PLoS ONE: P2Y2 Receptor og EGFR samarbejder om at fremme prostatakræft Cell Invasion via ERK1 /2 Pathway

Abstrakt

Som et medlem af G-protein-koblede P2Y-receptorer, P2Y2-receptoren kan lige så aktiveres af ekstracellulær ATP og UTP. Vore tidligere studier har vist, at aktivering af P2Y2-receptoren ved hjælp af ekstracellulær ATP kunne fremme prostatacancer celleinvasion og metastase

in vitro

in vivo

via regulering udtrykkene for nogle epitel-mesenkymale overgang /invasion -relaterede gener (herunder IL-8, E-cadherin, sneglen og Claudin-1), og den væsentligste ændring i ekspression af IL-8 blev observeret efter P2Y2 receptoraktivering. Imidlertid signalvejen nedstrøms for P2Y2-receptoren og den rolle af IL-8 i P2Y2-medieret prostatacancer celleinvasion fortsat uklare. Her fandt vi, at ekstracellulær ATP /UTP induceret aktivering af EGFR og ERK1 /2. Efter knockdown af P2Y2-receptoren, ATP -stimuleret phosphorylering af EGFR og ERK1 /2 blev signifikant undertrykt. Yderligere forsøg viste, at inaktivering af EGFR og ERK1 /2 dæmpede ATP-induceret invasion og migration, og undertrykte ATP-medieret IL-8-produktion. Desuden knockdown af IL-8 inhiberede ATP-medieret invasion og migration af prostatacancerceller. Disse resultater tyder på, at P2Y2-receptoren og EGFR samarbejder om at opregulere IL-8 produktion via ERK1 /2-vejen og dermed fremme prostatakræft celle invasion og migration. Således blokering af P2Y2-EGFR-ERK1 /2-vejen kan give effektive terapeutiske interventioner for prostatakræft

Henvisning:. Li WH, Qiu Y, Zhang HQ, Tian XX, Fang WG (2015) P2Y2 receptor og EGFR samarbejde om at fremme prostatakræft Cell invasion via ERK1 /2 Pathway. PLoS ONE 10 (7): e0133165. doi: 10,1371 /journal.pone.0133165

Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, UNITED STATES

Modtaget: Marts 21, 2015; Accepteret: 23 Juni 2015; Udgivet: den 16. juli, 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af tilskud til WGF fra National Natural Science Foundation of China (81321003) og 973 Program (2010CB529402) fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme i menneskets mandlige befolkning [1]. De fleste dødsfald relateret til prostatacancer skyldes invasion og metastase. Cell invasion og metastase er komplekse processer, der er reguleret af flere signalveje som MAPK, Wnt og Notch veje. Aktivering af disse veje er primært afhængig af samspillet mellem receptorer og ekstracellulære signalmolekyler [2].

Ekstracellulær adenosin 5′-trifosfat (ATP) er en vigtig signalmolekyle i væv mikromiljø, som medierer forskellige biologiske funktioner via aktivering af P2-receptorer [3]. To underfamilier af P2-receptorer har være

α i pattedyrceller. Den ene er P2X familie af ligand-gatede ionkanal-receptorer (P2X1-7), og den anden er P2Y-familien af ​​G-proteinkoblede receptorer (P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13, 14) [4]. Vores tidligere undersøgelse viste, at aktivering af P2Y-receptorer, som ATP forbedret prostatacancer celleinvasion [5]. Vi fandt endvidere, at P2Y2, en foretrukken receptor for ATP og UTP, bidrog til invasion og metastase af prostata kræftceller [6]. Imidlertid signalvejen (e) nedstrøms for P2Y2-receptoren, især i prostatacancer progression, er stadig ikke klar.

Som medlem af CXC-kemokin-familien, IL-8-ekspression er lav i normalt væv og kan induceres ved en række stimuli, såsom vækstfaktorer og inflammatoriske cytokiner i patologiske [7] betingelser. Ekspressionen af ​​IL-8 er ofte forhøjet i humane tumorceller og væv [8]. Det er rapporteret, at IL-8 fungerer som en væsentlig regulerende faktor i tumormikromiljøet og spiller en afgørende rolle i tumorinvasion og metastase [9]. Vi har tidligere vist sig, at aktivering af P2Y2-receptoren opreguleres ekspressionen og sekretionen af ​​IL-8 [6]. Imidlertid er funktionen af ​​IL-8 i P2Y2-receptor-fremmet invasion af prostatacancerceller fortsat ukendt. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge signalvejen (r) nedstrøms af P2Y2-receptoren, og til at undersøge, hvilken rolle af IL-8 i P2Y2 receptor-forfremmet prostatakræft celle invasion.

