PLoS ONE: opregulering af SATB1 er forbundet med prostatakræft Aggressivitet og Sygdom Progression

Abstrakt

Sygdom aggressivitet fortsat en kritisk faktor for udviklingen af ​​prostatakræft. Transformation af epitelceller til mesenchymale afstamning, der er forbundet med tabet af E-cadherin, tilbyder betydeligt invasive potentiale og migration kapacitet. For nylig har særlige AT-rige bindingsprotein (SATB1) været knyttet til tumorprogression. SATB1 er en celletype begrænset kerneprotein, der fungerer som en vævsspecifik organisator af DNA-sekvenser under cellulær differentiering. Vores resultater viser, at SATB1 spiller væsentlig rolle i prostata tumor invasion og migration og dets nukleare lokalisering korrelerer med sygdom aggressivitet. Klinisk prøve analyse viste, at SATB1 overvejende blev udtrykt i kernen af ​​high-grade tumorer i forhold til lav-grade tumor og godartet væv. En progressionen i nukleare niveauer af SATB1 blev observeret i kræft væv sammenlignet med godartede prøver. Tilsvarende SATB1 protein niveauer var højere i en række prostatacancerceller

nemlig

. HPV-CA-10, DU145, Dupro, PC-3, PC-3M, LNCaP og C4-2B, sammenlignet med ikke-tumorigene PZ-HPV-7-celler. Nuklear udtryk for SATB1 var højere i biologisk aggressive subkloner af prostata cancer celler med deres respektive parentale cellelinjer. Endvidere Tildelt ektopisk SATB1 transfektion forøget cellemotilitet og invasivitet i immortaliserede humane prostata epitel PZ-HPV-7-celler, som korrelerede med tab af E-cadherin ekspression. Derfor knockdown af SATB1 i meget aggressive menneske prostatakræft PC-3M celler hæmmede invasionsevne og tumorvækst

in vivo

sammen med stigningen i E-cadherin proteinekspression. Vores resultater viser, at SATB1 har evne til at fremme prostatakræft aggressivitet gennem epitelial-mesenkymale overgang

Henvisning:. Shukla S, Sharma H, Abbas A, MacLennan GT, Fu P, Danielpour D, et al. (2013) opregulering af SATB1 er forbundet med prostatakræft Aggressivitet og sygdomsprogression. PLoS ONE 8 (1): e53527. doi: 10,1371 /journal.pone.0053527

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: August 22, 2012; Accepteret: December 3, 2012; Udgivet: januar 7, 2013 |

Copyright: © 2013 Shukla et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering forudsat af United States Public Health service Tilskud RO1CA115491 og Endowment midlerne til SG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt mænd i USA, med næsten 33.720 dødsfald i år 2011 [1]. Dårlig prognose for prostatakræft er forbundet med aggressivitet tumorceller, der forlener dem med forøget evne til at intravasate i det vaskulære og lymfatiske rum, metastaserer til fjerne steder, og forårsage tilbagefald selv efter endelige behandlingsformer som kirurgi og stråling [2], [3 ]. Epithelial-mesenchymal overgang (EMT) er en central begivenhed i tumorinvasion, hvorved epitelcelle-afledt tumor erhverver mesenchymal egenskaber, mister deres polaritet og celle-celle-kontakter og undergår dybe cytoskelet remodeling [4] – [6]. Tabet af E-cadherin ekspression er kendetegnende for EMT [7], [8]. E-cadherin (CDH1) spiller en central rolle i celle-celle adhæsion kryds i vedligeholdelse af cellepolaritet og miljøet [7]. Tab af E-cadherin ekspression er ofte forbundet med tumorindtrængen, metastase og dårlig prognose i forskellige humane cancere, herunder prostatacancer [8], [9]. Identifikation af proteiner, der forårsager molekylær omprogrammering af EMT kan føre til deres identifikation som prognostiske biomarkører og terapeutiske mål, hvorved udvikling af nye strategier til at reducere prostatakræft aggressivitet.

