PLoS ONE: Molekylær Anerkendelse af Humane Leverkræft Cells Brug DNA Aptamere Genereret via Cell-SELEX

Abstrakte

De fleste kliniske tilfælde af leverkræft kan ikke diagnosticeres, før de har udviklet sig til et fremskredent stadium, hvilket resulterer i høj dødelighed. Det er velkendt, at gennemførelsen af ​​tidlige påvisningsmetoder og udvikling af målrettede behandlinger for leverkræft er afgørende for at nedbringe de høje dødelighed forbundet med denne sygdom. For at nå disse mål, er der behov for molekylære prober stand til at genkende liver cancer cellespecifikke mål. Her beskriver vi et panel af aptamerer stand til at skelne leverkarcinom fra normale leverceller. Aptamererne, der blev udvalgt af cellebaserede SELEX (Systematic Evolution af ligander ved eksponentiel Enrichment), har Kd-værdier i området fra 64 til 349 nM mod målet human hepatomacellelinie HepG2, og også erkende ovariecancerceller og lunge adenocarcinom. Proteinase behandling eksperiment viste, at alle aptamerer kunne genkende target HepG2 celler gennem overfladeproteiner. Dette resultat foreslået, at disse aptamerer kunne anvendes som potentielle prober til yderligere forskning i kræft studier, såsom udvikling af tidlig påvisning assays, målrettede behandlinger og billeddannende midler, samt til undersøgelse af fælles membranproteiner i disse skelnes kræftformer.

Henvisning: Xu J, Teng IT, Zhang L, Delgado S, Champanhac C, Cansiz S, et al. (2015) Molekylær Anerkendelse af Human Liver Cancer Cells Brug DNA Aptamere Genereret via Cell-SELEX. PLoS ONE 10 (5): e0125863. doi: 10,1371 /journal.pone.0125863

Academic Redaktør: Vittorio de Franciscis, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), ITALIEN

Modtaget: Februar 26, 2015; Accepteret: 25 marts 2015; Udgivet: Maj 4, 2015

Copyright: © 2015 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information Files

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health GM079359 og National Institutes of Health CA133086; Statens Scholarship Fund, PI = Jiehua Xu; National Natural Science Foundation of China 81101866, PI = Jiehua Xu; National Natural Science Foundation of China 81430041, PI = Jiehua Xu; og grundforskning Midler til Central Universiteter 11ykpy41, PI = Jiehua Xu. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie degign, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Liver cancer er den sjette mest almindelige cancer i verden og den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald [1], hvilket resulterer i 0,7 millioner dødsfald årligt. Som den største indre organ og den største kirtel i den menneskelige krop, leveren tjener mange vitale funktioner, herunder nedbryde og lagring næringsstoffer, der kræves til energiproduktion eller vævsreparation, filtrering og nedbryde giftigt affald i blodet, syntetisering fleste af koagulationsfaktorer at holde kroppen fra massive blødninger, og producerer kemikalier og hormoner er nødvendige for at regulere mange kropsfunktioner. Trods denne kritiske rolle, er udviklingen af ​​leverkræft sjældent diagnosticeret i sin vorden, fordi i de fleste tilfælde har de tegn og symptomer ikke, før de senere faser, hvilket gør det til en meget dødelig malignitet med en lille 5-årige overlevelsesrate. Således udvikler tidlige påvisningsmetoder og avancerede målrettede behandlinger er afgørende i bekæmpelsen leverkræft.

Aptamerer er korte, enkeltstrengede DNA- eller RNA-oligonukleotider i stand til specifik binding til en række tilsvarende målmolekyler med høj affinitet. Metoden til at generere aptamerer kaldet SELEX (Systematisk Evolution af ligander ved eksponentiel Berigelse) [2, 3] følger en række trin: 1) kemisk syntese af et oligonukleotid bibliotek med 10

13-10

16 enkeltstrenget nukleinsyremolekyler, 2) direkte eksponering af biblioteket til målene at differentiere bindende strenge fra tilskuere, 3) ekstraktion og amplifikation af overlevende, 4) tilsætning af aptameren overlevende efter iterative runder, og endelig 5) sekventering for at identificere individuelle kandidater.