Materialer og metoder

kemikalier og antistoffer

ATP (adenosin-5′-triphosphat), UTP (uridin-5′-triphosphat), AG1478 (EGFR inhibitor) og U0126 (MEK1 /2-inhibitor) blev alle indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO , USA). ATP og UTP blev begge opløst i normalt saltvand og anvendt i en koncentration på 100 uM. AG1478 blev opløst i DMSO og anvendt i en koncentration på 100 nM. U0126 blev opløst i DMSO og anvendt i en koncentration på 10 uM. Antistofferne ifølge P2Y2 (kanin polyklonale antistof, sc-20124), β-actin (monoklonalt museantistof, sc-8432), ERK1 /2 (kanin polyklonale antistof, sc-94) og EGFR (monoklonalt muse-antistof sc-373.746) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistofferne ifølge phospho-EGFR (kanin monoklonalt antistof, # 8543, Tyr-1068) og phospho-ERK1 /2 (kanin polyklonale antistof, # 9101, Thr202 /Tyr204) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).

Cellelinier og dyrkningsbetingelser

To subkloner 1E8 og 2B4 blev afledt fra PC-3M humane prostatacarcinom-cellelinie, som tidligere blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) . The 1E8-cellelinien var stærkt metastatisk, mens 2B4-cellelinien var ikke-metastatisk [10]. DU-145-cellelinien blev erhvervet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Alle celler blev dyrket i RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum, og holdes i en vandmættet atmosfære ved 37 ° C med 5% CO

2.

Revers transkription og real-time PCR

Celler blev dyrket i monolag med eller uden ATP behandling. Totalt RNA blev isoleret med Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Revers transkription blev udført under anvendelse af M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) til opnåelse af cDNA, ifølge producentens anvisninger. Dernæst blev real-time PCR udført med primerne af IL-8 (sense: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3 ‘; antisense: 5′- AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3′) eller β-actin (sense: 5’- GGATGCAGAAGGAGATCACTG-3 ‘ antisense: 5’-CGATCCACACGGAGTACTTG-3 ‘). Real-time PCR-reaktion blev udført på en ABI StepOne Real-Time PCR systemet (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i tre eksemplarer. Reaktionsblandingen 20 pi bestod af 2 pi cDNA (20 ng /pl), 100 nM af primere og 10 pi SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Japan) indeholdende AmpliTaq Gold DNA-polymerase. Prøver blev først denatureret ved 95 ° C i 10 minutter og derefter PCR reaktionen forløb i 40 amplifikationscykler som følger: 15 s ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Derefter blev gennemført en dissociation kurve analyse og smeltende temperaturer (Tm) af de dannede PCR amplikoner blev observeret at skelne de forstærkede sekvenser af interesse fra ikke-specifikke dem eller primer lysdæmpere. Ekspressionen af ​​IL-8 blev normaliseret ved β-actin. Det 2 –

ΔΔCt metode blev anvendt til relativ kvantificering som tidligere beskrevet [11, 12]

Cell lyse og vestlige blotting

Cellerne blev skyllet to gange med iskold PBS og lyseret. i lysepuffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 250 mM NaCl, 4 mM EDTA, 0,5% NP-40, 20 mM β-glycerophosphat, 1 mM NaF med proteaseinhibitorer (Roche, Mannheim, Tyskland). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af et BCA proteinassaykit (Applygen Technologies Inc, Beijing, Kina). Lige store mængder totalt protein blev påsat og separeret ved SDS-PAGE-gel, og derefter blev overført til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Efter blokering med 5% BSA ved stuetemperatur i 1 time, blev blots probet med primære antistoffer mod P2Y2 (1: 500), β-actin (1: 1000), EGFR (1: 500), ERK1 /2 (1: 1000 ), phospho-EGFR (1: 1000) eller phospho-ERK1 /2 (1: 1000) ved 4 ° C natten over. Derefter blev blottene vasket med PBS i tre gange og inkuberet med sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time. De immunoreaktive bånd blev visualiseret ved et forbedret kemiluminescensdetektion systemet (Applygen Technologies Inc), og kvantificeres med softwaren i Mængde One (Bio-Rad).