Special AT-rige bindende protein 1 (SATB1) er en transkriptionsfaktor, der fungerer som et genom organisator [10], [11]. Det har tendens til at binde med AT rige baser uparrede sekvenser af målgenet [11]. SATB1 erhverver en “3 D chickenwire” struktur ved at danne anker sløjfer rundt kromatin, rekrutterer kromatin remodeling komplekser på forankring sites, og regulerer histon ændringer ved at gøre DNA-sekvenser tilgængelige eller utilgængelige for transskription [12], [13]. Transskription GenBank referencer to SATB mRNA-transkript varianter i mennesker: SATB1 og SATB2 [14]. Konstitutiv aktivering af SATB1 er påvist primært i celler af en hæmatopoietisk linje og er involveret i de stadier af T-celle udvikling og differentiering styre ekspression af bcl-2-genet gennem BCL-2 større breakpoint region (MBR) placeret i 3′ UTR [15], [16]. SATB2 er impliceret som en udviklingsmæssig regulator af neuronal differentiering [17]. Nylige undersøgelser har vist afvigende ekspression af SATB1 i forskellige epiteliale cancere, herunder melanom, larynx pladecellecarcinom, og carcinomer i bryst, colon, lunge, ovarie, og lever [18] – [24]. Overekspression af SATB1 er blevet identificeret som en uafhængig prognostisk markør for mavekræft [25], og er blevet vist at spille en rolle i brysttumor progression gennem en proces med omprogrammering af genekspression og dermed fremme tumorvækst og metastase [26]. Vides kun lidt om indflydelse SATB1 udtryk på biologiske adfærd prostatakræft.

Selvom SATB1 er blevet rapporteret til at blive aktiveret i forskellige typer af kræft, dens rolle i kræft progression er ikke klart. En omfattende genekspression analyse af kliniske prostatacancer prøver afslørede særskilte transkriptionelle omprogrammering forbundet med metastatisk potentiale [27]. Funktionel profilering af gener foreslog associering SATB1 med kromatin modifikation påvirker transkriptionel regulering af gener, der regulerer celleadhæsionsmolekyler og EMT [9], [12]. I betragtning af den betydelige rolle, EMT i prostatakræft invasiv, er det blevet en hypotese, at overekspression af SATB1 i prostatakræft kan fremme invasiv for prostatakræft ved nedregulering af E-cadherin. Indtil videre har der ikke været nogen data om den rolle, SATB1 i prostatacancer. I denne undersøgelse af SATB1 ekspression, blev dets nukleare og cytoplasmiske lokalisering vurderet i en række af primær prostata cancer vævsprøver og etablerede cellelinjer gennem en kombination af immunohistokemi og Western blotting. Vores resultater viser, at nuklear tilstedeværelse af SATB1 signifikant korreleret med prostatakræft aggressivitet og sygdomsprogression. I overensstemmelse med kliniske fund, ektopiske ændringer i SATB1 udtryk medført ændringer i celle motilitet og invasion både

in vitro

in vivo

. Denne linje af beviser viser den prognostiske betydning af SATB1 i prostatakræft og desuden præciserer indflydelse SATB1 at fremme prostatakræft invasiv.

Materialer og metoder

Cell Culture

Menneskelig prostatacancerceller, LNCaP, 22Rv1, DU145, PZ-HPV-7, CA-HPV-10 og PC-3 blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Humane prostatacancerceller

dvs.

. PC-3M blev leveret af Dr. ME Kaighn på National Cancer Institute [28]; C4-2B celler af Dr. Robert Sikes ved University of Delaware [29], og Dupro celler ved Dr. Rajvir Dahiya ved University of California i San Francisco [30]. Tidligere rapporter har dokumenteret etableringen af ​​disse cellelinjer [28] – [30]. Cellerne blev dyrket i RPMI-1640-medium med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 100 ug /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA), holdt i en inkubator med en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 ved 37 ° C. De dyrkede celler blev dyrket til -60% sammenløb og lysater (samlede lysater, cytosoliske og nukleare lysater) blev fremstillet i overensstemmelse med tidligere protokol til yderligere analyse.

