PLoS ONE: Mutation eller Tab af p53 differentielt Ændrer TGF Action i æggestokkene Cancer

Abstrakt

Kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske sygdom, der påvirker kvinder i USA. Den Cancer Genome Atlas Network identificeret p53 mutationer i 96% af high-grade serøse ovariecarcinomer, viser sin afgørende rolle. Derudover transformerende vækstfaktor Beta (TGFp) pathway er dysfunktionel i forskellige maligniteter, herunder ovariecancer. Dette studie undersøgte hvordan ekspression af vildtype, mutant eller fraværet af p53 ændrer ovariecancer cellereaktion på TGFp signalering, samt svaret fra æggestokkene overflade epitel og æggelederen epitel til TGFp. Kun ovariecancerceller udtrykker vildtype p53 blev vækst inhiberes af TGFp, mens ovariecancerceller der var mutant eller null p53 ikke var. TGFP inducerede migration i p53 null SKOV3 celler, som ikke blev observeret i SKOV3 celler med stabil ekspression af mutant p53 R273H. Knockdown af vildtype p53 i OVCA 420 ovariecancerceller forbedrede cellemigrering som respons på TGFp. Øget protein udtryk for DKK1 og TMEPAI, to pro-invasive gener med forøget ekspression i sent stadium metastatisk kræft i æggestokkene, blev observeret i p53 knockdown og nul-celler, mens celler stabilt udtrykker mutant p53 viste lavere DKK1 og TMEPAI induktion. Ekspression af mutant p53 eller tab af p53 tillade fortsat proliferation af æggestokkene cancercellelinier i nærvær af TGFp; dog celler, der udtrykker mutant p53 udviser reduceret migration og nedsat protein niveauer af DKK1 og TMEPAI

Henvisning:. Ó hAinmhire E, Quartuccio SM, Cheng W, Ahmed RA, kong SM, Burdette JE (2014) Mutation eller Tab af p53 Differentielt Ændrer TGF Action i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (2): e89553. doi: 10,1371 /journal.pone.0089553

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: 12. september 2013; Accepteret: 21 januar 2014; Publiceret: 20 feb 2014

Copyright: © 2014 Burdette et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist understøttet af tilskud fra Liz Tilberis æggestokkene Cancer Research Fund L /T /UIC /0.1.2011, Vahlteich Award fra UIC College of Pharmacy og American Cancer Society Research Scholar Grant Illinois Division RSG-12-230-01-TBG . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den femte hyppigste årsag til kræft død og den mest dødbringende gynækologisk sygdom blandt amerikanske kvinder. I 2013 vil en anslået 22,240 tilfælde af kræft i æggestokkene blive diagnosticeret, hvilket resulterede i 14,030 dødsfald [1]. Den høje dødelighed kan tilskrives det faktum, at over 60% af ovariecancere vil blive diagnosticeret efter, at sygdommen har spredt sig til fjerne steder. Når spredt sig, de fem-årige overlevelsesrate falder til under 30% [1]. Ineffektivitet af diagnose skyldes primært en manglende forståelse af de initierende hændelser og mekanismer progression, der giver anledning til kræft i æggestokkene, med få afsløring strategier tidlige [2]. Vigtigere, hvis ovariecancer er diagnosticeret tidligere, kan overlevelsesrater være så højt som 90% [1]. Disse statistikker viser det grundlæggende behov for bedre at forstå tidlige mekanistiske begivenheder på kræft i æggestokkene, der vil hjælpe med tidligere diagnose og bedre prognose for patienterne.

tumorsuppressor p53 er det mest almindeligt muterede gen i alle menneskelige kræftformer [2] . p53 er en transkriptionsfaktor, der styrer mange cellulære funktioner, såsom cellecyklus, apoptose og respons på DNA beskadigelse [3]. De fleste

TP53

mutationer er missense mutationer, hvor en enkelt nukleotid basis substitution resulterer i enten dysfunktion eller fravær af p53-aktivitet [4]. Disse mutationer fører til forøget proliferation, invasion og metastase i mange cancere [5]. Den Cancer Genome Atlas Network (CGAN) identificerede p53 som værende muteret i op til 96% af kemoterapi-resistente, high-grade serøse ovariecancer, hvilket indikerer en væsentlig rolle for p53 mutationer i serøs ovariecancer [6]. Desuden Internationale agentur for kræftforskning (IARC)

TP53

database viser, at den hyppigste p53 mutation i serøs kræft i æggestokkene er en arginin til histidin konvertering ved aminosyrerest 273 (R273H) inden for DNA-bindende domæne , der tegner sig for 8% af alle p53-mutationer [7]. Mutant p53 R273H er blevet rapporteret at spille en rolle ved at fremme bryst- og lungecancer metastase [8], [9] ved at øge migration og invasion.