siRNA og transfektion

To P2Y2 siRNAs ( P2Y2 si # 1 og P2Y2 si # 2) og en kontrol siRNA (negativ) blev anvendt som beskrevet tidligere [6]. To IL-8 siRNAs (IL-8 si # 1 og IL-8 si # 2) blev brugt til at lukke munden på ekspressionen af ​​IL-8. IL-8 siRNAs blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) med sekvensen som følger:

IL-8 si # 1, 5′-GAACTTAGATGTCAGTGCATA-3 ‘;

IL -8 si # 2, 5′-GCCAAGGAGUGCUAAAGAA-3 ‘.

a fluorescensmærket siRNA oligonukleotid blev anvendt til direkte observere siRNA transfektionseffektivitet, og en scramble siRNA oligonukleotid blev anvendt som kontrol siRNA (negativ). Celler blev podet i plader med 6 brønde med en densitet på 1 x 10

4 celler /brønd. Tolv timer senere, blev celler transficeret med siRNA’er af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Seks timer senere blev mediet erstattet med frisk 1640 medium suppleret med 10% FBS. Tyve timer efter transfektion blev cellerne delt. Efter yderligere 12 timer blev knockdown effektivitet bestemt ved western blotting, og cellerne blev anvendt til følgende forsøg.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Cell supernatant blev opsamlet for at måle IL-8-protein niveau ved hjælp af Quantikine IL-8 ELISA-kit (Invitrogen). Prøver blev analyseret in duplo. Aflæsninger blev sammenlignet med standardkurven. Derefter blev cellerne lyseret i lysisbuffer og totale protein- koncentrationer blev bestemt ved BCA-assay. Endelig blev den relative koncentration af IL-8-protein i cellesupernatanten bestemt ved at normalisere til totalt protein af hele celleekstrakt.

Invasion assay

Invasion assay blev udført som tidligere beskrevet [6] . Kort beskrevet blev celler høstet og resuspenderet i RPMI 1640 med 0,1% BSA ved en densitet på 5 x 10

5 celler /ml. Dernæst blev 200 pi cellesuspensioner med eller uden ATP behandling placeret i det øvre kammer coatet med Matrigel (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). NIH3T3-konditionerede medium blev opnået ved inkubering NIH3T3-celler i 24 timer i serumfrit 1640 medium og fyldes i det nedre kammer (600 pi) som kemo-tiltrækningsstof, ifølge fremgangsmåden beskrevet af Albini et al [13] metode. Cellerne fik lov til at invadere i 12 timer ved 37 ° C. Efter fikseret med 4% formaldehyd blev celler på den nedre overflade af membranerne farvet med krystalviolet og observeret under et mikroskop ved × 200 forstørrelse. Antallet af invaderede celler i syv felter blev talt, og gennemsnittet for hvert kammer blev bestemt.

Migration assay

Et hundrede tusinde celler i 100 pi RPMI 1640 suppleret med 0,1% BSA blev placeret i det øvre kammer. NIH3T3-konditionerede medium blev opnået ved inkubering NIH3T3-celler i 24 timer i serumfrit 1640 medium og fyldes i det nedre kammer (600 pi) som kemo-tiltrækningsstof. Celler blev inkuberet i 12 timer ved 37 ° C med eller uden ATP behandling. Derefter celler på den nedre overflade af membranen blev fikseret og farvet med krystalviolet. Antallet af migrerede celler blev talt under et lysmikroskop ved × 200 forstørrelse. Det gennemsnitlige antal af migrerede celler blev bestemt ud fra syv repræsentative felter.

statistiske analyser

De kvantitative resultater blev præsenteret som et middel ± SD af tre bestemmelser og data blev analyseret med den software pakke af SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Students t-test blev anvendt til at detektere, om der var en signifikant forskel mellem to grupper. Parametrisk ANOVA blev anvendt, når flere grupper blev sammenlignet. Enhver P-værdi på mindre end 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant.