Menneskelig Prostata vævsprøver og Immunhistokemi

Prøver af kasserede menneskelige prostata væv blev modtaget fra faciliteten tissue indkøb af University Hospitals Case Medical center og midtvestlige Division i Cooperative humant væv Network. Ingen samtykke blev opnået for disse kasserede væv pr deres hospital politikker og Institutional Review Board protokoller. Disse undersøgelser blev godkendt af Institutional Review Board på universitetshospitalerne Case Medical Center. Patienter fra hvem disse væv blev indkøbt havde gennemgået kirurgiske procedurer for prostata sygdom og ikke havde modtaget nogen form for adjuverende behandling. Den Gleason kvalitet og score på adenocarcinom i vævsprøver blev tildelt af en kirurgisk patolog oplevet i uro-genital patologi. Umiddelbart efter udtagningen blev prøver lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C i dampfasen af ​​flydende nitrogen indtil videre anvendelse. For IHC undersøgelser et humant prostatavæv microarray (Cat # 73-5063) blev indkøbt fra Zymed Laboratories (San Francisco, CA), herunder kerner af normal prostata, godartet hyperplastisk prostatavæv, lav kvalitet cancere og ædelstål prostatakræft. I disse prøver, blev immunhistokemisk analyse udført i overensstemmelse med producentens protokol (Biocare Medicals, Concord, CA).

transient transfektion

Androgen-refraktær stærkt metastatisk human prostatacancer PC-3M, som besidder højere ekspression af SATB1, hvorimod, PZ-HPV-7, som har meget lav basalt SATB1in kernen blev anvendt i undersøgelsen. Kort beskrevet blev disse celler udpladet i 100 mm plader og fik lov til at binde natten over. Ca. 70% sammenflydende PZ-HPV-7 celler blev forbigående transficeret med 8 mu g enten pCMV6-AC Sand Clone Menneskelig plasmid DNA, der indeholder SATB1 (SC320672) udtryk blev købt fra OriGene (Rockville, MD) eller tom vektor, hvorimod, PC-3M-celler blev inficeret med shRNA (SATB1) humant plasmid DNA til knockdown den SATB1 genekspression; som indeholder pulje af 3 målspecifik lentiviral vector hver kodende 19-25 nt (plus hårnål) (SC-36460-SH) og den tomme vektor shRNA plasmid-A (SC-108.060) (Santa Cruz Biotechnology, CA) under anvendelse af Fugene 6 transfektionsreagens. Efter 6 timer blev mediet suppleret med serum dyrkningsmedium, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en befugtet inkubator i 48 timer. Senere blev cellerne behandlet til immunoblotanalyse samt celle migration og invasion assays.

Western Blotting

tumorlysater samt cellelysater (total, cytosoliske og nukleare) blev forberedt og udsat at immunoblotanalyse. Protein (40 mu g) fra totale cellelysater eller human prostata tumorlysater blev løst i løbet 4-20% SDS-PAGE og overført til nitrocellulose-membran. Efter blokering med blokerende buffer (PBS indeholdende 0,1% Tween-20 og 10% FBS) i 2 timer, blev membranen inkuberet med primært antistof i 2 timer ved stuetemperatur. De anvendte antistoffer var SATB1 (Cat # ab49061, Abcam, Cambridge, MA); Histon H4 (Cat # 07-108, Millipore, Denvers, MA); E-cadherin (Cat # SC-8426); MMP-9 (Cat # SC-10737); beta Actin (Cat # SC-47.778) og Cytokeratin-18 (Cat # SC-6259) fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Membranen blev derefter inkuberet med HRP-konjugeret sekundært antistof i yderligere 2 timer ved stuetemperatur. Proteinet blev påvist ved ECL substrat reagenser (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL).

Cell Invasion Assay

Transient transfektion SATB1 i PZ-HPV-7 (SATB1over-udtrykkende celler) og PC -3 inficerede (SATB1 knockdown celler) blev taget i studiet for at undersøge effekten af ​​SATB1 gen i cellen invasion samt i migration. Efter 48 h SATB1 gen infektion i cellerne, blev medier indeholdende serum fjernes fra cellerne og var genopfyldes frisk uden serum RPMI-medium i 6 timer. Yderligere celler blev trypsiniseret, talt og udpladet i transbrøndene indeholdende 1 × 10