En anden vigtig signalvej, der er modificeret i ovariecancer er transformerende vækst faktor Beta pathway (TGFp) [10]. TGFp er en superfamilie af peptid-vækstfaktorer, der regulerer vækst, differentiering, apoptose, og migration [10]. TGFp signaler ved binding til en familie af serin /threonin-kinase membranreceptorer, som phosphorylerer nedstrøms signaleringsmolekyler, primært Smads 2 og 3 [11]. Efter aktivering disse Smad komplekser translokerer til kernen og interagere med forskellige co-aktivatorer og repressorer til at modulere Smad-reguleret transkription [11], [12]. TGFp spiller en vigtig rolle i induktion af vækststandsning i normale ovarieceller [13]. I nogle kræftceller, TGFp inducerer apoptose og standsning af cellecyklus, medens i andre cancerceller mister evnen til at inducere vækststandsning og kan i stedet fremme cellulær invasion [10]. Det kan også spille en rolle i kemoresistens i avanceret serøse ovariecancer [14]. De centrale TGFp pathway komponenter, TGFp-receptorer, og Smad proteiner, der sjældent muteret eller tabt i kræft i æggestokkene [5], hvilket tyder på, at afbrydelse af TGF-vejen sker ved andre mekanismer.

Som p53 og Smads er både transkriptionsfaktorer, p53 er stand til at interagere med Smads at ændre både p53 og TGFp signalveje [4]. Smads kan danne en transkriptionel kompleks med p53 for at inducere ekspression af gener, der fremmer cellecyklusstandsning, såsom p21 [4]. Smads og p53 binder til deres egne responsive elementer i initiativtagerne til TGFp-responsive gener til synergistisk aktivere eller undertrykke transskription [4]. Faktisk er det blevet vist, at p53 er påkrævet for TGFp-induceret cellecyklusstandsning [4]. Derudover mutant p53 R273H ophæver TGFp-induceret cellecyklusstandsning og fremmer metastatisk adfærd ved at blokere P63 i brystkarcinomceller [8]. I disse celler den mutant p53 /Smad komplekset inhiberer P63-medieret transkription fører til invasion i nærvær af onkogene Ras [8].

I betragtning af den høje procentdel af p53-mutationer i ovarietumorer [6] og den nylige tegn på, at p53 og Smads interagerer at regulere metastaser i brystkarcinomceller [8], blev rollen som mutant p53 som reaktion på TGF signalering i kræft i æggestokkene undersøgt. p53 og TGFp er impliceret i mange cancere, såsom brystcancer og lunge på egen hånd [15], [16] og i samråd [8]. I bryst- og lungekræft, mutant p53 interagerer med Smads at ændre transskription af gener, der regulerer metastaser [8], men lidt er kendt om, hvordan p53 og TGF sammen i kræft i æggestokkene. Faktorer, der er nødvendige for vækst og metastase i bryst-, lunge-, og tyktarmskræft måske ikke nødvendigt i kræft i æggestokkene, hvilket fører til vævsspecifikke effekter af mutant p53 signalering [17]. To gener (

TMEPAI

og

DKK1

) blev undersøgt på grundlag af deres rolle i metastaser i kræft i æggestokkene.

TMEPAI

er en TGFp-induceret negativ regulator [18] og er involveret i TGF-induceret metastaser i brystcarcinomacellelinier [18], men er aldrig blevet rapporteret at være co-reguleret af p53 og Smads.

DKK1

er en inhibitor af Wnt-signalering, som ofte opreguleret i metastatisk ovariecancer, og er forbundet med dårlig prognose [19]. Maspin, en anti-metastatisk protein, blev også valgt som den har etableret regulering af p53 og Smads [20]. Den aktuelle undersøgelse vurderet, om udtryk for en af ​​de mest almindelige p53 mutationer i æggestokkræft (R273H) ændrer celle respons på Smad signalering at modulere celleproliferation og migration.