Resultater

Ekstracellulær ATP eller UTP stimulation aktiverer EGFR og ERK1 /2

I den foreliggende undersøgelse, efter inkubering med 100 pM ATP, vi har registreret phosphoryleringen af ​​EGFR i 2B4, 1E8 og DU-145-celler ved Western blotting ved 2 min, 5 min, 10 min og 15 min. Vores resultater viste, at ATP-stimulering resulterede i aktivering af EGFR (Tyr-1068) i prostatacancerceller (figur 1A). Lignende resultater blev observeret med UTP behandling (Fig 1B). Vores tidligere undersøgelse viste, at ATP kunne inducere aktivering af ERK1 /2 i prostatacancer 2B4, 1E8 og DU-145-celler [12]. Her har vi yderligere fundet, at UTP også stimuleret aktivering af ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) i 2B4, 1E8 og DU-145-celler (Fig 1C). Blandt otte P2Y subtypereceptorer identificeret i mammale celler, kan kun P2Y2 receptor være ligeligt aktiveret af ATP og UTP [14]. Derfor viser disse resultater, at P2Y2-receptoren kan være involveret i ekstracellulær ATP /UTP-induceret aktivering af EGFR og ERK1 /2. De følgende eksperimenter blev kun udført med ATP behandling.

(A) Efter behandling med 100 uM ATP, phosphorylering af EGFR blev detekteret ved western blotting. (B) Efter behandling med 100 uM UTP, blev phosphorylering af EGFR detekteret ved western blotting. (C) Efter behandling med 100 uM UTP, blev phosphorylering af ERK1 /2 detekteret ved western blotting. Resultaterne blev påvist ved histogrammer at kvantificere ekspressionsniveauerne. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD (lodrette søjler). Der blev udført tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 vs. kontrol celler

P2Y2 receptor medierer aktivering af EGFR og ERK1 /2

For at identificere den rolle P2Y2 receptor i ATP-induceret aktivering af EGFR og ERK1 /2, blev siRNA introduceret til tavshed ekspression af P2Y2 receptor i 2B4 og 1E8 celler. Fremtrædende knockdown effektivitet blev identificeret ved western blotting (Fig 2A). Efter inkubering med 100 pM ATP i 5 min blev phosphorylering af EGFR og ERK1 /2 undersøgt under anvendelse western blotting. Her fandt vi, at ATP behandling induceret aktivering af EGFR og ERK1 /2 i kontrol siRNA celler. Efter knockdown af P2Y2-receptoren, blev aktiveringen af ​​EGFR og ERK1 /2 induceret af ATP undertrykte signifikant (Fig 2B og 2C). Sammen antyder disse data, at ATP-induceret aktivering af EGFR og ERK1 /2 blev primært reguleres P2Y2-receptoren.

(A) 2B4 og 1E8-celler blev transficeret med to forskellige P2Y2 siRNA’er (P2Y2 si # 1 og P2Y2 si # 2) eller en kontrol siRNA (negativ), hhv. Knockdown effektivitet blev bestemt ved western blotting. Efter transfektion med to forskellige P2Y2 siRNA’er (P2Y2 si # 1 og P2Y2 si 2 #) eller en kontrol siRNA (negativ) fik henholdsvis 2B4 og 1E8-celler inkuberet med eller uden 100 pM ATP i 5 min. Derefter blev proteinet ekstraheret for phosphorylering påvisning af (B) EGFR og (C) ERK1 /2. Resultaterne blev påvist ved histogrammer at kvantificere ekspressionsniveauerne. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD (lodrette søjler). Der blev udført tre uafhængige forsøg. * P 0,05

EGFR er involveret i ATP-induceret aktivering af ERK1 /2

For at udforske den rolle, EGFR i ATP-induceret aktivering af ERK1 /2, AG1478 (. 100 nM), en selektiv inhibitor af EGFR, blev anvendt før ATP behandling. Figur 3 viste, at ATP induceret aktivering af EGFR og ERK1 /2 i kontrolgruppen (DMSO-behandlede celler), hvorimod forbehandling med AG1478 undertrykte signifikant ATP-induceret phosphorylering af EGFR og ERK1 /2, hvilket antyder, at ATP aktiverer ERK1 /2-vejen gennem EGFR aktivering.

efter inkubation med 100 nM AG1478 (EGFR-inhibitor) i 30 minutter, blev 2B4 og 1E8-celler behandlet med 100 pM ATP i 5 min. Phosphorylering af EGFR og ERK1 /2 blev målt ved Western blotting. Resultaterne blev påvist ved histogrammer at kvantificere ekspressionsniveauerne. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD (lodrette søjler). Der blev udført tre uafhængige forsøg. * P. 0,05

