PLoS ONE: Dicer Regulerer Differentiering og levedygtighed under Mouse kræft i bugspytkirtlen Initiation

Abstrakt

miRNA niveauer er ændret i pancreas duktalt adenokarcinom (PDA), den mest almindelige og dødelige bugspytkirtlen malignitet, og intakt miRNA behandling er afgørende for afstamning specifikation under pancreasudviklingen. Men rollen som miRNA forarbejdning i PDA ikke er blevet udforsket,. Her studerer vi rollen som miRNA biogenese i PDA udvikling ved at slette miRNA behandling enzymet Dicer i en PDA musemodel drevet af onkogene Kras. Vi finder, at tabet af Dicer accelererer Kras drevet acinære dedifferentiation og acinære at duktalt metaplasi (ADM), en proces, der har vist sig at gå forud for og fremme specifikationen af ​​PDA forstadier. Men ubegrænset ADM viser, også høje niveauer af apoptose. Dicer tab ikke accelerere udviklingen af ​​Kras drevne PDA forstadier eller PDA, men overraskende, vi observerer, at mus PDA kan udvikle sig uden Dicer, selv på bekostning af proliferativ kapacitet. Vores data tyder på, at intakte miRNA behandling er involveret i både begrænsende pro-tumorigene forandringer i bugspytkirtlen differentiering samt fastholde levedygtighed under PDA initiering

Henvisning:. Morris JP IV, Greer R, Russ HA, von Figura G, Kim GE, Busch A, et al. (2014) Dicer Regulerer Differentiering og levedygtighed under Mouse kræft i bugspytkirtlen Indvielse. PLoS ONE 9 (5): e95486. doi: 10,1371 /journal.pone.0095486

Redaktør: Murray Korc, Indiana University School of Medicine, USA

Modtaget: Januar 3, 2014 Accepteret: 26 marts 2014; Udgivet: 1. maj 2014

Copyright: © 2014 Morris et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejde i Matthias Hebrok Group blev støttet af en bevilling fra AACR kræft i bugspytkirtlen Action Network. www.pancan.org. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pankreatisk duktalt adenokarcinom (PDA), synes at udvikle sig gennem en serie af duktale forstadielæsioner, herunder den mest almindelige type, pancreas intraepitelialneoplasi (Panin). Både PanINs og PDA udstiller Kras mutationer, som kan være et igangsættende begivenhed. Mus modeller understøtter dette begreb som en målrettet og vedholdende udtryk for mutant Kras i musen bugspytkirtlen epitel både rekapitulerer den Panin til PDA sekvens observeret hos mennesker, og er nødvendig for vedligeholdelse sygdom [1], [2], [3]. Evidens fra musemodeller antyder, at mutant Kras kan bidrage til PDA initiering ved omprogrammering acinære celler ind i en kanal som afstamning stand til at blive PanINs via en proces betegnet acinære til duktalt metaplasi (ADM) [4], [5], [6]. Denne evne til at ændre pancreas plasticitet kan være et vigtigt skridt i PDA initiering, som acinære celler er blevet vist at være dramatisk mere følsomme over for Kras afhængig Panin udvikling sammenlignet med ventilationskanal celler [7]. Da forsøg på direkte hæmning af onkogene Kras har generelt været mislykket [8], der definerer kritiske formidlere af pro-tumorigen differentiering og levedygtighed nedstrøms for mutant Kras kan repræsentere alternative behandlingsmetoder.

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små, ikke-kodende RNA, der regulerer genekspression post-transkriptionelt. Aberrant miRNA niveauer er forbundet med tumorudvikling, og føre til uhensigtsmæssig ekspression af onkogener og tumor suppressorer [9]. Cancer associeret miRNA niveauer resultat af misexpression af specifikke miRNA samt deregulering af miRNA biogenese pathway [10]. miRNA er generelt nedreguleret i humane kræftformer [11], og hæmmede miRNA behandling fremmer tumorigenese [12]. tab af miRNA behandling kan imidlertid være uforeneligt med udviklingen af ​​visse tumorer [13], [14], [15], hvilket tyder på, at kritiske tærskelværdier for miRNA behandling kan være involveret i at opretholde levedygtigheden under transformation. Mens miRNA er fejl-udtrykt i PanINs og PDA, og er kendt for at regulere veje, der bidrager til PDA initiering og progression [16], [17], [18], [19], den rolle, som miRNA behandling spiller i PDA udvikling har ikke været undersøgt.