6 celler /ml. Invasionen kammer assay kit anvendte var QCMTM ECMatrix Cell Invasion Assay, 24-brønd (8 mu m) (Millipore Corporation, Denvers, MA, Cat # ECM550) baseret på princippet om Boyden kammer. Kollagenlaget okkluderer membranens porer, blokering ikke-invasive celler fra migration gennem membranen. Invasive celler, på den anden side, vandrer gennem den polymeriserede kollagen lag og klynger sig til bunden af ​​polycarbonatmembran. Invaderet celler på bunden af ​​indsatsen membranen blev inkuberet med Cell farveopløsning, så efterfølgende ekstraheret og registreret på en standard mikropladelæser (560 nm). Hele proceduren blev fulgt i overensstemmelse med producentens protokol.

cellemigrationsassay

Migration assay blev udført i PZ-HPV-7 (SATB1over-udtrykkende celler) og PC-3M inficeret (SATB1 knockdown celler) celler ved hjælp QCMTM, 24-brønds kolorimetrisk cellemigrationsassay kit (Millipore Corporation, Denvers, MA, Cat # ECM508) efter leverandørens protokol.

revers transkription-polymerasekædereaktion

Semi -quantitative revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR) blev udført for at bestemme transkriptniveauer af SATB1 i humane prostata vævsprøver fra forskellige Gleason kvaliteter og amplificeringen af ​​GAPDH-transkripter blev anvendt som kontrol til at normalisere transkriptniveauer af SATB1. Væv blev skåret i små stykker og anbragt i Melt, en total nukleinsyre isolation systemet (Ambion, Austin, TX), ifølge producenternes protokol. RT blev udført ved anvendelse af oligo-dT-primer (Invitrogen), og 0,5 mu g total RNA i en 25 mu reaktionsblanding l, indeholdende 50 mM Tris-HCI (pH 8,3), 75 mM KCI, 10 mM DTT, 5 mM MgC

2, 2,5 ml dNTP (10 mM), 10 U RNAsin, og 200 U MMLV-revers transkriptase (Invitrogen). RT-reaktionen blev udført ved 39 ° C i 1 time for at syntetisere cDNA’er. Derefter udførtes PCR til amplifikation cDNA’er i et 25 mu l reaktionsblanding indeholdende 50 nmol af hvert gen specifik primer, 3 ml RT produkt, 2,5 mM dNTP, 1X PCR buffer (5 mM Tris-HCl pH 8,3, 42,5 mM KCI , 0,1% Triton X-100), 0,5 ml Taq-polymerase (Promega, Madison, WI) 2 mM MgC

2 sammen med primere anvendt i PCR-reaktionen. Sekvenserne af gen-specifikke primere for SATB1 fremad: 5′- GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 ‘og revers: 5′- CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3′; GAPDH fremad: 5’-ATGACC CCTTCATTGACCTCA-3 ‘og omvendt: 5′-GAGATGATGA CCCTTTTGGCT-3’. SATB1 transkripter blev amplificeret i 30 cykler (1 min ved 94 ° C, 1 minut ved 59 ° C, og 1 min ved 72 ° C), og cDNA’erne af GAPDH-transkripter blev amplificeret i 25 cykler (1 min ved 94 ° C, 1 min ved 55 ° C, og 1 min ved 72). PCR cycling tal var blevet optimeret til at undgå amplificering mætning. Ti mikro-liter RT-PCR-produktet blev separeret på 2% agarosegeler, der efterfølgende blev farvet med ethidiumbromid. Geler blev visualiseret og band intensiteter blev målt under Kodak 2000R billedet station.

SATB1 Knockdown

PC-3M celler blev transduceret af SATB1 shRNA lentivirale partikler, som er en pulje af viral partikel indeholder 3 målret- specifikke konstruktioner, der koder for 19-25 nt (plus hårnål) shRNA designet til at banke ned genekspression (Santa Cruz Biotechnology, Californien; sc36460-v). PC-3M-celler blev udpladet i en 12-brønds plader 24 timer før virusinfektion. Transduktioner blev udført i RPMI indeholdende 10% komplet medium (med serum og antibiotika) og inkuberes cellerne natten over. RPMI Complete medium blev fjernet og suppleret med polybren (5 mu g /ml) komplet RPMI-medium. PC-3M-celler blev inficeret med ved at tilføje shRNA lentiviral partikler til de celler, der indeholder medium. Alle procedure blev udført ifølge producentens protokol.

kolonidannelse Assay

Ca. 400 celler af PC-3M og PC-3M (SATB1 knock down) celler blev taget i 100-mm petriskål ( Falcon, Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) og dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 og 95% luft. Efter 12 dage blev cellerne vasket med phosphatbuffer og derefter farvet med coomassie blue. Celler kolonier blev talt og fotograferet.