P2Y2-EGFR-ERK1 /2-vejen er involveret i prostatakræft celle invasion og migration

Dernæst at undersøge, om EGFR-ERK1 /2 vej medieret ATP -induceret invasion og migration, vi forbehandlet 2B4 og 1E8-celler med AG1478 (EGFR-inhibitor, 100 nM) og U0126 (MEK1 /2-inhibitor, 10 uM) henholdsvis før 100 pM ATP stimulering. Invasion assay og migration assay viste, at ATP behandling forbedret celle invasion og migration i kontrolgruppen (DMSO-behandlede celler). Men i AG1478- eller U0126-behandlede grupper, blev ATP-forfremmet celle invasion og migration hæmmede (Fig 4A-4C). Da P2Y2 receptor overvejende medierer ATP-induceret aktivering af EGFR og ERK1 /2 som beskrevet ovenfor, og P2Y2-receptoren er ansvarlig for ATP-stimuleret prostatacancer celleinvasion og migration som påvist i vores tidligere undersøgelse [6], resultaterne antyder kraftigt, at P2Y2 -EGFR-ERK1 /2-vejen er involveret i reguleringen af ​​prostatakræft celle invasion og migration.

(A) Celler blev høstet, resuspenderes og forbehandlet med AG1478, U0126 eller DMSO i 30 min. Derefter blev cellerne inkuberet i Transwell plade med eller uden 100 pM ATP i 12 timer invaderede /migrerede celler blev farvet med krystalviolet og observeret under et mikroskop ved × 200 forstørrelse. (B) Virkningerne af AG1478 og U0126 på invasionen af ​​2B4 og 1E8-celler. (C) Virkninger af AG1478 og U0126 for migration af 2B4 og 1E8 celler. Resultater blev påvist ved histogrammer, og data blev præsenteret som middelværdi ± SD (lodrette søjler). Der blev udført tre uafhængige forsøg. * P. 0,05

P2Y2-EGFR-ERK1 /2 vej bidrager til IL-8 opregulering

Vores tidligere undersøgelse har vist, at ATP og UTP både stimulerede produktionen af ​​IL 8, og knockdown af P2Y2 undertrykt sekretion af IL-8 [6]. Her blev 2B4 og 1E8-celler inkuberet med 100 nM AG1478 (EGFR-inhibitor) eller 10 pM U0126 (MEK1 /2-inhibitor) henholdsvis før 100 pM ATP stimulering. Ved hjælp af real-time PCR og ELISA-assay, fandt vi, at blokade af EGFR aktivering dæmpede ATP-fremmet IL-8-ekspression og sekretion, mens blokade af ERK1 /2-aktivering også inhiberede ekspression og sekretion af IL-8 (fig 5A-5D) . Som ATP induceret aktivering af EGFR og ERK1 /2 via P2Y2-receptor, sammen med de tidligere resultater, at silencing af P2Y2 med siRNA undertrykte signifikant ATP-fremmet IL-8-produktion [6], disse data stærkt indikerer, at ATP fremmer ekspression og sekretion af IL-8 via P2Y2-EGFR-ERK1 /2-vejen. Salg

2B4 og 1E8-celler blev forbehandlet med AG1478, U0126 eller DMSO i 30 min. Derefter blev cellerne inkuberet med eller uden 100 pM ATP i 12 timer. (A) og (B) mRNA-niveauet af IL-8 blev detekteret ved real-time PCR. (C) og (D) Protein niveau af IL-8 i cellesupernatanten blev undersøgt ved ELISA-assay. Resultaterne blev påvist ved histogrammer at kvantificere ekspressionsniveauerne. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD (lodrette søjler). Der blev udført tre uafhængige forsøg. * P. 0,05

Rolle af IL-8 i ATP-forfremmet celle invasion og migration

opregulering af IL-8-ekspression er forbundet med invasion og metastase i prostatacancer [9 ]. Derfor vi tavshed udtryk for IL-8 i 2B4 og 1E8 celler med siRNA at undersøge, hvilken rolle af IL-8 i ATP-forfremmet invasion og migration. To forskellige IL-8 siRNAs blev anvendt, og real-time PCR og ELISA-assay viste, at ekspression og sekretion af IL-8 blev undertrykt efter transfektion med IL-8 siRNAs (fig 6A og 6B). Vi fandt også, at IL-8 siRNA behandling kunne undertrykke den ATP-medierede stigning i IL-8-produktion (fig 6A og 6B). Desuden efter knockdown af IL-8, ATP-stimuleret celle invasion og migration af prostata kræftceller var stærkt hæmmet, hvilket tyder på, at IL-8 er en af ​​de vigtige aktører i reguleringen af ​​ATP-forfremmet celle invasion og migration (fig 7A og 7B). Salg