Ved at slette miRNA-enzym Dicer i en Kras drevet musemodel af PDA, finder vi, at miRNA behandling regulerer både differentiering og levedygtighed under Kras drevet bugspytkirtlen transformation. Dicer sletning fremmer Kras drevet tab af acinære identitet og ADM, men også resulterer i øgede niveauer af apoptose og nedsat ekspression af gener impliceret i at opretholde levedygtigheden under Panin udvikling og i PDA. Overraskende, finder vi, at mus PDA kan udvikle sig i fravær af Dicer, men med nedsat proliferation. Tilsammen har dette arbejde tyder på en kritisk rolle for miRNA forarbejdning i Kras drevet PDA indvielse.

Resultater

Dicer Loss Accelererer Kras Driven Ductal Metaplasi

Dicer sletning i begyndelsen bugspytkirtlen progenitorer resultater i bugspytkirtlen agenesi og postnatal død [20]. Derfor testede vi, om en særskilt Pdx1 drevet Cre stammen,

Pdx1-Cre

Sent

, tilladt bugspytkirtlen udvikling i fastsættelsen af ​​tabet af Dicer funktion.

Pdx1-Cre

Sent

resulterer i forsinket udviklingsmæssig aktivitet i forhold til Pdx1-Cre driver ansat af Lynn

et al

, hvilket resulterer i rekombination i et mere begrænset sæt af voksne celler, specielt fleste acini, nogle endokrine celler og sjældent i kanalen celler [21]. Tyder tidsmæssige krav til Dicer i bugspytkirtlen udvikling,

Pdx1-Cre

Sent; Dicer

flox /flox Hotel (

Dicer

Homo

) mus trivedes og vises groft normal pancreas udvikling på p0 selv i forbindelse med faldt betydeligt Dicer udtryk i forhold til kontrol

Pdx1- Cre

Sent; Dicer

flox /+

mus (

Dicer

Het

) (Figur S1 A, B, E).

Ved 3 ugers alderen, acini, kanaler, og holme var genkendelig i

Dicer

Homo

mus (figur 1A), selv om der var nogle eksokrine områder med nedsat eosin farvning. Immunofluorescens viste normalfordeling af acinære markør amylase, kanalen markør CK19, og β-cellemarkør insulin (figur 1B). Eksokrine morfologi var forstyrret dog, som vi ofte fundet uorganiseret acini med små, fragmenterede celler ikke påvises i kontroller (figur 1B, figur S2), svarende til uorganiserede acinarceller observeret i somatiske Dicer hypomorphs [22]. Pancreas masse i

Dicer

Homo

mus blev også reduceret (figur 1D) i fastsættelsen af ​​nedsat Dicer udtryk (figur 1C). På trods af de ændringer i morfologi, vi ikke observere celler co-udtrykker amylase og forhøjede niveauer af CK19 som observeret i acinære celler undergår Kras drevet ADM (figur S3), hvilket tyder på, at de uorganiserede acinære celler ikke var aktivt under ADM.

(A). Hematoxylin og Eosin (H Dicer

Homo

n = 14). (E). H Dicer

Het

Kras; Dicer

Homo

mus. Mellemværker: E-venstre, Sjælden fokus på metaplasi og Panin; højre, duktalt metaplasi i

Kras; Dicer

Homo

mus. Scale bar 100 pm. (F) Immunhistokemi for amylase, Sox9, CK19 i 3 uger gammel

Kras; Dicer

Het

Kras; Dicer

Homo

mus. Scale bar 100 uM

For at teste effekten af ​​Dicer tab på Kras kørt bugspytkirtlen transformation, vi genererede

Pdx1-Cre

Late.; LSL-Kras

G12D; Dicer

flox /flox Hotel (

Kras, Dicer

Homo

) mus. Ligesom andre modeller rettet mod mutant Kras til embryonale bugspytkirtlen,

Pdx1-Cre

Sent; LSL-Kras

G12D

mus gradvist udvikle ADM samt PanINs, med PDA opstår i nogle dyr efter lang ventetid [23]. Svarende til sådanne modeller [1], ved 3 ugers alderen, pancreas masse i