Materialer og metoder

Cell kultur

Alle reagenser blev opnået fra Life Technologies (Carlsbad, CA) medmindre andet er angivet. OVCA 420, OVCA 429, og OVCA 432 er cellelinjer, som tidligere er blevet offentliggjort [21], [22], mens OVCAR5 celler er tilgængelige via National Cancer Institute (NCI) som en del af NCI60 tumorcellelinjen anticancer skærm narkotika [ ,,,0],23]. De OVCA 420, OVCA 429, OVCA 432, og OVCAR5 celler (gaver fra Dr. Gustavo Rodriguez og Dr. Teresa Woodruff ved Northwestern University) blev opretholdt i Minimum Essential Media (MEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 % L-glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1% natriumpyruvat og 1% penicillin /streptomycin. OVCAR3 celler blev opnået fra ATCC (Manassas, VA) og holdt i de samme medier som ovenfor, med undtagelse af tilskud med 20% FBS. SKOV3-celler blev erhvervet fra ATCC og opretholdt i McCoys 5A suppleret med 2,3 g /l natriumcarbonat, 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin.

Stabile cellelinier blev udvalgt under anvendelse antibiotikaresistente plasmider indeholdende genet af interesse. SKOV3 celler stabilt udtrykker mutant p53 R273H [24] (Addgene, plasmid: 16439, doneret af Dr. Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD) blev udvalgt ved hjælp af 500 pg /mL G418 (Gemini bioprodukter, West Sacramento , CA) og opretholdt i SKOV3 medier indeholdende 200 ug /ml G418. OVCA 420 celler, der udtrykker p53 shRNA eller krypteret shRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev udvalgt under anvendelse af 4 ug /ml puromycin (Sigma-Aldrich) og opretholdt med 1 ug /ml puromycin. p53 vildtype plasmidet [24] blev købt fra Addgene (Addgene plasmid: 16434, doneret af Dr. Vogelstein, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD)

Normalt udødeliggjort menneskelige æggestokkene overflade epitelceller (. IOSE 80) var en gave fra Dr. Nelly Auersperg ved University of Vancouver og blev opretholdt i 50% v /v Medium 199 og 50% v /v MCDB (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 15% FBS, 1% L-glutamin, 1% penicillin /streptomycin og 0,055% epitelial vækstfaktor (EGF, PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ) [25]. Normale humane æggeleder sekretoriske epitelceller (FTSEC) var en gave fra Dr. Ronny Drapkin på Harvard University og blev opretholdt i 50% v /v DMEM og 50% v /v F-12 (Mediatech, Manassas, VA), 1% L-glutamin, 1% penicillin /streptomycin, og 2% Ultroser G (Pall Corporation, Port Washington, NY) [26]. Mus ovarie overflade epithelceller (Mose) blev isoleret fra C57BL /6-mus og mus æggelederne epithelceller (MTEC) blev isoleret fra CD1 mus som beskrevet tidligere [27]. Dyrkede celler blev holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator.

Luciferase assay

Celler blev udpladet med en tæthed på 25.000 per brønd i 24-brønds plader og inkuberet natten over. Celler blev transficeret med 0,05 ug /brønd af en ekspressionskonstruktion indeholdende Smad bindende element promotor opstrøms for luciferasegenet under anvendelse Mirus Transit LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner. Den Smad responsivt element plasmid indeholder en CAGA sekvens gentaget tolv gange opstrøms for luciferasegenet (gave fra Dr. Aris Moustakas ved Ludwig Institute for Cancer Research, Uppsala, Sverige). Plasmider til ekspression af vildtype p53 eller mutant p53 R273H plasmider blev transficeret ind i celler ved 0,05 ug /mL. Celler blev transficeret i 24 timer i serum-suppleret medium. Celler blev derefter vasket med PBS og behandlet med TGFp1 ved 10 ng /ml (Sigma-Aldrich) i 24 timer. SB-431.542 (Selleck Chemicals, Houston, TX) blev anvendt ved en koncentration på 5 uM for alle luciferaseassays. Protokollen og SBE-luciferase transfektionseffektiviteter blev normaliseret og køre som beskrevet tidligere [28]. Normal celle luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af et Synergy Mx (BioTek, Winooski, VT).