2B4 og 1E8-celler blev transficeret med to forskellige IL-8 siRNA’er (IL-8 si # 1 og IL-8 si # 2) eller en kontrol siRNA (negativ), hhv. Celler blev behandlet med eller uden 100 pM ATP i 12 timer. (A) IL-8-mRNA-ekspression blev påvist ved real-time PCR, og (B) IL-8-sekretion blev målt ved ELISA-assay. Resultaterne blev påvist ved histogrammer at kvantificere ekspressionsniveauerne. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD (lodrette søjler). Der blev udført tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 vs. Negativ

Efter knockdown af IL-8 ved siNRA blev celler behandlet med eller uden 100 pM ATP, og derefter udsat for (A) invasion assay og (B) migration assay. Resultater blev påvist ved histogrammer, og data blev præsenteret som middelværdi ± SD (lodrette søjler). Der blev udført tre uafhængige forsøg. * P. 0,05

Diskussion

En række undersøgelser har vist, at i tumor mikromiljø ekstracellulære ATP og dets derivater kan fungere som skadelige signaler i tumor progression [15, 16]. Vores tidligere undersøgelse viste, at aktivering af P2Y2 af ekstracellulær ATP fremmer celle invasion og metastase af prostatacancerceller

in vitro

in vivo

[6]. Tilhører G-protein-koblede receptorer (GPCR) underfamilier, er P2Y2-receptorer blevet rapporteret til par med multiple intracellulære signalveje [17, 18]. De fleste af disse veje er reguleret samtidigt ved EGFR-aktivering og involveret i tumorinvasion og metastase [19]. Men der er ingen overbevisende beviser så langt, at P2Y2 receptor fremmer prostatakræft progression via EGFR. I denne undersøgelse viste vi, at EGFR og ERK1 /2 kunne begge blive aktiveret af ATP eller UTP stimulation. Knockdown af P2Y2-receptoren undertrykt ATP-induceret phosphorylering af EGFR og ERK1 /2. Desuden blokade af EGFR undertrykte ATP-reguleret aktivering af ERK1 /2. Yderligere forsøg viste, at aktivering af EGFR-ERK1 /2 pathway forøget ATP-fremmet IL-8-produktion, som derefter fremmet invasionen og migrering af prostatacancerceller. Sammen med vores tidligere undersøgelse, at aktivering af P2Y2-receptoren med ATP fremmer celleinvasion og metastase af prostatacancerceller, denne undersøgelse tyder stærkt på, at P2Y2-receptoren fremmer prostatacancer celleinvasion og migration hovedsagelig via aktivering af EGFR-ERK1 /2-vejen og opregulering af IL -8 produktion (fig 8).

Flere veje er identificeret nedstrøms GPCR. Der er flere mulige forklaringer på den pro-invasiv virkning efter P2Y2 receptor aktivering. En vej er at ATP stimulerer G

qα-afhængig phospholipase C (PLCb) aktivitet, som frembringer inositol 1,4,5-trisphosphat (IP3) og diacylglycerol (DAG), hvilket resulterer i en forøgelse af den intracellulære calcium-koncentration og DAG -afhængige aktivering af protein kinase C (PKC), hhv. PLCb2 har vist sig at være vigtigt for brystkræft cellemigrering [20]. Ændringer i intracellulær Ca

2+ koncentration ændrer væsentlige processer i tumorcellemigration og invasion [21]. PKC regulerer metastase gennem phosphorylering af mange vigtige proteiner i forskellige trin i metastase. Alle disse regulatoriske elementer er aktivt involveret i vores prostatakræft undersøgelser. I vores tidligere undersøgelser, observerede vi bemærkelsesværdig ophobning af IP3 og betydelig intracellulære Ca

2+ mobilisering prostata kræftceller efter ATP behandling [22]. Dette er naturligvis skyldes aktivering af PLCb af G-protein-koblede P2Y2 receptor.