Pdx1-Cre

Late; LSL-Kras

G12D; Dicer

flox /+ Hotel (

Kras, Dicer

Het

) mus var lidt, men betydeligt, steget i forhold til

Dicer

Het

mus (Figur 1D ). Den eksokrine rum i

Kras; Dicer

Het

mus dukkede groft normal, overvejende består af amylase-positive acinære celler, med sjældne områder af amylase negativ ADM og lav kvalitet PanINs udtrykker moderate til høje niveauer af CK19 og Sox9 (figur 1F), duktal /pancreas embryonale progenitor markører karakteristiske for Kras drevet ADM og Panin dannelse [6]. I modsætning hertil

Kras; Dicer

Homo

pancreas viste nedsat Dicer udtryk (figur 1C), var atrofisk (Figur 1D), og besad udbredt udskiftning af eksokrine rum med metaplastiske kanal strukturer ligner sjældne ADM i

Kras; Dicer

Het

mus (figur 1E). Duktalt metaplasi i

Kras; Dicer

Homo

mus viste nedsat udtryk for amylase, lav til moderat udtryk for CK19 og stærk udtryk for Sox9 (figur 1F). Sox9 akkumulering blev også observeret i konstruktioner bibeholder nogen acinar morfologi (figur 1F). Duktalt metaplasi blev ikke observeret ved p0 i

Kras; Dicer

Homo

mus (Figur S1D), hvilket antyder, at Dicer mangel i forbindelse med mutant Kras ikke blokerer embryonisk acinære udvikling, og ADM sker mellem fødsel og 3 ugers alderen. Derfor Dicer tab i forbindelse med mutant Kras dramatisk accelererer ADM, en proces, der har vist sig at både forud for og fremme Kras drevet Panin formation [4], [6], [24].

Dicer Loss kompromiser acinar Identitet og Fremmer Kras Driven acinar til Ductal Omprogrammering

for at undersøge, hvorfor

Kras; Dicer

Homo

mus gennemgår accelereret Kras drevet ADM, vi spurgte, om Dicer mangelfuld acinarceller uhensigtsmæssigt vise egenskaber forbundet med ADM, såsom markører for acinar stress og tab af acinære identitet. At fokusere på celler, der havde undergået Cre rekombination vi inkluderet en Cre inducerbart YFP allel udtrykt betinget fra Rosa26 locus (

R26-EYFP

). YFP farvning afslørede, at både eksokrine rum i

Pdx1-Cre

Sent; Dicer

flox /flox; R26-EYFP

(

Dicer

Homo; YFP

) mus og ADM i

Pdx1-Cre

Sent; LSL-Kras

G12D; Dicer

flox /flox; R26-EYFP Hotel (

Kras, Dicer

Homo, YFP

) mus stammer fra celler, hvor Cre var aktiv, og ikke fra en udvidelse af en un-rekombineret population (figur 2B, D).

(A-D) Clusterin (blå) og YFP (grøn) farvning i 3 uger gammel

Dicer

Het; YFP Hotel (A),

Dicer

Homo; YFP

(B),

Kras; Dicer

Het; YFP

(C), og

Kras; Dicer

Homo; YFP

mus (D). Scale bar 100 uM (E) RT-PCR analyse af Dicer, miRNA-141 og 216b (til venstre), acinære beriget gener Amylase og Mist1 (i midten), og kanalen beriget gener CK19 og Sox9 (til højre) i YFP +, CD49f +, CD133- celler fra

Dicer

Het; YFP

(n = 4),

Dicer

Homo; YFP

(n = 4),

Kras; Dicer

Het; YFP

(n = 3), og

Kras; Dicer

Homo; YFP

(n = 3) mus. Middelværdi ± standardafvigelse. P-værdier er beregnet ud fra to-tailed, uparrede t-test sammenligner

Dicer

Het

Dicer

Hom °

CK19 og Sox9 udtryk værdier.

for at afgøre, om Dicer tab førte til acinære stress i forbindelse med ADM, vi undersøgte udtryk for clusterin, en markør for stresset, de-differentieret acini [6], [25]. Clusterin var primært fraværende i YFP + acinære celler af kontrol

Dicer

Het; YFP

Kras; Dicer

Het; YFP

mus, men var til stede i sjældne YFP + ADM i

Kras; Dicer

Het; YFP

dyr (figur 2A, C). Tyder på, at Dicer mangelfuld celler er under stress observeret i ADM, clusterin var ikke kun ensartet observeret i YFP + ADM i

Kras; Dicer

Homo; YFP

mus, men også i vid udstrækning udtrykt i YFP + acinære celler i

Dicer

Homo; YFP

dyr (figur 2B, D).