Proliferationsassay

sulforhodamin B (SRB) assays blev anvendt til at bestemme celledensitet. Cellerne blev behandlet i 48 timer med TGF (20 ng /ml) efterfulgt af kolorimetrisk assay som tidligere beskrevet [29]. Celle overlevelse blev beregnet ved at sammenligne absorbansværdierne mellem de behandlede og kontrolbrønde. Baggrund blev subtraheret ved at måle absorbansen af ​​0,1 mM Tris-base, alene.

Flowcytometri

OVCA 420, OVCA 432, og SKOV3-celler blev udpladet i T25-flasker 24 timer før behandling. Medium indeholdende TGFp (20 ng /ml) eller kontrol opløsningsmiddel blev tilsat og inkuberet i 48 timer. Efter behandling blev cellerne trypsiniseret, vasket med PBS, resuspenderet i 500 pi PBS, fikseres derefter i 4 ml 70% ethanol og opbevaret ved -20 ° C natten over. De fikserede celler blev vasket med PBS og farvet med 500 pi propidiumiodid (PI) opløsning [50 ug /ml PI, 90 enheder RNase A, 0,1% Triton X-100, 4 mmol /l citratbuffer, 10 mM polyethylenglycol (PEG ) 4000]. Celler blev inkuberet i PI opløsning i 20 minutter ved 37 ° C før behandling med 500 pi PI saltopløsning (1 mg /ml PI, 0,1 ml 10% Triton X-100, 4 M NaCl-opløsning, 10 mM PEG 4000) . Flowcytometrisk analyse blev udført på en Beckman Coulter Elite ESP (Miami, FL) med mindst 30.000 individuelle hændelser pr reaktion. Dataene blev analyseret med Mod-fit software (Verity Software House, Inc., Topsham, ME).

Western blot-analyse

Celler blev udpladet ved 50.000 celler per brønd i seks-brønds plader, transficeret med passende plasmider ved 0,05 ug /ml og behandlet med TGFp1 (10 ng /ml) i 24 timer. For at fremkalde p53 udtrykkelig blev cisplatin (Fisher Scientific, NC9343338) behandling udført ved 125 uM i to timer. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-assay (Pierce, Rockford, IL). Cellelysatet (30 ug) blev analyseret ved 10% SDS-PAGE og overført til nitrocellulose. Blots blev derefter blokeret med 5% mælk i TBS-T og probet natten over med primære antistoffer. De anvendte antistoffer var human p53 (# 9282), p21 (# 9247), maspin (# 9117), CDC2 (# 9112) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) ved en koncentration på 1:1000; DKK1 (H-120) og muse p21 (F-5) (Santa Cruz Technology, Inc., Santa Cruz, CA) blev anvendt i en koncentration på 1:200; TMEPAI 2A12 (Abnova, Taipei, Tiawan) blev anvendt i en koncentration på 1:500; og actin (Sigma-Aldrich) ved en koncentration på 1:1000. Anti-mus og kanin HRP-bundet sekundært (Cell Signaling Technology, Inc.) blev anvendt til alle blots ved en koncentration på 1:1000.

sårheling assay

Celler blev udpladet ved 50.000 brønd i en plade med 24 brønde og inkuberet natten over. En ensartet sår blev skabt gennem cellemonolaget under anvendelse af en pipettespids. Celler blev vasket og behandlet med TGFp1 (20 ng /ml) umiddelbart efter ridser. Billeder blev taget ved 0, 24, og 48 timer efter ridser, og arealet af bunden blev analyseret med ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Procent lukning blev målt i forhold til 0 timer og fold ændring blev bestemt ud fra procent lukning af behandlede i forhold til ubehandlet.

Dyr, orgel kultur og immunhistokemi (IHC)

Dyr blev opnået, behandlet, og opstaldet som tidligere beskrevet [27]. Æggestokke og æggeledere blev dissekeret og dyrket som tidligere beskrevet [30], [31]. Vækstmediet bestod af alfa-MEM (Invitrogen), og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen) med 0,1% DMSO, 20 ng /pl TGFp, 5 pM SB431542 (TGFp inhibitor), eller 20 ng /pl TGFp plus 5 uM SB431542 tilsat som behandlingsbetingelser. TGFp blev opløst i vand, men 0,1% DMSO blev tilsat til alene TGFp betingelse for at kontrollere for SB431542 opløsningsmiddel. Bromdeoxyuridin (BrdU, Sigma; 10 pM) blev tilsat i vækstmedierne 24 timer før vævsfiksering. Væv blev forberedt til paraffin sektionering og immunhistokemi blev gennemført som tidligere beskrevet [27].