En anden vej er at P2Y2-receptoren kan interagere med αVβ

3/5 integriner via en ekstracellulært orienteret RGD domæne til regulere aktiviteterne af G

12-afhængige Rho, Go-afhængige Rac, LIM-kinase, og cofilin, proteiner, der regulerer actin cytoskeletale omrokeringer, som er vigtige elementer i celle migration [23]. Vi har tidligere vist, at ATP-induceret aktivering af Rac1 og Cdc42, fremmet dannelsen af ​​lamellipodia og filopodia, og øget motilitet prostata kræftceller [12], hvilket indikerer en mulig rolle af P2Y2 receptor i prostatakræft celle motilitet.

P2Y2-receptoren kan også interagere med EGFR at aktivere ERK1 /2-vejen, da der er nogle beviser, at transaktivering af P2Y2-receptoren og EGFR findes i visse celletyper, f.eks membran fordeling af P2Y2 transregulated af EGFR i blodkarrenes glatte muskelceller [24 ], fremme af dannelsen af ​​EGFR /ErbB3 heterodimerer af P2Y2 receptor i spytkirtel celler [25]. Phosphorylering af EFGR ved P2Y2-receptoren menes hovedsageligt på grund af Src-afhængig rekruttering af P2Y2-receptoren til en signalering kompleks indeholdende EGFR som reaktion på P2Y2 ligander [26]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at EGFR og ERK1 /2 kunne aktiveres ved hjælp af ekstracellulær ATP eller UTP stimulation. Knockdown af P2Y2-receptoren undertrykt ATP-induceret phosphorylering af EGFR og ERK1 /2. Så vidt vi ved, vores nuværende data repræsenterer det første eksempel, at EGFR deltager i P2Y2-receptor-regulerede celleinvasion af prostatacancer.

Det er velkendt, at EGFR deltager i forskellige cellulære processer, såsom vækst, differentiering, tumorigenese, invasion og metastase af cancer [27, 28]. Forøget EGFR-ekspression er ofte påvist i prostatacancer, og er forbundet med dårlig prognose [29]. Monoklonalt antistof mod EGFR har fået en effektiv forbedring af patienter med prostatacancer [30]. Som en underfamilie af MAPK’er, ERK1 /2 er den bedst karakteriserede cytoplasmatiske kinase aktiveres af EGFR, og hæmning af ERK1 /2 er blevet anvendt som en biomarkør for EGFR-inhibitor handling [31]. Inhibering af ERK1 /2-vejen også er blevet betragtet som en vigtig strategi behandling for prostatacancer [32, 33]. I dette studie demonstrerede vi en signifikant funktion af P2Y2-EGFR-ERK1 /2-vejen ved mediering prostatacancer celleinvasion og migration. Sammen med vores tidligere observation, at ekstracellulær ATP er et vigtigt pro-invasiv middel i tumor mikromiljø, kan dette hjælpe til at belyse reguleringsmekanismen (er) underliggende EGFR-aktivitet i prostatakræft progression.

IL-8 er fundet at være stærkt udtrykt i androgen-uafhængige metastatiske cellelinier, såsom PC-3-cellelinjen [9]. Kliniske undersøgelser viser også, at IL-8-produktion er forhøjet i tumorvæv og serum fra patienter med prostatacancer, og der er en direkte sammenhæng mellem høje IL-8 og tumor progression [34]. Forøgelse af IL-8-produktion er associeret med tumor angiogenese, proliferation og metastase af prostatacancer

in vitro

in vivo

[35]. Her, vores undersøgelse viser, at ATP opreguleres ekspressionen og sekretionen af ​​IL-8 via P2Y2-EGFR-ERK1 /2-vejen, og IL-8-produktion bidraget til ATP-fremmet invasion og migration af prostatacancerceller.

sammenfattende vores resultater viser, at P2Y2-receptoren opregulerer IL-8 produktion og dermed fremme invasionen og migration af prostata cancer celler. Cross-taler med EGFR og efterfølgende aktivering af ERK1 /2-vejen kan være en af ​​de vigtige mekanismer i P2Y2-receptorfunktion. Derfor kan terapier, der er målrettet P2Y2-EGFR-ERK1 /2-vejen giver effektive behandlingsstrategier for prostatakræft.

Tak

Vi takker professor Jian Zhang for at give nyttige diskussion for færdiggørelsen af ​​manuskriptet .