For at teste, om acinar stress svarede med nedsat acinære identitet, vi ændret en sortering protokol tidligere udviklet til isolering af bugspytkirtlen forfædre [26] for at specifikt adskille differentieret acinære og duktale celler. Vi fandt, at i den voksne pancreas, voksen acini og kanalerne udtrykke epitel markør CD49f, mens differentierede kanaler også udtrykker CD133 (fig s4b, C). RT-PCR for

Amylase

Mist1

, og

CK19

Sox9

, beriget med acinære og kanal- celler, afslørede, at sortering Based på CD49f og CD133 tilladt for effektiv adskillelse af disse populationer (figur S4A, 4D). Angivelse af Notch effektorer Hes1, Hey1, og Hey2, begrænset til centroacinar og terminal kanal celler i den voksne pancreas [27], viste sig at adskille med CD49f + CD133 + kanal population (Figur S4E).

YFP +, CD49f + CD133- celler blev sorteret fra alle 4 genotyper. Ved 3 ugers alderen Dicer niveauer og udtryk for 2 rigeligt udtrykte miRNA blev reduceret betydeligt i celler sorteret fra

Dicer

Homo; YFP

Kras; Dicer

Homo; YFP

mus sammenlignet med kontroller med og uden Kras (figur 2E venstre). For at bestemme virkningen af ​​Dicer tab på exokrin differentiering, analyserede vi ekspressionen af ​​acinære markører Amylase og Mist1 og kanalsystemer markører CK19 og Sox9, i YFP +, CD49f + CD133- celler. Sorteret celler fra

Dicer

Homo; YFP

mus de viste faldet betydeligt udtryk for

Amylase

og beskedent faldt

Mist1

sammenlignet med celler fra

Dicer

Het; YFP

mus (Figur 2E midten). Selvom udtryk for markører for acinære differentiering blev reduceret, har vi ikke observere en konsekvent stigning i de duktale markører

CK19

eller

Sox9

i disse celler (figur 2E højre), svarende til den manglende udbredt CK19 misexpression bemærket i figur 1D. I CD49f + CD133- celler fra

Kras; Dicer

Homo; YFP

mus dog

Amylase

Mist1

udtryk blev yderligere reduceret, og

CK19

Sox9

udtryk blev øget, sammenlignet med celler . fra alle andre genotyper, i overensstemmelse med histologisk stigning i ADM

Interessant, vi også observeret en beskeden, men ikke statistisk signifikant, tendens til reduktion i Mist1 udtryk i celler sorteret fra

Kras; Dicer

Het; YFP

mus sammenlignet med

Dicer

Het; YFP

kontroller, hvilket tyder på, at mutant Kras alene kan begynde at gå på kompromis acinar identitet, før induktion af duktale gener eller morfologi. Tilsammen har dette data antyder, at Dicer tab kompromiser acinære identitet og inducerer en stresset tilstand, der accelererer Kras drevet duktalt omprogrammering og ADM.

Dicer Tab ikke Accelerate Panin eller PDA udvikling

Tab af acinære identitet og ADM accelererer Panin udvikling [6], [24], [28], [29] og accelereret ADM og Panin udvikling, fremkaldt af akut og kronisk pancreatitis for eksempel, kan resultere i nedsat PDA latenstid [30], [31] , [32]. Derfor forventede vi at observere hurtigere Panin og PDA udvikling i

Kras; Dicer

Homo

mus sammenlignet med kontrol

Kras; Dicer

Het

mus. Trods den dramatiske forskel i ADM observeret ved 3 uger i

Kras; Dicer

Homo

forhold til

Kras; Dicer

Het

mus, kvantificering af Panin læsioner i en lille gruppe af mus på 9 uger, viste ingen statistisk signifikant forskel i hyppigheden af ​​Alcian Blå positive duktale læsioner, hvilket tyder på, at Dicer tab ikke accelerere Panin udvikling (figur 3A , B, C). Langsigtet sygdomsprogression også konvergerede uafhængig af betinget Dicer status. Vi fandt ingen statistisk signifikant forskel i overlevelse af en lille gruppe af alderen