spredning imaging

Imaging blev udført ved hjælp af et Nikon E600 mikroskop med en DS-Ri1 digitalkamera og NIS Elements software (Nikon Instruments, Melville, NY). ImageJ blev anvendt til at kvantificere celleproliferation. Procent proliferation blev beregnet ved at dividere antallet af epitelceller farvning positive for BrdU med det samlede antal af epitelceller.

Etik erklæring

Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med National Institutes of Health Guidelines for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og den etablerede Institutional Animal Brug og pleje protokol ved University of Illinois i Chicago. Protokollen blev godkendt af Animal Care udvalget ved University of Illinois i Chicago (protokol nummer: A08-250). Dyrene blev anbragt i en temperatur og lys kontrolleret miljø (12 timer lys, 12 h mørk) og blev leveret foder og vand ad libitum. Alle mus blev aflivet ved CO

2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation.

Statistiske analyser

Alle værdier er vist som middelværdi ± standard error. ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligningstest blev anvendt til at vurdere forskelle mellem forsøgs- og kontrolgrupper. For sårheling assayet blev en parret t-test anvendes til at analysere kontrol og behandlet i hver cellelinje, mens en uparret t-test blev anvendt ved sammenligning behandlede grupper mellem to forskellige cellelinier. p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

TGFp inducerer vækst anholdelse i æggestokkene cancerceller udtrykker vildtype p53

For bedre at forstå betydningen af ​​p53 i kræft i æggestokkene. , seks kendte ovariecancer cellelinier blev analyseret for p53-ekspression (fig. 1a). OVCA 420 og 429 celler udtrykker lave niveauer af p53-protein, i overensstemmelse med rapporter om, at de har vildtype p53 [32]. På grund af disse lave niveauer, blev cisplatin behandling, der anvendes til at inducere og bekræft p53 ekspression i OVCA 429 (fig. S1). SKOV3 og OVCAR5 viste ingen p53-proteinekspression, som er i overensstemmelse med den forudgående konstatering klassificerede dem som p53 null [7]. I modsætning hertil OVCA 432, og OVCAR3 udviste rigelige p53-protein-ekspression skyldes de R277H og R248Q mutationer (tabel S1) [7].

(a) Western blot-analyse af æggestokkene cancercellelinier viser deres p53 status. Actin anvendes som lastning kontrol. (B) Seks æggestokkene kræft cellelinier (OVCA 420, 429, SKOV3, OVCAR 5, OVCA 432 og OVCAR 3), sammen med fire primære, ikke-kræft cellelinier (Mose, MTEC, IOSE80, og FTSEC) blev behandlet med eller uden TGFp (10 ng /ml) under anvendelse af SBE-luc-plasmid. ANOVA blev udført separat for fold induktion (TGFp) og fold repression (inhibitor og TGFp + inhibitor) at analysere signifikans sammenlignet med ubehandlet. Data repræsenteret som middelværdi ± SEM, * p ≤ 0,05.

At evaluere hvordan p53-ekspression modulerer cellers evne til at reagere på Smad signalering, en luciferase assay blev anvendt til at bestemme, hvilke celler var responsive til TGFp -induceret Smad transkription (fig. 1b). Alle testede, undtagen OVCAR5 cellelinjer, demonstreret TGFp-medieret transkription, der kunne blokeres af SB431542, en TGFp-inhibitor (data ikke vist).

Dernæst virkningen af ​​TGFp på ikke-kræft progenitorceller blev undersøgt. Da æggestokkene overflade epitel (OSE) og æggeleder epitel (TEC) kan give anledning til ovariecancer [33], blev svaret af disse normale celler til TGFP undersøgt. For at overvåge signalering nedstrøms for TGFp blev SBE-luciferaseassays udført på normale 2D murine OSE (MOSE) murin TEC (MTEC) celler, såvel som den menneskelige udødeliggjort OSE (IOSE80) og human æggelederen epitel (FTSEC). OSE og TEC-celler reagerede betydeligt til Smad-medieret transkription induceret af TGFp i både murine og humane cellelinjer (fig. 1b). Mose celler reagerede med en højere fold aktivering (21 gange) af reporter end MTEC celler (7 gange). p53-ekspression i MOSE var tidligere bekræftet som værende vildtype [27], [34]. MTEC celler opførte sig som vildtype som respons på cisplatin (fig. S2), mens IOSE80 og FTSEC var funktionelt null for p53 grund udødeliggørelse med SV40.