Tumor xenografundersøgelser

Nøgne mus blev købt fra Case Comprehensive Cancer Center, atymiske nøgne mus facilitet og vedligeholdes i microisolator bure. Alle dyr blev anvendt i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og de nuværende eksperimenter blev godkendt af Brug Komité for Animal Care på Case Western Reserve University. Tumorceller, PC-3M og PC-3M (SATB1 knockout) blev suspenderet i RPMI 1640 komplet dyrkningsmedium med 25% Matrigel (BD Biosciences) og inokuleret 1 × 10

6 celler subkutant i højre og venstre flanker på 6 til 7 uger gamle nøgne mus. Musene blev overvåget dagligt for håndgribelig tumordannelse og tumorer blev målt to gange om ugen under anvendelse af en Vernier skydelære, vejet og fotograferet.

Statistical Analysis

SATB1 nuklear udtryk data blev sammenfattet af gennemsnit (interval ) samt boxplot. Ændringer i tumorvolumen og kropsvægt i løbet af eksperimenterne blev visualiseret ved punktdiagram. Forskelle i SATB1 nuklear ekspression (af 1000 kerner), tumorvolumen (mm3) og legemsvægt ved afslutning af forsøget blandt forskellige grupper blev undersøgt ved anvendelse af variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukey procedure multipel sammenligning. Den statistiske signifikans af forskelle mellem kontrol og behandlingsgruppe blev bestemt ved T-test for data fra uafhængige prøver eller parret T-test for data fra korrelerede prøver. Alle tests var to-sidede og p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Angivelse af SATB1 protein i Benign og Tumor Prøver

Udtrykket profil SATB1 blev bestemt i de kliniske prøver fjernet kirurgisk. Vi udførte Western blot analyse for SATB1 og CK18 som epitelial lastning kontrol i 14 godartet, 14 low-grade prostatakræft (Gleason score ≤7), og 6 high-grade tumor prøver (Gleason score 8-10). En typisk blot vist i fig 1A, blev SATB1 sig at blive udtrykt i både godartede og ondartede prostatakræft væv. Niveauer af SATB1 var signifikant højere i cancer prøver sammenlignet med den godartet væv. Densitometrisk analyse viste 1,6 gange stigning i SATB1 udtryk i lav kvalitet tumor prøver og 2,62 gange i high-grade tumor prøver sammenlignet med godartet væv. Næste vi stilling til, om SATB1 opreguleres på besked niveau. Vi udførte RT-PCR for mRNA-ekspression for SATB1 og GAPDH som en loading kontrol. Som vist i figur 1B, blev mRNA-transkriptet for SATB1 signifikant opreguleret i high-grade tumorer sammenlignet med lav kvalitet tumorer og godartede væv. Densitometrisk analyse viste 1,64-gange stigning i SATB1 mRNA-ekspression i lav kvalitet tumor prøver og 1,51 gange i high-grade tumorer, sammenlignet med godartet væv. Da SATB1 er en nuklear protein og fremmer en transkriptionelt aktiv kromatin struktur ved at interagere med AT-rige DNA-sekvenser, opreguleret i cancer, derfor har vi bestemt niveauerne af dette protein i cytosol og nuklear fraktion i benigne og tumor prøver taget fra samme individ. Faktisk højere niveauer af SATB1 protein var til stede i den nukleare fraktion i forhold til cytosol i tumorvævet sammenlignet med godartet væv (figur 1C).