SELEX teknologien blev yderligere udviklet i vores laboratorium til at udnytte hele celler som mål i aptamer udvælgelsesprocessen. Celle-SELEX proces sikrer, at kandidat-oligonukleotider binder til det native tilstand proteinmål på kræft celleoverfladen [4]. Brug af celle-SELEX, kan aptamerer genereres for syge celler uden forudgående kendskab til et givet mål molekylære signatur, hvilket således gør det muligt at finde molekylære prober til sygdomme med hidtil ukendte biomarkører, som efterfølgende kan identificeres under anvendelse af kemisk og molekylærbiologiske metoder [5 , 6]. En række aptamerer stand til at genkende forskellige celletyper, herunder røde blodlegemer (RBC) [7], og celler til lymfatisk leukæmi [4], myeloid leukæmi [8], colorectal cancer [9], brystcancer [10], ovarie cancer [11], småcellet lungecancer [12], ikke-småcellet lungekræft [13, 14], og pancreascancer [15], er alle blevet frembragt ved hjælp af denne metode. Desuden har flere celleoverflade biomarkør-aptamer par blevet identificeret, herunder alkalisk phosphatase placenta-lignende 2 (ALPPL-2) [15], Prominin-1 (CD133) [16], epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) [17] , human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) [18, 19], immunoglobulin tung mu-kæde (IGHM) [20], proteintyrosinkinase 7 (PTK7) [4, 5], og deres tilsvarende aptamerer. Opdagelsen af ​​kræft specifikke aptamerer giver stort potentiale i biomedicinsk forskning og i udviklingen af ​​celle-specifik diagnose og terapi [21], især når celleoverfladen biomarkører er ofte relateret til celle regler eller signalveje.

Som oligonukleotider , aptamerer er let at reproducere ved kemisk syntese med minimale batch-til-batch variationer. Desuden med kemisk modifikation, er det let at indføre funktionelle moduler på aptamerer til at opfylde specifikke behov, såsom fluoroforer [22-25], kemiske linkere [26, 27], terapi [28-30], eller endda nanopartikler [31- 33]. Med de ovennævnte bemærkelsesværdige egenskaber, har udviklingen af ​​aptamerer været udnyttet i forskellige områder, især de, der involverer biomedicinske anvendelser [34-41]. Yderligere forskning har ført til forbedring af specificitet og effekt af at levere imaging, diagnostiske eller terapeutiske midler med escort aptamerer [24, 33, 42].

Formålet med den aktuelle undersøgelse var at opdage aptamerer der genkender hepatocellulært carcinom (HCC), som er den største form for leverkræft, der tegner sig for 90% af alle leverkræft [43]. Her blev cellen-SELEX-metoden anvendes til at frembringe aptamerer kan differentiere human hepatocellulær levercarcinoma HepG2 fra normal lever epitelcellelinie THLE-2. Disse aptamerer kan bruges som redskaber i yderligere biomedicinske undersøgelser og kliniske anvendelser.

Materialer og metoder

Cell Kultur og Buffere

HepG2 (hepatocellulært carcinom) og THLE-2 ( normale lever) celler blev valgt som positive og negative selektionssystemer celler. Andre cellelinjer, herunder HeLa (livmoderhalskræft), MCF-7 og MDA-MB-231 (brystadenocarcinom), PL45 (pancreascancer), H226 (lunge pladecarcinom), A549 (lungeadenocarcinom), Ramos (Burkitts lymfom), CCRF-CEM (T-celle leukæmi), og TOV-21G (ovariecancer), blev anvendt til at undersøge selektiviteten af ​​aptameren kandidater. Alle cellelinier blev fremskaffet fra American Tissue Culture Collection (ATCC). HepG2, A549, MCF-7, og PL45 blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM); Ramos, CCRF-CEM, H226 og HeLa-celler blev opretholdt i RPMI-1640. Den TOV-21G-cellelinien blev opretholdt i kultur med MCBD 105: Medium 199 (1: 1). Alle ovennævnte medier blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. MDA-MB-231-cellelinie blev dyrket i Leibovitz L-15 medium (ATCC) ved 37 ° C og forhindres i at kontakte CO

2. BEGM Bullet Kit (Lonza /Clonetics Corporation) blev anvendt til fremstilling vækstmedium for THLE-2-celler. Gentamycin /amphotericin (GA) og Epinefrin blev kasseret fra sættet, men en ekstra 5 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF), 70 ng /ml phosphoethanolamin, og alle andre tilsætningsstoffer i kittet blev inkluderet i basalt medium. Alle medier blev suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) (Gibco) og 1% penicillin-streptomycin (100 enheder /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin) (Gibco). Alle celler, bortset fra MDA-MB-231, blev inkuberet ved 37 ° C under en CO 5%

2 atmosfære.