Baseret på disse resultater, tre cellelinier (OVCA 420 , OVCA 432, og SKOV3) blev valgt til yderligere at analysere virkningen af ​​TGF på spredning. Disse cellelinier blev behandlet med TGFp (20 ng /ml) i 48 timer og cellecyklusprogression blev undersøgt under anvendelse af flowcytometri. TGF behandling induceret G

0 /G

1 cellecyklusstop i OVCA 420 (fig. 2a). OVCA 432 celler, som udtrykker mutant p53, var ikke væksten standset ved TGFp behandling (fig. 2b). Endelig har TGFp ikke inducerer standsning af cellecyklus i SKOV3-celler, men snarere reduceret antallet af celler i G

0 /G

1 (fig. 2c).

(a-c) OVCA 420, OVCA 432, og SKOV3 cellelinjer blev behandlet med 20 ng /mL TGFp i 24 timer og underkastet flowcytometrianalyse. Fordelinger af celler i de tre faser af cellecyklus er repræsenteret ved middelværdier procenter +/- SEM. Statistisk signifikans repræsenterer en forskel mellem antallet af celler i hver cyklus mellem behandlede og ubehandlede og repræsenteret med * for en forøgelse af behandlede celler sammenlignet med ubehandlede;

#represents fald i behandlede celler sammenlignet med ubehandlet; p ≤ 0,05 (d) Western blot-analyse af de tre ovariecancer cellelinier probet for cellecyklusproteiner p21 og CDC2. Actin blev anvendt som en loading kontrol. (E-f) Proliferation assay udført under anvendelse af BrdU-inkorporering i 3D organkultur af muse æggestokke og rør. Envejs ANOVA blev udført. Data, repræsenteret gennemsnit ± SEM * p ≤ 0,05.

For yderligere at bekræfte mekanismen for p53-Smad cellecyklus regulering, udtryk for p21 og CDC2 blev evalueret i OVCA 420, OVCA 432, og SKOV3 celler behandlet med TGFp (fig. 2d). p21 er en cyclin-afhængig kinase inhibitor, er reguleret af både p53 og Smads, og korrelerer med TGFp-medieret cellecyklusstandsning [4]. CDC2 (eller CDK1) er en cyclin-afhængig kinase og dets ekspression er konsistent med cellecyklusprogression [35]. TGFp behandling i OVCA 420 forøget p21-proteinekspression (fig. 2a og d), som ikke blev observeret i OVCA 432 og SKOV3-celler (fig. 2d). De OVCA 432 og SKOV3 celler udtrykte forhøjede niveauer af Cdc2 sammenlignet med OVCA 420 (fig. 2d). Dernæst immunohistokemi blev udført for at overvåge proliferation af normal mus æggestokkene overflade epitel og oviductal epitel under anvendelse af en 3D orgel dyrkningssystem [30] behandles med TGFp. Efter 48 timer, OSE spredning var signifikant nedsat med TGFp behandling i forhold til DMSO-kontrol (fig. 2e). Trods transkriptionelt lydhør, blev proliferation ikke hæmmet af TGF behandling i oviductal celler i 3D kultur (Fig. 2f). Immortalisering af IOSE80 og FTSEC med SV40T antigen inaktiverer p53 [25], [26], derfor vækst analyser med TGFp blev ikke udført på disse celler.

TGFp-induceret cellecyklusstop ophæves i p53 mutant og nul-celler

Varianter af OVCA 420 blev skabt for at undersøge den rolle, p53 i TGFp-induceret cellecyklusstandsning (tabel S1 og S2). Under anvendelse shRNA, blev endogent vildtype-p53 effektivt slået ned i OVCA 420 (OVCA 420 p53 shRNA) celler i sammenligning med den krypterede shRNA kontrol (OVCA 420 Scr) (fig. 3a). Derudover blev SKOV3-celler stabilt transficeret til at udtrykke mutant p53 R273H (fig. 3a). Vildtype p53 kunne ikke stabilt transficeret i SKOV3-celler, fordi cellerne undergik senescens og ikke kunne opformeret som tidligere rapporteret [36]. Transient transfektion af vildtype p53 i SKOV3-celler ikke straks inducere senescens, som tillod dataindsamling på kortere tidspunkter.