(A) Protein ekspression af SATB1 i forskellige kvaliteter af prostatatumorer og godartet væv blev analyseret ved Western blotting; cytokeratin18 udtryk tjente som lastning kontrol. (B) SATB1 mRNA-ekspression i forskellige kvaliteter af prostatatumorer og godartet væv; GAPDH mRNA-ekspression tjente som ladningskontrol. (C) SATB1 proteinekspression i parrede benigne og kræft prøver fra samme individ blev analyseret for cytoplasmatisk og nuklear fordeling. Densitometrisk analyse for hvert blot er vist i det højre panel. Detaljer er beskrevet i ‘materialer og metoder’ sektionen.

Næste vi analyserede SATB1 udtryk ved immunhistokemisk farvning af paraffin vævssnit, der består af 19 godartet, 5 lav kvalitet tumor (Gleason score 5- 6), 10 median-grade tumor (Gleason score 7-8) og 5 high-grade tumorer (Gleason score 9-10) i vævet microarray (figur 2). SATB1 ekspression blev observeret enten i kernen eller cytoplasmaet eller begge dele, men overvejende set i kernen af ​​cancerceller. Sammenlignet med godartet væv, blev en progressiv stigning i SATB1 udtryk observeret i kernen med stigende tumor klasse. Lave niveauer af SATB1 ekspression blev observeret i moderat differentierede tumorer. Repræsentative immunfarvning billeder af SATB1 ekspression i godartede og forskellige tumor kvaliteter er vist i figur 2A. Vi evaluerede også de nukleare niveauer af SATB1 i forskellige histologiske komponenter af vævsprøverne ved at tælle antallet af kerner, der viser positiv SATB1 ekspression ved en forstørrelse X40 og analyseret tællingerne statistisk ved middelværdi og standardafvigelse samt boxplot analyse (figur 2B). Forskellene i SATB1 nuklear ekspression (per 1000 kerner) blandt godartede og andre klasse tumorprøver blev undersøgt ved variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukeys parvis procedure multipel sammenligning. Godartede prøve (n = 15) udviste en middeldiameter på 56,93 farvede kerner (interval 37-79), lav kvalitet tumorer med Gleason score på 5-6 (n = 13) viste et gennemsnit på 90.54 farvede kerner (interval 56-115) ; moderat differentierede tumorer med Gleason score på 7-8 (n = 12) udviste en middeldiameter på 146.33 farvede kerner (interval 93-198); og high-grade tumor med Gleason score 9-10 (n = 11) viste en middelværdi på 205,27 (158-298) farvede kerner for SATB1. Den nukleare SATB1 udtryk blandt 4 grupper var statistisk højsignifikant (P 0,0001). Desuden Tukeys parvis procedure multipel sammenligning viste, at SATB1 udtryk i høj score tumor prøver var betydeligt højere end i den lave score prøver (P 0,05).

(A) Paraffinindstøbte (4,0 um) sektioner fra godartede og prostatacancer af forskellige Gleason scorer blev anvendt til SATB1 ekspression ved immunhistokemi. En stærk nuklear og cytoplasmatisk farvning blev observeret i Gleason score 3 + 3, hvorimod der blev observeret øget nuklear SATB1 farvning i high-grade kræft (Gleason score 3 + 4 og 4 + 5, henholdsvis). Forstørret på x20 og x40 (B) Statistisk analyse af SATB1 nukleare tilstedeværelse blev udført ved at sammenligne SATB1 positive nukleare farvede celler fra forskellige steder fra godartede, score 5-6, score 7-8 og score 9-10 prøver. Data repræsenterer middelværdien ± SE. *

P

0,05

versus

tilsvarende kontrol. P 0,05, er detaljer beskrevet i ‘materialer og metoder afsnittet

