Abstrakt
Baggrund
Kræft forårsages af somatiske DNA ændringer såsom gen punktmutationer, DNA-kopi nummer afvigelser (CNA) og strukturelle varianter (SVS). Genom-dækkende analyser af SV’er i store prøve serie med veldokumenterede kliniske oplysninger er stadig sparsomme. Derfor forbliver virkningen af SV’er på carcinogenese og patient resultat dårligt forstået. Denne undersøgelse havde til formål at foretage en systematisk analyse af gener, der er berørt af CNA-associerede kromosomale pauser i kolorektal cancer (CRC) og til at bestemme den kliniske relevans af tilbagevendende breakpoint gener.
Metoder
Primære CRC prøver af patienter med metastatisk sygdom fra Cairo og CAIRO2 kliniske forsøg blev tidligere præget af matrix-komparativ genomisk hybridisering. Disse data blev nu anvendt til at bestemme prævalensen af CNA-associerede kromosomale brud i gener tværs 352 CRC prøver. Desuden mutation status for almindeligt berørt
APC
,
TP53
,
KRAS
,
PIK3CA
,
FBXW7
,
Smad4
,
BRAF
NTM
gener blev bestemt for 204 CRC prøver ved målrettet massiv parallel sekventering. Klinisk relevans blev vurderet ved lagdeling af patienter baseret på genmutationer og gen breakpoints, der blev observeret i . 3% af CRC tilfælde
Resultater
I alt 748 gener blev identificeret, der var gentagne påvirket af kromosomale pauser (FDR 0,1).
MACROD2
var påvirket i 41% af CRC prøver og en anden 169 gener viste breakpoints i 3% af tilfældene, hvilket indikerer, at forekomsten af gen breakpoints er sammenlignelig med forekomsten af kendte gen punktmutationer. Patient stratifikation baseret på gen-breakpoints og punktmutationer afslørede en CRC undertype med meget dårlig prognose.
Konklusioner
Vi konkluderer, at CNA-associerede kromosomale pauser inden gener udgør en meget udbredt og klinisk relevant delmængde af SV’er i CRC
Henvisning:. van den Broek E, Dijkstra MJJ, Krijgsman O, Sie D, Haan JC, Traets JJH, et al. (2015) Høj Udbredelse og kliniske relevans af Gener Påvirkede af kromosomale brud i kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (9): e0138141. doi: 10,1371 /journal.pone.0138141
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN
Modtaget: Marts 5, 2015; Accepteret: August 25, 2015; Udgivet: 16 September, 2015
Copyright: © 2015 van den Broek et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Array-CGH data er blevet deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus (GEO tiltrædelse nummer GSE63216, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra VUmc -Cancer center Amsterdam (E. van den Broek) og det hollandske Cancer Society (KWF-2007-3832), og der udføres inden for rammerne af center for Translationel Molekylær Medicin, afkode projekt (tilskud 03O-101) og den hollandske kolorektal cancer gruppe (DCCG). Disse finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling, dataanalyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Kræft forårsages af genomiske afvigelser, der drev tumor initiering og progression. Onkogen aktivering og tumorsuppressorgen inaktivering kan forårsages af flere klasser af somatiske DNA aberrationer, herunder ikke-synonyme (punkt) mutationer, kromosomal kopital aberrationer (CNA’er) og strukturelle varianter (SVS) [1]. SV’er repræsenterer deletioner, insertioner, inversioner og intra- og inter-kromosomale translokationer, som alle involverer kromosomale brud [2]. Interessant, mens punktmutationer og DNA kopiantal ændringer er blevet undersøgt grundigt, virkningerne af gener med kromosomale brud er dårligt karakteriseret. Idet kolorektal cancer (CRC) som et eksempel, til dato adskillige i ramme er rapporteret fusionsgener herunder
VTI1A-TCF7L2
,
NaV2-TCF7L1
R-spondin fusioner
PTPRK-RSPO3
EIF3E-RSPO2
[3-5]. De R-spondin fusioner aktiverer Wnt signalvejen og er gensidigt udelukkende med
APC
mutationer, hvilket indikerer, at disse translokationer forårsage gain-of-funktion protein forandringer. Alternativt kan SV’er også forårsage tab af funktion ændringer. For eksempel deletion af stopkodonet af
EpCAM
gen resulterer i en transkriptionel gennemlæsning der forårsager hypermethylering og følgelig silencing af det tilstødende fejlparringsreparationsgenet
MSH2
[6]. På trods af disse spændende eksempler, grundig undersøgelse af SV’er i CRC har været hæmmet af manglen på hele genomet dybe sekventering oplysninger om store serier af prøver. Derfor er den formodede virkning af SV’er i (kolorektal) tumor udvikling formentlig stærkt undervurderet.