Kras; Dicer

Homo

Kras; Dicer

Het

mus (Median overlevelse 336 versus 441,5 dage, χ

2 = 0,2271, p = 0,6637, beregnes ved hjælp af Logrank test) (figur 3F). 6/7 af

Kras; Dicer

Het

mus udviklede lokalt eller udbredt invasiv PDA, der var generelt moderat differentieret, men omfattede en udifferentieret kræft. 4 ud af 6

Kras; Dicer

Homo

mus udviklede moderat differentieret, lokalt eller udbredt invasiv, PDA med tilsvarende hyppighed af metastaser og cellulær morfologi (figur 3D, E, tabel S1).

(A-B) Repræsentant Alcian Blå farvning på 9 uger i

Kras; Dicer

Het Hotel (A) og

Kras; Dicer

Homo

mus (B). f: fedt. Scale bar 100 pm. C, Kvantificering af Alcian Blue positive læsioner af 9 uger gammel

Kras; Dicer

Het

Kras; Dicer

Homo

mus. Linjer angiver middel. P-værdi beregnet ud fra en to-halet, uparret t-test. (D, E) Repræsentant histologi af PDA fra

Kras; Dicer

Het

(D) og

Kras; Dicer

Homo

mus (E). Scale bar 100 pm. (F) Overlevelse kurve af

Kras; Dicer

Het

(n = 7) og

Kras; Dicer

Homo

(n = 6) mus.

Dicer slettede celler er blevet vist at blive udkonkurreret af ikke-rekombinerede celler i andre endoderm afledte organer, i leveren for eksempel [33] og eliminering af rekombinerede celler kan bidrage til manglende forventet forskel i sygdomsprogression i

Kras; Dicer

Homo

versus

Kras; Dicer

Het

mus. I modsætning til den 3 ugers tidspunktet, når normale acinære celler var meget mindre hyppige i

Kras; Dicer

Homo

versus

Kras; Dicer

Het

mus, betydelige områder af normal acinære væv blev fundet i Kras; Dicer

H

o

m

o

mus på dette tidspunkt (figur 3A, B). Vi bemærkede også tilstedeværelsen af ​​fedt erstatter bugspytkirtlen væv i nogle

Kras; Dicer

Homo

dyr (figur 3b). Undersøgelse af væv YFP distribution i bugspytkirtlen af ​​

Kras; Dicer

Het; YFP

versus

Kras; Dicer

Homo; YFP

dyr viste en bemærkelsesværdig nedgang i YFP fordeling på 9 uger (Figur S5), hvilket tyder på repopulation med celler, der ikke havde undergået rekombination. På trods oprindeligt fremme ADM, der normalt accelererer Panin og PDA udvikling, PDA progression er ikke væsentligt forbedret i fravær af Dicer og kan være forbundet med selektion mod Dicer mangel.

Dicer Loss Compromises levedygtighed under Kras Driven ADM

Dicer tab fører til øget apoptose i en række endodermale organer (f.eks leveren og tarmen [33], [34] for at imødegå, hvis den manglende forudsagt acceleration af Panin udvikling i

Kras, Dicer

Homo

mus kan indebære øget celledød, reviderede vi TUNEL + /YFP + celler ved 3 ugers alderen i modsætning til de sjældne dobbelt positive celler i

Dicer

Het;. YFP

Kras, Dicer

Het; YFP

mus,

Dicer

Homo;. YFP

mus viste en højere relativ hastighed på TUNEL + /YFP + celler (figur 4B, E) Desuden fandt vi en yderligere stigning i dobbelt positive celler i

Kras, Dicer

Homo; YFP

mus sammenlignet med

Dicer

Het; YFP

Kras; Dicer

Het; YFP

mus (figur 4D, E). Interessant, Dicer tab syntes at virke synergistisk med mutant Kras at fremme celledød, som

Kras; Dicer

Homo; YFP

mus udviste betydeligt mere apoptose end

Dicer

Homo; YFP

celler (Figur 4E). Derfor, mens intakt Dicer behandling begrænser Kras drevet acinære at duktalt omprogrammering, kan det være nødvendigt nogle Dicer afhængige signaler for at opretholde levedygtigheden under Kras drevet metaplasi.