Vaskebuffer blev fremstillet ud fra Dulbeccos phosphatbufret saltvand (PBS) med calciumchlorid og magnesiumchlorid (Sigma-Aldrich) med yderligere glucose (4,5 g /l) og MgCl

2 (5 mM). Bindingsbuffer blev fremstillet ved tilsætning af gær-tRNA (0,1 mg /ml) (Sigma-Aldrich) og BSA (1 mg /ml) (Fisher) til vaskebufferen.

Syntese og oprensning af DNA-bibliotek og primere

Den forreste og reverse primere blev mærket med FAM og biotin, henholdsvis ved deres 5′-ender. Sekvensen for den fremadrettede primer var 5′-FAM-AGA GAC CCT GAC TGC GAA-3 ‘; sekvensen af ​​den reverse primer var 5’-Biotin-AAG AAG CCA CCG TGT CCA-3 ‘. DNA-biblioteket bestod af et randomiseret 25-nt region flankeret af primer binding sites: 5’-AGA GAC CCT GAC TGC GAA- (N

25) -TGG ACA CGG TGG CTT CTT-3 ‘. Alle bibliotek og primersekvenser blev købt hos Integrated DNA Technologies (IDT) og oprenset ved omvendt fase-HPLC.

polymerasekædereaktion

PCR-amplifikation parametre blev optimeret før udvælgelsesprocessen. Alle PCR-blandinger indeholdt 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 1,5 mM MgC

2, dNTP’er (0,2 mM hver), 0,5 uM af hver primer, og varmstart Taq DNA-polymerase (0,015 enheder /pl) . PCR blev udført på enten en BioRad T100 eller C1000 Thermo Cycler, og alle PCR-reagenser blev indkøbt fra Takara. Hver amplifikationscyklus blev udført ved 90 ° C i 30 sek, 57 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sek, efterfulgt af en endelig forlængelse i 3 minutter ved 72 ° C.

In vitro

Selection

celle-SELEX blev udført på grundlag af protokollen [44] udviklet af vores gruppe med nogle ændringer. Udvælgelsen blev udført på cellemonolag, som både positiv og negativ HepG2 THLE-2 anvendes her, er adhærente cellelinier. For den første runde af udvælgelsen, DNA puljen bestod af 20 nmol af oligonukleotidet bibliotek i 700 ml bindingspuffer. For de senere runder, blev 250 nM af oligonukleotider amplificeret fra det foregående tilbageblivende anvendes. DNA-biblioteket blev opvarmet til 95 ° C i fem minutter, efterfulgt af hurtig afkøling på is i 5 minutter før inkubering, hvilket tillader DNA-sekvenserne til dannelse af de gunstigste sekundære strukturer. DNA-biblioteket blev herefter inkuberet med monolag HepG2-celler i 1 time ved 4 ° C efter fjernelse af medium og vask to gange med vaskebuffer. Inkubationstiden faldt som markeringen skred: 60 min for runder 1 og 2, 45 min for runde 3 og 30 min for alle efterfølgende runder. Mellem hver cyklus blev cellerne vasket tre gange med vaskebuffer for at fjerne ubundne sekvenser. Vasketiden og mængden af ​​vaskebufferen blev forøget som markeringen skred at fjerne svage kandidater og få aptamerer med høj specificitet og selektivitet. Cellerne blev derefter frigjort fra skålen med en celleskraber og resterne blev opsamlet i 500 pi bindingspuffer. Komplekset blev opvarmet til 95 ° C i 10 minutter og derefter centrifugeret ved 14.000 rpm i 5 minutter. Supernatanten blev opsamlet og var klar til PCR-amplifikation i de første to runder når ingen negativ selektion var inkluderet. For senere runder med negativ selektion blev supernatanten inkuberet med monolag af negative celler THLE-2 til 1 time ved 4 ° C, og supernatanterne blev opsamlet.