SATB1 Expression i Human prostatacancerceller

Vi undersøgte SATB1 udtryk i 8 prostata epitelial cellelinjer, herunder ikke. -tumorigenic viralt transformerede humane prostata epitelceller (PZ-HPV-7) og dens kræft modstykke (CA-HPV-10), 3 primær prostata cancercellelinier viz. DU145, LNCaP og PC-3 og deres biologisk aggressive subkloner: Dupro, C4-2B og PC-3M, hhv. Som vist i figur 3A, SATB1 proteinniveauer var højere i alle prostatacancercellelinjer sammenlignet med de ikke-tumorigene PZ-HPV-7-celler. De primære cancer cellelinjer nemlig. CA-HPV-10, DU145, LNCaP og PC-3-celler udtrykker 7.94- til 16,82 gange stigning i SATB1 ekspression sammenlignet med PZ-HPV-7-celler. Den aggressive subkloner udstilling 17.0- til 20,53 gange stigning i SATB1 udtryk, sammenlignet med ikke-tumorigene celler. Vi sammenlignede også den cytosoliske og nukleare udtryk for SATB1 i LNCaP og PC-3 deres respektive subkloner C4-2B, og PC-3M celler. Som vist i figur 3B, ekspressionen af ​​SATB1 i LNCaP og PC-3-celler var forholdsvis ens i cytosoliske og nukleare fraktioner. I modsætning hertil blev høje niveauer af SATB1 proteinekspression observeret i den nukleare del af den aggressive subklon C4-2B og PC-3M-celler. Disse resultater er i overensstemmelse med de vævsprøver, hvor betydelig høj nukleare SATB1 udtryk korreleret med sygdom aggressivitet

(A) vestlig blotting for SATB1 proteinekspression i forskellige prostata kræftceller.; CA-HPV-10, Dupro, DU145, PC-3, PC-3M, LNCaP og C4-2B herunder ændrede epitel (PZ-HPV-7), celler. (B) Cytoplasmisk og nuklear SATB1 proteinekspression blev analyseret i prostatacancer parental celle afstamning og deres aggressive subkloner LNCaP og C4-2B; PC-3 og PC-3M, som repræsenterede højere nuklear tilstedeværelse SATB1 i aggressive subkloner. Histon H4 tjente som lastning kontrol. Densitometrisk analyse for hvert blot er vist i det højre panel. Detaljer er beskrevet i »materialer og metoder ‘sektionen.

SATB1 Knockdown Reducerer aggressivitet prostatacancerceller

Vi undersøgte, om SATB1 er nødvendig for invasiv fænotype af prostata kræftceller. I forsøget blev PC-3M-celler, som udtrykker høje konstitutive niveauer af SATB1 anvendes og korte hårnåle RNA’er (shRNA) til Knockdown SATB1 ekspression. Vi brugte shRNA fra to forskellige SATB1 sekvenser (shRNA1 og shRNA2) og kontrol shRNA i de meget aggressive PC-3M celler. Som vist i figur 4A, blev SATB1 ekspression signifikant reduceret med 85,5% og 77,5% i både SATB1 shRNA1 og shRNA2 henholdsvis hvorimod ingen signifikante ændringer i SATB1 ekspression blev bemærket i PC-3M celler behandlet med kontrol shRNA. Desuden SATB1 knockdown faldt migrationen og invasion kapaciteter af PC-3M celler sammenlignet med den parentale cellelinje og kontrol shRNA celler. Migrationen og invasive kapacitet in vitro af SATB1 mRNA-celler blev reduceret med 68-80%, hvilket korrelerede med forøget ekspression af E-cadherin og nedsatte niveauer af MMP-9 efter shRNA knockdown (figur 4B). Reduktion af SATB1 niveauer i PC-3M-celler nedsat celleproliferation, restaureret forankringsafhængige vækst og vendte tilbage cellerne til en polariseret morfologi som observeret under lysmikroskopi (figur 4C).

prostatacancer PC-3M-celler blev transficeret med og uden DNA (mock) eller SATB1 målrettet shRNA vektor 1 og 2 og fortsatte i kultur i 24 timer. (A) SATB1, E-cadherin, MMP9 og beta actin total protein udtryk blev analyseret ved Western blotting. (B) SATB1 lyddæmpning i PC-3M celler var forbundet med lav invasive og migration potentiale. Bars repræsenterer middelværdien ± SE af tre forskellige assays. **

P

0,001

versus

kontrol. (C) Repræsentative PC-3M celler billeder er vist med og uden SATB1 shRNA transfektion. Detaljer er beskrevet i ‘materialer og metoder’ sektionen.