(A-D) TUNEL (blå) og YFP (grøn) farvning i 3 uger gammel

Dicer

Het; YFP Hotel (A),

Dicer

Homo; YFP

(B),

Kras; Dicer

Het; YFP

(C), og

Kras; Dicer

Homo; YFP

mus (D). Scale bar 100 pm. E. Kvantificering af TUNEL + YFP + celler i (A-D). Middelværdi ± standardafvigelse.

Dicer

Het; YFP

(n = 3),

Dicer

Homo; YFP

(n = 4),

Kras; Dicer

Het; YFP

(n = 3), og

Kras; Dicer

Homo; YFP

mus (n = 4). P-værdi beregnet ud fra en to-halet, uparret t-test af TUNEL + YFP + celler i

Dicer

Homo; YFP

Kras; Dicer

Homo; YFP

mus. F. Acinar beriget og levedygtighed forbundet gener fra ekspressionsanalyse (venstre). RT-PCR-analyse af Nupr1, Agr2, Itih4, og Reg3b i acinære berigede celler fra

Dicer

Het; YFP

(n = 4),

Dicer

Homo; YFP

(n = 4),

Kras; Dicer

Het; YFP

(n = 3), og

Kras; Dicer

Homo; YFP

(n = 3) mus (højre). Middelværdi ± standardafvigelse. P-værdi beregnet ud fra en to-halet, uparret t-test, som sammenligner Agr2 ekspression i sorterede celler fra

Dicer

Het; YFP

Kras; Dicer

Het; YFP

mus.

Vi udførte udtryk analyse til screening for Dicer afhængige faktorer potentielt involveret i at opretholde levedygtigheden under Kras drevet ADM. For bedre at synkronisere ADM i

Kras; Dicer

Het

Kras; Dicer

Homo

mus, vi udnyttet caerulein induceret pancreatitis. Som forudsagt ud fra tidligere studier [6], caerulein behandling i kontrol, 3 uger gammel

Kras; Dicer

Het

mus førte til udviklingen af ​​kanalen lignende strukturer 2 dage efter behandling (fig S6A), og udbredt erstatning af exokrine rum med ADM, PanINs, og fibrose, 21 dage efter behandling (fig S6c). Spejling manglen på accelereret Panin udvikling mellem 3 og 9 uger i

Kras; Dicer

Homo

mus (figur 3F), observerede vi mindre metaplasi og betydeligt mere normalt acinære væv 21 dage efter caerulein behandling i

Kras; Dicer

Homo

mus (Figur S6D). RNA-Seq Analyse af samlet RNA fra FACS isoleret YFP +, CD49f +, CD133- acinære celler fra 3 uger gammel

Kras; Dicer

Het; YFP Hotel (3 mus) og

Kras; Dicer

Homo; YFP Hotel (5 mus) mus 2 dage efter caerulein (figur S6E) afslørede ~120 gener betydeligt nedreguleret mellem mutant og kontrol. Støtte til observation, at tabet af Dicer kompromitterer acinære differentiering, 42 gener, der er forbundet med terminalt differentierede acinære celler var signifikant nedreguleret (Figur 4F, tabel S2, komplette datasæt Tabel S3). Også reduceret var gener impliceret i at opretholde levedygtigheden under regenerering eller tumorigenese, herunder Nupr1 /P8, Agr2, Itih4, og medlemmer af REG3 protein familien (Figur 4F, tabel S2). Senest både Nupr1 og Agr2 er blevet vist, at være overudtrykt under Panin-PDA progression og at spille en rolle i Panin udvikling og opretholdelse PDA levedygtighed [35], [36], [37]. REG3 familie proteinekspression aktiveres som reaktion på pancreatitis [38], og familiemedlem Reg3b (også kendt som PAP1) specifikt er impliceret i opretholdelsen acinære levedygtighed og kan fungere nedstrøms for Nupr1 [39], [40]. Selvom Itih4 ikke har været impliceret i PDA udvikling er det blevet vist at være involveret i at opretholde levedygtigheden nedstrøms for den kritiske PDA mediator c-myc [41] i en model for leverkræft [42]. RT-PCR-analyse af disse kandidatgener i sorteret acini fra 3 uger gamle mus afslørede, at deres ekspression omvendt korreleret med apoptose (figur 4F, højre). Nupr1, Agr2, Itih4, og Reg3b udtryk blev reduceret i sorterede celler fra