Supernatanten indeholdende bundet DNA-sekvenser blev amplificeret ved PCR hjælp FAM og biotinmærkede primere. Antallet af optimerede PCR amplifikationscykler blev bekræftet med agarosegelelektroforese. Streptavidinovertrukne sepharoseperler (GE Healthcare Life Sciences) blev anvendt til at isolere PCR-produkterne fra reaktionsblandingen. Fluoroforen-mærkede enkeltstrengede DNA (ssDNA) blev derefter separeret fra det biotinylerede antisense ssDNA ved eluering med 200 mM NaOH. Endelig blev ssDNA afsaltet med en NAP-5-søjle (GE) og genopløst i bindingsbuffer.

Hele udvælgelsesprocessen blev gentaget, indtil en vedvarende signifikant berigelse opnåedes ved den 19. runde. Den berigelse af puljer blev analyseret med flowcytometri (Accuri C6, BD).

Næste generations sekventering og analyse

Beriget pool 19 blev valgt til sekventering. Den ssDNA adskilt fra pool 19 var PCR-forstærket igen for at tilføje adapter sekvenser (CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG TCT CCG ACT CAG AGA GAC FTT GAC TGC GAA og CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG ATA AGA AGC CAC CGT GTC CA ) og oprenset under anvendelse af et PCR-oprensningskit (Qiagen). De oprensede prøver blev forelagt Ion Torrent næste generations sekventering ved University of Florida, ICBR Sequencing Core Facility. Produkterne blev justeret til at identificere de mest rigelige sekvenser ved hjælp af Galaxy software. Enhver med færre end 10 eksemplarer blev fjernet fra analysen. De resterende læser (501.084) blev derefter grupperet, og de 20 mest rigelige sekvenser (tabel S1 i S1-fil) blev kemisk syntetiseret til yderligere karakterisering.

Binding Analyse

Gendannede aptamer kandidater blev syntetiseret ved standard phosphoramidit-metoden under anvendelse af en 3400 DNA-synteseapparat (Applied Biosystems) og oprenset ved omvendt fase-HPLC (Varian Prostar anvendelse af en C18-søjle og acetonitril /triethylammoniumacetat som den mobile fase). Reagenser til syntese blev indkøbt fra Glen Research. BD Accuri C6 flowcytometri (BD Immunocytometry Systems) blev anvendt til at overvåge berigelsen af ​​ssDNA sekvenser i puljer under udvælgelsesprocessen og vurdere bindende affinitet og specificitet af de udvalgte aptamer kandidater. Ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning blev anvendt til at frigøre celler, og de dispergerede celler blev derefter vasket med vaskebuffer. Når protease-behandlede celler var nødvendigt, blev trypsin anvendes i stedet for ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning. Trypsin og ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning blev begge indkøbt fra Sigma-Aldrich. Bindingsassays blev udført ved flowcytometri efter inkubation 4 x10

5 dispergerede celler i 200 pi bindingsbuffer med puljer eller aptamerer ved 250 nM i 30 minutter ved 4 ° C (eller 37 ° C som angivet). For hver aptamer kandidat, den bindende affinitet (som K

d) til målet HepG2 blev evalueret under anvendelse Sigma Plot ved at montere den relative gennemsnitlige fluorescensintensitet af binding versus koncentrationen af ​​aptamerer hjælp mætning ligning Y = B

maxX /(K

d + X) (Y er specifik binding ved en koncentration på aptamer = X i nanomolær, og Bmax er maksimal binding.) Celler blev inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter med en række forskellige koncentrationer (0,1, 0,5, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 nM) af hver genvundne aptamer med biotinmærket ved 5′-enden. Celler blev derefter vasket to gange med 1 ml vaskebuffer, suspenderet i 200 pi bindingsbuffer indeholdende streptavidin-PE og farvet i 20 min. Celler blev igen vasket to gange med 1 ml vaskebuffer og derefter suspenderet i 100 pi bindingsbuffer til flowcytometrisk analyse. Biotin-mærket uselekterede bibliotek blev anvendt som en negativ kontrol for at bestemme baggrunden binding. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af fravalgt bibliotek blev trukket fra den tilsvarende aptamer med målcellerne for at bestemme den specifikke binding af det mærkede aptamer. Alle bindingsassays blev gentaget tre gange.

