptamerer og 6 uM HSA fortyndet i phosphatbuffer pH 7,4 som vist i figur 5. tilsætning af både aptamerer fosfat buffer og HSA steg den samlede absorbans, hvilket viser, at aptamer var ansvarlig for denne forøgelse snarere end HSA. Stigningen var mere udtalt for den lange aptamer på kort aptamer, og begge producerede et skift af den maksimale absorbans til venstre efter tilsætning af stigende koncentrationer af aptamer.

Skiftet observeret fra den korte aptamer (figur 6A ) flyttede 6 nm til venstre, hvilket antyder, at kun en lille konformationel ændring i proteinet blev forekommende [55] og derfor HSA quenching af denne aptamer er mest sandsynligt på grund af dynamisk quenching. Men i tilfældet med den lange aptamer (figur 6B), var ikke kun der et betydeligt skift i maksimal absorption med 20 nm til venstre, men der blev observeret en fuldstændig ændring i formen af ​​toppen, der inkorporerer toppen ved 260 nm af aptamer, hvilket antyder, at en kompleks blev dannet, og at quenching skyldtes den statiske quenching fænomen med lange aptamerer [55]. Foreslog således UV titreringer at den korte aptamer ikke danne et kompleks med HSA og at interaktionerne skyldtes dynamisk quenching, hvorimod den lange aptamer blev foreslået at danne en grundtilstand kompleks med HSA, i modsætning til andre aptamerer tidligere studeret, som også udviser specificitet og kompleksdannelse kun med deres målprotein [56]. Dette arbejde er blevet udvidet og vekselvirkninger aptamererne med serum proteiner og den særlige situation for deres interaktion er blevet beregnet og offentliggjort særskilt, da det ikke var inden for rammerne af denne artikel [57].

aptamerer er stabile i human serum

for at vurdere aptamererne egnethed som terapeutiske midler, var det nødvendigt at have en forståelse af, hvor stabil den umodificerede aptamerer ville være i kroppen, som, alene i blodbanen, er der mange nucleaser stand til at nedbryde de aptamerer. For således at verificere stabiliteten af ​​aptamererne i humant serum, har vi karakteriseret eventuelle nedbrydningsprodukter ved gelelektroforese. Sammenligning af bånd på gelerne i 1,5 M korte aptamer inkuberet i forskellige tidspunkter med humant og muse-serum, med den for aptamer viste kun, at 1,5 M korte aptamer ikke var underlagt nucleasenedbrydning fra humant serum som båndene ikke viste nogen udtværing eller falde i størrelse eller intensitet sammenlignet med kun aptamer, og dermed blev der ikke observeret nogen opdeling af aptamer til mindre fragmenter (data ikke vist). Med museserum, der var imidlertid et fald i primær band intensitet ved fem timers inkubationstid, hvilket antyder, at nukleaser har nedbrudt aptameren på det tidspunkt.

Discussion

I denne undersøgelse har vi udforsket potentialet i tidligere valgte aptamerer mod heparanase som lovende diagnostiske og terapeutiske midler mod kræft i mundhulen. Aptamererne blev tidligere vist at have høj affinitet mod heparanase og var funktionel i en Matrigel assay. På disse indledende undersøgelser blev det konstateret, at de længere aptamerer havde en højere affinitet for heparanase og de havde haft gode resultater i fluorescerende mikroskopi og Matrigel invasion assays. Men når vi undersøgte disse aptamerer på organotypisk invasion assay og analyseret deres potentiale til at blokere invasionen, blev det konstateret, at den korte aptamer var langt mere i stand til det, i forhold til sine lange modstykker. Dette blev også bekræftet af analysen ved RIA og EIA af nedbrydningsprodukterne af myoma væv, nemlig type III kollagen C- og N-terminale telopeptid hhv. 1,5 M Short og 1,5 m lang aptamerer bestå af samme variable region og faktisk den korte ene er en trunkeret version af den lange. Det fremgår imidlertid, at selv om den lange man har en lidt højere affinitet sandsynligvis på grund af øgede interaktioner mellem proteinet og primeren dele af aptamer, disse resulterede i at reducere evnen af ​​disse aptamerer at inhibere vævsinvasion. Tilstedeværelsen af ​​forskellige proteiner i selve væv, sammenlignet med Matrigel eksperimentet tidligere blev udført, kan være årsagen til dette, da den lange aptamer kan danne andre interaktioner med sådanne proteiner eller primeren haler kan have en sterisk hindring virkning på væv, som ikke er åbenbar i enklere matrigel model. Dette, i virkeligheden, blev bekræftet af undersøgelsen af ​​samspillet mellem de to aptamerer og serumproteiner. I disse undersøgelser blev det konstateret, at den lange aptamer dannet et kompleks med humant serumalbumin, hvorimod den korte aptamer ikke udgjorde en kompleks og viste kun et begrænset dynamisk quenching. I en yderligere undersøgelse [57], har vi modelleret interaktionerne mellem de korte og lange aptamerer med HSA og har identificeret, at faktisk lange aptamer danner et kompleks med serumalbuminer i en enkelt bindingssted, tæt på Trp 214 HSA eller 212 af BSA, ved underdomæne IIA af disse proteiner, i en positivt ladet hulrum foret med lysin- og argininrester [57]. Det er blevet påvist, at de kortere aptamer arter mangler evnen til at danne komplekser med serumproteiner og udstiller dermed højere specificitet for sit mål, hvilket berettiger vores valg af at bruge det i en hvilken som helst yderligere terapeutisk eller diagnostisk udvikling og er i overensstemmelse med de myoma data præsenteret i dette arbejde. Et andet vigtigt element i denne undersøgelse er påvisningen af, at post-SELEX modifikationer kan være mere gavnligt for aptamer udvælgelse end indledende skridt mod udvælgelse, hvor dette er muligt. I en række undersøgelser med forskellige metoder til påvisning, har aptamer affinitet for deres mål blevet sammenlignet med for albumin.