Kras; Dicer

Homo; YFP

mus sammenlignet med kontrol

Dicer

Het; YFP

Kras; Dicer

Het; YFP

dyr. Også Agr2, Itih4, og Reg3b udtryk blev reduceret i sorterede celler fra

Dicer

Homo; YFP

mus sammenlignet med kontroller. Interessant, Agr2 var også signifikant forøget i celler sorteret fra

Kras; Dicer

Het; YFP

mus sammenlignet med celler fra

Dicer

Het; YFP

mus, hvilket antyder, at Kras kan bidrage til Agr2 opregulering selv før ADM forekommer. Derfor er Dicer udtryk kræves til vedligeholdelse af den modne acinære differentiering tilstand og for ekspression af pro-levedygtighed gener under Kras drevet ADM.

Mus PDA kan udvikle i fravær af Dicer

Dicer niveauer har vist sig at være vigtige regulatorer af tumorigenese, der fungerer som en haploinsufficient tumorsuppressor i forbindelse med mutant Kras i både lungetumorer og sarcomer samt i retinoblastoma [13], [14]. Imidlertid tumorer i disse modeller synes at resultere af celler som har bevaret ekspression af mindst én ikke-rekombinerede betinget allel. At afgøre, om Dicer manglende celler var i stand til at bidrage til Kras drevet PDA vi testede Dicer udtryk og genomisk rekombination fra 3 PDA cellelinjer genereret fra

Kras; Dicer

Het

Kras; Dicer

Homo

mus. Ved RT-PCR observerede vi lignende Dicer udtryk i alle tre PDA cellelinjer afledt

Kras; Dicer

Het

mus (figur 5A). På grund af den høje apoptose observeret ved 3 ugers alderen, den reducerede ekspression af gener, der understøtter Panin udvikling, og manglen på accelereret sygdomsprogression, forventede vi at observere fastholdelse af mindst en allel i PDA linjer afledt

Kras; Dicer

Homo

PDA. Overraskende, fandt vi, at en linje dramatisk de viste nedsat Dicer udtryk, mens de to resterende linjer udtrykkes enten en lignende eller højere, niveau som

Kras; Dicer

Het

afledte linjer. Allelspecifik PCR viste, at Dicer rekombination korrelerede direkte med ekspression (figur 5B: “Undel”, ingen betinget Dicer allel rekombination; “Hemi”, rekombination af en allel; “Homo”, rekombination af begge alleler). RT-PCR for 3 modne miRNA rapporteret at være overudtrykt i humane PDA [43], [44], viste reduktion i alle 3 miRNA i den homozygote udgår linje til under 95% af det, som udtrykkes i slettede linie (figur 5C) . Derfor Kras drevet PDA i musen synes i stand til at unddrage sig negativ selektion under sygdom initiering og udvikle sig i fravær af Dicer. Som forudsagt af modeller, der viser, at nedregulering, men ikke fuldstændig tab af miRNA behandling, kan forbedre tumorigenese [12], [13], den hemizygote slettede linie voksede hurtigst, mens den homozygot slettes linjen langsomste (figur 5D). Alle 3 cellelinjer var også i stand til at danne tumorer, når implanteret subkutant i immune defekte mus, med kinetik spejling af cellekultur vækstrater (Figur 5E). Allelspecifik PCR viste, at tumorer ikke skyldtes celler der undergik spontan rekombination (UnDel, Hemi), eller fra en kontaminerende subpopulation af Dicer kompetente celler (Homo), selvom vi observere tilstedeværelsen af ​​WT Dicer amplikon i tumorer afledt af Hemi og Homo linjer, tegn på host stromale rekruttering (figur 5F). Skønt Dicer elimination svækker levedygtighed i de tidligste stadier af Kras drevet neoplasi, tab af Dicer er ikke gensidigt udelukkende med bugspytkirtlen transformation.