Resultater og Diskussion

Udvælgelsesprocessen begyndte med en tilfældig bibliotek indeholdende ca. 1,2 × 10

16 (20 nmol) ssDNA sekvenser af 61 nukleotider ( nt), efterfulgt af sekventiel binding med mål-HepG2-celler, eluering og efterfølgende PCR amplifikation for i alt 19 runder. Counter-udvalg med THLE-2-celler blev indført i tredje runde og udføres i alle følgende runder for at eliminere muligheden for eventuelle oligonukleotider genkender fælles overflademarkører på både mål og negative cellelinjer. Berigelse blev overvåget ved at teste bindingen af ​​genvundet ssDNA fra hver runde på målceller under anvendelse af flowcytometri. Gradvise skift i fluorescensintensitet blev observeret i de efterfølgende runder. Det fluorescerende signal stoppet stigende mellem runderne 17 og 19, hvilket indebærer, at der var blevet opnået mættet binding af de berigede pools (Fig 1A). Ingen indlysende fluorescensintensitet stigning blev fundet med normale THLE-2 leverceller i pool 19 (fig 1B), hvilket indikerer, at sammenlignet med den oprindelige bibliotek, beriget ssDNA pool 19 viste præferentiel binding til HepG2-celler, ikke THLE-2-celler.

(a) bindende analyser viste en mærkbar ændring i løs vægt binding af puljen til leverkræft celler (HepG2) og stoppede stigende efter 17

th runde af valget. (B) En subtil fald i fluorescensintensitet blev observeret for de normale leverceller (THLE-2) og nåede et minimum skift i 19

th runde. Den røde kurve repræsenterer celler inkuberet med umarkeret indledende bibliotek.

ssDNA inddrives fra runde 19 blev forelagt for næste generation dyb sekventering. De hyppigst forekommende 20 sekvenser (tabel S1 i S1 File) blev kemisk syntetiseret, mærket med biotin ved 5′-enden, og derefter oprenset ved HPLC. Sekvenserne blev kvantificeret (UV 260/280) og fortyndet til standard koncentrationer.

Binding analyse blev udført ved at inkubere positive eller negative celler med 250 nM af hver aptamer kandidat. Ifølge flowcytometrisk analyseresultater, ingen af ​​oligonukleotiderne vises binding med THLE-2 normale epitelceller leverceller, mens de syv aptamer kandidater viste tilsyneladende skift i fluorescensintensitet på HepG2-celler i forhold til en vilkårlig sekvens (figur 2, tabel S2 i S1 fil), hvilket indebærer, at alle de valgte aptamerer kunne differentiere liver cancerceller fra normale leverceller.

de valgte aptamerer viste tilsyneladende binding til hepatom HepG2-celler (A), mens ingen fluorescens forøgelse blev fundet med normale epitel- leverceller (B) under anvendelse af flowcytometri. Eksperimenter blev udført ved 4 ° C.

Bindingsaffiniteterne for de valgte aptamerer blev derefter bestemt ved at vurdere dissociationskonstanterne (K

d). En mindre K

d værdi angiver stærkere binding af den udvalgte aptamer til målcellerne. Som anført i tabel 1, aptamererne rapporteret i denne undersøgelse viste bindingsaffiniteter mod HepG2-celler i det nanomolære område (64-349 nM), hvilket antyder, at disse aptamerer bundet fast til deres mål HepG2-celler.

at forhindre bindingssekvenser fra at blive internaliseret, udførte vi

in vitro

selektion ved 4 ° C, samt de bindingsassays nævnt ovenfor. De valgte aptamerer ikke mister deres anerkendelse at målrette HepG2-celler ved fysiologisk temperatur (figur 3A). Fluorescensen skift fra celler inkuberet med aptamerer sammenlignet med celler inkuberet med biblioteket blev bevaret, når de bindende tests blev udført ved 37 ° C.

(A) Skiftet af fluorescensintensitet på HepG2 inkuberet med hver af de udvalgte aptamerer holdt ved 37 ° C. (B) Fluorescensintensiteterne ikke forskydes, når de HepG2 celler blev behandlet med trypsin i 30 min før inkubering, hvilket indikerer, at membranproteiner er de sandsynlige mål.