(a) Western blot-analyse af stabile cellelinier til knockdown af p53 ved shRNA plasmid eller ekspression af mutant p53 R273H. C = kontrol, T = TGFp behandles. (B) SB-431.542 (5 uM) blev anvendt til at inhibere TGFp-signalering. For hvert panel, data repræsenterer middel ± SEM p ≤ 0,05 stigning i forhold ubehandlet for grupper mærket med et eller mellem behandlede grupper mærket med b. (C) Cell overlevelse. Procentdel af TGFp-behandlede celle overlevelse sammenlignet med ubehandlet. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM, * p ≤ 0,05.

Først blev evnen af ​​varianten cellelinjer til at reagere på TGFp undersøgt. Alle stabile cellelinier opretholdt evnen til at inducere Smad-medieret transkription af et SBE-luciferase plasmid uanset p53-status (fig. 3b). Luciferase induktion forblev den samme i OVCA 420 p53 shRNA og OVCA 420 Scr sammenlignet med OVCA 420 moderceller (fig. 3b). Tilsvarende har SKOV3 stabil mutant p53 R273H celler ikke ændre TGFp-induceret Smad-medieret transkription af luciferasegenet (fig. 3b). Transient ekspression af vildtype p53 i SKOV3-celler reducerede Smad-medieret transkription i sammenligning med de SKOV3 mutant p53 R273H celler, men viste ingen signifikant forskel sammenlignet med SKOV3 forælder cellelinjen (fig. 3b).

for at vurdere proliferation som respons på TGFp (20 ng /ml), blev cellevæksten assays udført efter 48 timers inkubation. Som forventet blev OVCA 420 Scr cellevækst undertrykt som respons på TGFp, hvilket svarede til den parentale linie (fig. 3c). TGFp induceret væksthæmning blev tabt i OVCA 420 p53 shRNA. Ligeledes TGFp ikke langsom spredning i hverken modervirksomhedens SKOV3 eller SKOV3 mutant p53 R273H cellelinje (fig. 3c).

Mutant p53 R273H udtryk forhindrer TGF-induceret migrering af SKOV3 celler

Udover at påvirke proliferation, har TGFp og p53 også vist sig at påvirke migration af tumorceller fra brystet og lunge [8], [9], [37]. Tidligere litteratur antyder, at mutant p53 kan fungere som en molekylær udløser tillader TGFp at inducere pro-migrerende stimuli [38]. Derfor blev TGFp regulering af cellemigrering under tilstedeværelse af vildtype, mutant, og null p53 undersøgt under anvendelse af en sårhelende assay. TGFp induceret migration i begge OVCA 420 SCR og OVCA 420 p53 shRNA celler mellem 0 og 24 timer og 24 og 48 timer (fig. 4A). OVCA 420 Scr (p53 vildtype) celler behandlet med TGFp migrerede betydeligt mere end ikke-behandlet kontrol mellem 0 og 24 timer, men ikke mellem 24 timer og 48 timer, hvorimod OVCA 420 p53 shRNA celler behandlet med TGFp migrerede betydeligt mere end kontrol mellem 0 og 24 timer og mellem 24 og 48 timer (fig. 4a). Vandrende satser blev sammenlignet mellem behandlet OVCA 420 Scr og OVCA p53 shRNA. Knockdown af p53 tilladt for en forøget migration i forhold til vildtypeceller (fig. 4b).