A. Dicer RT-PCR i PDA cellelinjer frembragt fra

Kras; Dicer

Het

(blå) og

Kras; Dicer

Homo

(rød) mus. Hver søjle repræsenterer data fra 3 uafhængige brønde af hver cellelinie. Middelværdi ± standardafvigelse. B. PCR påvisning WT, ikke-rekombinerede (UNREC), og slettes (DEL) Dicer genomisk locus i cellelinjer fra A. Controls er amplificeret DNA fra muse embryonale fibroblaster (MEF’er) af angivet Dicer genotype efter adenoviral Cre behandling. C. miRNA QPCR for miRNA-16, 107, 191 i cellelinjer afledt fra

Kras; Dicer

Homo

mus. Hver bjælke repræsenterer 3 uafhængige brønde af hver cellelinie. Middelværdi ± standardafvigelse. D. Vækst af PDA cellelinjer afledt

Kras; Dicer

Homo

mus. Hvert punkt repræsenterer værdier fra 3 uafhængige brønde. Middelværdi ± standardafvigelse. P-værdi beregnet ud fra en to-halet, uparret t-test, som sammenligner antallet af celler efter 72 timer i kulturer af Undel og Homo celler. E. Subkutan tumorvækst i PDA cellelinjer afledt

Kras; Dicer

Homo

mus. Middelværdi ± standardafvigelse ved hvert tidspunkt. Undel (n = 7), Hemi (n = 7), Homo (n = 12). F. PCR påvisning WT, UNREC, og DEL Dicer genomisk locus i subkutane tumorer på tidspunktet for ofre i E. Controls er Dicer

fl

o

x /+ MEF’er behandlet med adenoviral Cre som i B. Tumor DNA’er der forud ved amplifikation af DNA fra parentale cellelinjer.

Discussion

Dicer funktion er afgørende for udviklingen af ​​adskillige organer, herunder endoderm-afledte væv, såsom lever og gut [33], [34]. Vedligeholdelse af Dicer udtryk i begyndelsen af ​​Pdx1 positive bugspytkirtlen forfædre er nødvendig for udvikling af både pancreas eksokrine og endokrine rum [20]. Her finder vi, at Dicer funktion forbliver vigtigt hele pancreas udvikling og spiller en rolle i reguleringen af ​​acinære identitet og levedygtighed. Vores model benytter en chauffør linje, der initierer Dicer rekombination i udviklingslandene bugspytkirtlen på et senere fosterstadiet end Cre-driveren bruges af Lynn og kolleger [21]. Vi observerer minimale brutto virkninger på bugspytkirtlen udvikling, hvilket tyder på stage følsomme krav til miRNA behandling vedrørende etablering og udvidelse eksokrine og endokrine stamfædre. Men de acinære celler, der udvikler er ustabile både med hensyn til deres terminal differentiering og levedygtighed. Elementer af acinar identitet er nedreguleret, og celle stress og apoptose er både øget. Derfor kompetent miRNA behandling synes at være vigtig, selv i den modne eksokrine rum.

Fordi Dicer sletning i denne model tillader pancreas udvikling, vi var i stand til at udforske rolle Dicer funktion i Kras medieret PDA udvikling. Musemodeller har afsløret, at oncogene Kras kan fungere som en “master regulator” PDA udvikling, oprettelse slægter, der kan give anledning til PanINs og PDA og resterende kritisk for progression [1], [2], [3]. Betydelig tyder på, at acinære celler kan give anledning til PanINs ved at undergå ADM, en proces, hvor acinære celler mister terminal differentiering på bekostning af en de-differentieret, kanal lignende tilstand [4], [5], [6], [7 ]. Kras drevet ADM sker gradvist, men kan fremskyndes ved at gå på kompromis acinære differentiering. Påvirkninger såsom pankreatitis, som forårsager regenerering associeret dedifferentiering [6], [45], aktivering af progenitor forbundet pathways (f.eks Notch [24]), og inaktivere gener, der opretholder acinar tilstand [28], [29], [46] alle dramatisk accelerere Kras drevet ADM og Panin udvikling. Derfor kan tab af acinære identitet være en afgørende hindring for Kras afhængig specifikation af acinære afledt PDA forstadier. Vores data tyder på, at tabet af Dicer funktion fjerner differentiering barriere for Kras drevet ADM. ADM sker efter 3 uger i

Kras;