Det er blevet rapporteret, at aptamerer specifikt interagerer med overfladerne af målceller under selektion [5, 20]; derfor blev et andet sæt bindende tests (37 ° C) under anvendelse HepG2 celler behandlet med trypsin i 30 min før inkubering med prober udføres for at undersøge, om de valgte aptamerer var rettet mod membranproteiner på HepG2. Som vist i fig 3B, alle valgte aptamerer mistet deres præferentiel binding til biblioteket med protease-behandlede HepG2-celler, hvilket indikerer at målgruppen for disse aptamerer sandsynligvis vil være membranproteiner.

Det er blevet rapporteret, at visse proteiner er cancerassocierede [45, 46]. Derfor identificere de almindelige proteiner præsenteret af cancerceller og undersøge deres relevans for kræftformer kan give et fingerpeg om udviklingen af ​​kræft. Efter at bevise de valgte aptamerer var stand til at differentiere hepatocellulært carcinom fra normale liver epitelceller, vi undersøgte yderligere bindingen selektivitet aptamererne mod cellelinier for andre typer af cancer, herunder lunge pladecarcinom (H226), lungeadenocarcinom (A549), cervikal adenocarcinom (HeLa), brystadenocarcinom (MCF-7, MDA-MB-231), ovarie adenocarcinom (TOV-21G), pancreas adenocarcinom (PL45), og leukæmi (Ramos, CCRF-CEM) (tabel 2). Det blev konstateret, at de syv aptamerer også vist betydelig binding i retning lungeadenocarcinom, ovariecancer og embryoniske nyreceller, hvilket indikerer den stærke mulighed for nogle fælles proteiner udtrykt af disse celler, mens på samme tid, de viste ingen affinitet til leukæmi eller cervikal cancerceller. Da lungekræft er en fælles destination for leverkræft metastase [47], kunne dette resultat støtter brugen af ​​disse aptamerer som molekylære prober til at studere cancermetastase. Derudover er alle de aptamerer udviste anerkendelse mod den ene brystcancer cellelinje, MCF-7, men ikke den anden brystcancercellelinje, MDA-MB-231. Denne forskel kan tilskrives det faktum, at de er to forskellige undertyper i brystcancer. For eksempel MCF-7 falder i den luminale A subtype med højt udtrykt østrogenreceptor (ER) og progesteronreceptoren (PR), og MDA-MB-231 tilhører Basal-lignende undertype, som er negative for ER og PR [48] . Derfor er dette resultat antyder, at disse aptamerer kan anvendes på hormonafhængige undersøgelser cancer

Konklusion

Alle syv aptamerer rapporteret her kan adskille hepatom fra normale leverceller.; de demonstrerede høje affiniteter over for HepG2-cellelinien ved 4 ° C (K

d’s af 64-349 nM), samt ved 37 ° C, medens ingen påviselig binding til normale leverceller blev observeret. Forsøgene proteinase behandling viste, at alle syv aptamerer genkende målcellen HepG2 gennem overfladeproteiner. Desuden viste disse aptamerer anerkendelse mod lungekræft, kræft i æggestokkene, og Luminal En undertype brystkræft. Disse resultater tyder på, at disse aptamerer kan være potentielle prober til yderligere forskning i kræft studier, såsom udvikling af tidlig påvisning assays, målrettede behandlinger og billeddannende midler, samt til undersøgelse af fælles membranproteiner i disse skelnes kræftformer.

Støtte Information

S1 fil. . Kombineret fil at støtte tabeller

Tabel S1: Antal læser og procentdel for de 20 mest udbredte sekvenser. Sekvens # er udpeget i rækkefølgen af ​​overflod. Den samlede # af læser i hele DNA puljen er 501.084. Blandt de mest udbredte tyve sekvenser, syv af dem er rapporteret som aptamerer rettet mod HepG2-celler. Tabel S2: Fluorescensintensitet detekteret fra celler inkuberet med 250 nM af hver af aptamerer eller en tilfældig 61-mer DNA-bibliotek. (G-middelværdi: geometrisk middelværdi)

doi: 10,1371 /journal.pone.0125863.s001

(DOCX)

anerkendelser

Forfatterne takker Dr. Kwame Sefah for at designe primere og giver nyttige råd, der har bidraget til dette arbejde, Dr. Kathryn R. Williams for hendes kritisk gennemgang af manuskriptet, og DNA-sekventering kerne, ICBR, ved University of Florida for hjælp under den næste generation af dyb sekventering.