(a) sårhelende assays blev udført på SKOV3 og OVCA 420 stabile cellelinjer. Cellemonolag ridset og behandlet med eller uden TGFp ved 20 ng /ml i 48 timer. Sårlukning blev målt som en fold stigning eller fald i forhold til ingen behandling-kontrol. Parret t-test blev anvendt med en p ≤ 0,05. (B) Sammenligning af gange forøgelse af TGFp prøver fra 5 (a). Parret t-test blev anvendt til at analysere betydning. Signifikans er repræsenteret ved * og betegner en statistisk forskel mellem cellelinier. Data repræsenteret som middelværdi ± SEM, * p ≤ 0,05.

evne SKOV3 null og SKOV3 mutant p53 R273H celler at migrere som respons på TGFp blev også analyseret. TGFp induceret migration i p53 null SKOV3-celler sammenlignet med ubehandlede celler mellem både 0 og 24 timer og mellem 24 og 48 timer (fig. 4a). Imidlertid ekspression af mutant p53 R273H i SKOV3-celler inhiberede TGFp-induceret migration, uden ændring mellem 0 og 24 timer eller 24 og 48 timer i sammenligning med kontrol (fig. 4a). SKOV3 celler, der udtrykker mutant p53 R273H påviste mindre TGF-induceret migration end SKOV3 null celler (figur 4b).

Angivelse af mutant p53 R273H ændrer TGFP inducerede ekspression af TMEPAI og DKK1

For at belyse mulige mekanismer, som p53 og TGFp kunne regulere migration, blev pro-invasive mål vides at være reguleret af enten p53 eller TGFp i æggestokkene cancerceller undersøgt. Maspin er en serinproteaseinhibitor, der blokerer metastase [20], og er kendt for at være co-reguleret af p53 og Smads i mammaepitelceller [20]. Derudover er maspin ekspression angiveligt tabt i ovariecancer, og det har været forbundet med dårlig prognose og overlevelsesrater [39]. Maspin blev minimalt induceret med TGFp behandling i OVCA420 og OVCA432 celler (fig. 5a), og blev ikke induceret i SKOV3. Overraskende, havde maspin ikke demonstrere en afhængighed af TGF behandling eller p53-ekspression i OVCA420 p53 shRNA eller SKOV3 R273H mutant p53 cellelinier (data ikke vist) sammenlignet med stamceller tyder på, at yderligere veje ændre p53 og Smad regulering af maspin i æggestokkene cancerceller.

(a) OVCA 420 (p53 vildtype), OVCA 432 (p53 mutant), og SKOV3 (null p53) celler blev behandlet med 10 ng /ml TGFp i 24 timer og analyseret ved western blotting. Membraner blev probet med maspin, TMEPAI og DKK1 primære antistoffer. Actin blev anvendt som en intern loading kontrol. (B) OVCA 420 cellelinier blev analyseret ved Western blot og probet for pro-metastatiske faktorer TMEPAI, og DKK1. Actin blev anvendt som en intern loading kontrol. (C) SKOV3 cellelinjer blev analyseret ved western blot og probet for pro-metastatiske faktorer TMEPAI og DKK1. SKOV3 p53 WT blev transient transficeret med 100 ng /ml p53 vildtype-plasmid. Actin blev anvendt som en intern loading kontrol.

TMEPAI er en TGFp-induceret protein, der er kendt for at konvertere TGFp fra en tumor suppressor i en tumor promotor i brystcancer, og er forbundet med forøget migration i prostata og renale carcinomer [18], [40], [41]. Overekspression af TMEPAI er blevet forbundet med mange cancertyper, herunder ovariecancer [42]. TGFp forøget ekspression af TMEPAI i p53 vildtype OVCA 420 celler og nul-SKOV3-celler (fig. 5A). Mutant R277H p53 OVCA 432 celler demonstrerede en reduceret induktion af TMEPAI ekspression. TGFp-induceret TMEPAI ekspression i OVCA 420 mutant p53 R273H forbigående celler blev reduceret i sammenligning med vildtype og nul p53 celler (fig. 5b). Tilsvarende TMEPAI induktion ved TGFp i SKOV3 mutant p53 R273H celler var lavere end den for SKOV3 vildtype- og nul p53 celler (Fig. 5c).

Endelig DKK1, et Wnt-signalering inhibitor, blev valgt som det er forskelligt reguleret af vildtype og mutant p53, og er også overudtrykt i sene fase metastatisk ovariecancer [19]. TGFp induceret ekspression af DKK1 i SKOV3 null p53 celler (fig. 5a). Denne stigning blev ikke set i vildtype OVCA 420 eller mutant R277H p53 OVCA 432 celler. I OVCA 420 celler, overordnede niveauer af DKK1 var højest i OVCA 420 p53 shRNA, med en lille induktion på TGF behandling (fig. 5b). OVCA 420 mutant p53 R273H havde den laveste mængde DKK1, uden induktion på TGF behandling (fig. 5b).