SATB1 Fremmer Aggressiv Fænotype i Prostata epitelceller

Vi næste undersøgt, om ektopisk udtryk for SATB1 er tilstrækkelig til at fremkalde invasiv aktivitet i viralt transformeret ikke-tumorigene humane prostata-epitelceller. Kontrolsystemer PZ-HPV-7-celler blev transient transficeret med pCMV6-A6 Sand Clone humant plasmid DNA indeholdende SATB1 og med SATB1 mock RNA. Transfektion med SATB1 ekspressionsplasmid forøget ekspression af SATB1 i PZ-HPV-7 celler og øget migration og invasion kapaciteter

in vitro

med 50-67%. SATB1 overekspression i PZ-HPV-7-celler resulterede i nedsat ekspression af E-cadherin og stigning i MMP-9-niveauer i disse celler (figur 5A-C).

PZ-HPV-7 celler blev transficeret med og uden DNA (mock) eller SATB1 målrettede vektor 1 og fortsatte i kultur i 24 timer. (A) SATB1, E-cadherin, MMP9 og histon H4 protein udtryk blev bestemt i den cytosoliske og nukleare fraktion ved Western blotting. SATB1 overekspression resulterede i fald E-cadherin ekspression og opreguleret MMP9-ekspression. (B) Overekspression af SATB1 i PZ-HPV-7-celler var forbundet med øget invasiv potentiale. Bars repræsenterer middelværdien ± SE af tre forskellige assays. **

P

0,001

versus

kontrol. (C) Repræsentant PZ-HPV-7 billeder med og uden SATB1 overekspression vektor trasfection. Detaljer er beskrevet i ‘materialer og metoder’ sektionen.

SATB1 Depletion inhiberer tumorvækst i athymiske nøgne mus xenograft

Vi testede, om SATB1 udtømning fra PC-3M celler hæmmede tumorvækst. Til disse undersøgelser udviklede vi cellelinier, blev stabilt gjort tavse for SATB1 ekspression under anvendelse af en shRNA-lentiviral afgivelsessystem. Celler blev udvalgt op til 10 passager og celler over passage 11 blev anvendt til undersøgelserne. Et signifikant fald i SATB1 ekspression blev observeret i PC-3M-KO-celler. Knockdown af SATB1 var mere fremtrædende i den nukleare fraktion i disse celler. SATB1-KO-celler udviste en stigning i fordoblingstid fra 26.86 ± 4,89 timer, sammenlignet med PC-3M celler med 20.04 ± 4,34 t. Vi bestemt også den invasive kapacitet

in vitro

af SATB1-KO celler. Konsekvent udtømning af SATB1 reducerede kolonidannelse af disse celler i blød agar, hvilket indikerer, at tab af SATB1 genoprettet deres forankringsafhængige vækst (figur S1 A-C).

Dernæst fortsatte til

in vivo

studier. Kontrolsekvenserne PC-3M-celler og SATB1 KO-celler blev injiceret på flankerne af nøgne mus til dannelse af tumorer. Tumorvolumenet blev registreret på skiftende dage, og forsøget blev afsluttet den 31. dag som tumorstørrelsen af ​​PC-3M tumorer var stort, hvorimod mus injiceret med SATB1 KO klon resulterede i reduceret tumorvækst med et fald i tumorvægt og volumen (P SATB1 knockdown resulterede i markant reduktion i protein ekspression af PCNA i tumorxenoplantater. En stigning i E-cadherin ekspression blev observeret i SATB1-KO tumorer sammenlignet med PC-3M tumorer. Disse resultater indikerer, at SATB1 ekspression i PC-3M-celler kan være en forudsætning for tumorvækst og aggressivitet af disse celler.

(A) SATB1 knockout i PC-3M-celler resulterede i fald i tumorvolumen. (B) Fotografi af tumor xenograft i PC-3M og SATB1-KO tumorer. (C) Tumorer blev udskåret, vejet og målt ved afslutningen af ​​undersøgelsen. Tumorvægt blev signifikant reduceret i SATB1-KO tumorer i athymiske nøgne mus. Ca. 1 x 10

6 celler blev injiceret i flankerne af hver mus til at indlede ektopisk prostatatumor som beskrevet i »materialer og metoder”. Tumorstørrelse blev målt to gange ugentligt i to dimensioner under hele forsøget. Tumorvolumen (mm3) og vådvægt af tumorer er repræsenteret som gennemsnittet af 8-10 tumorer i kontrol PC-3M og SATB1-KO PC-3M tumorer.