Vi har tidligere udført med høj opløsning matrix-komparativ genomisk hybridisering (array-CGH) analyse på en række omkring 350 primære CRC prøver fra patienter, som havde udviklet metastatisk sygdom og deltog i Cairo og CAIRO2 fase III kliniske forsøg [7-9]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi disse data til at bestemme de genomiske positioner kromosombrudpunkterne, baseret på den antagelse, at intra-kromosomale forandringer i CNA-status kun kan forklares ved mekanismer, som involverer kromosomale brud. Selv om en sådan analyse ikke giver et samlet overblik over SV’er i kræft genomet, vi hypotese, at denne analyse vil identificere en væsentlig delmængde af SV’er på en tilstrækkelig opløsning til at afsætte kromosomale pauser for at gen-positioner. Desuden har vi forventes, at ikke-tilfældige tilbagevendende begivenheder blandt CRC prøver ville afsløre gener, der forbedrer tumor udvikling. Her viser vi, at denne tilgang afslørede 748 tilbagevendende breakpoint gener og demonstrere deres indvirkning på CRC klassificering.
Materialer og metoder
Kopier nummer aberration-associeret kromosombrudpunkt afsløring
Patienter udvalgt til den aktuelle undersøgelse deltog i en af de to multicenter fase III forsøg med den hollandske Colorectal Cancer Group (DCCG), nemlig CAIRO (CKTO 2002-07, ClinicalTrials.gov, NCT00312000) og CAIRO2 (CKTO 2005-02, ClinicalTrials.gov ; NCT00208546). De to randomiserede kliniske forsøg blev godkendt af Udvalget for Menneske-Related Research Arnhem-Nijmegen og af de lokale institutionelle anmeldelse bestyrelser. Den skriftlige informerede samtykke påkrævet for alle patienter før indgang i undersøgelsen omfattede også translationel forskning i tumorvæv. CNA-associeret kromosombrudpunkt detektion blev udført i banen 352 CRC prøver. Array-CGH data blev tidligere opnåede ved hjælp DNA isoleret fra formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) primære tumorer og patient-matchede normale væv par [9]. De 4548 sonder, der var blevet tilføjet til at berige for dækningen af 238 Kræft Census gener blev nu udelukket kromosombrudpunkt analyse, forlader 168823 sonder, der var jævnt fordelt over hele genomet ved ca. 17kb intervaller (S1 tabel). Genomisk probe holdninger var baseret på menneskelige genom NCBI Build36 /hg18. Array-CGH data er blevet deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus (GEO tiltrædelse nummer GSE63216). DNA kopiantal segmenter blev defineret af R-pakken “DNAcopy” (version 1.36.0) og blev afgrænset af den første og sidste sonde af segmentet [10]. Kromosombrudpunkterne blev defineret af de genomiske startpositioner DNA kopital segmenter (fig 1B) med undtagelse af den første DNA-segment af hvert kromosom og breakpoints mellem to kopital neutrale regioner som defineret af R-pakken “CGHcall” (version 2.17.6) [11]. For at detektere gener, der blev ramt af CNA-associerede kromosomale pauser blev breakpoints kortlagt til gen anmærkninger baseret på human henvisning genom hg18 /Ensembl54.
(A) Array-CGH DNA kopi nummer profil en CRC prøve. X-aksen viser kromosomer 1-22 og X (nummereret 23) med kromosom grænser angivet ved lodrette stiplede linjer. Y-aksen viser log2 forholdet mellem mængden af tumor-DNA
versus
patient-matchet normal DNA. Sorte prikker repræsenterer individuelle matrix-CGH probe datapunkter. De blå vandrette linier repræsenterer DNA-segmenter, vejledende for tumor DNA kopi nummer afvigelser når afviger fra 0. Den grønne pil og bar angiver regionen af kromosom 6, der er fremhævet i fig 1B. (B) Udvidelse af figur 1A (grøn bar). Lodret stiplede røde linjer angiver genomiske placeringer af CNA-associerede kromosomale breakpoints,
jeg
.
e
. de genomiske positioner, hvor log2 forhold mellem DNA-segmenter forandring. (C) Hyppighed plot af CNA-associerede kromosombrudpunkterne på q-arm af kromosom 13. X-aksen viser den genomiske position i Mb. Y-aksen afbilder kromosombrudpunkt frekvenser over kohorte af 352 CRC prøver. Breakpoint frekvenser er angivet på matrix-CGH sonde-niveau (lodrette sorte bjælker) og gen-niveau (horisontale røde søjler). Tilbagevendende breakpoint gener (FDR 0,1) er navngivet. Den grønne pil og bar angiver
PIBF1
region af kromosom 13q, der er fremhævet i fig 1D. (D) forstørrelse af fig 1C (grøn bar), hvilket illustrerer, at
PIBF1
gen breakpoints er koncentreret i den distale del af genet. Nabolande gener, der ikke huser væsentlige breakpoint tilbagefald satser er angivet med blåt.
Statistisk analyse af kromosomal breakpoint afsløring
En dedikeret statistisk signifikans analyse blev udtænkt for genet-baserede kromosombrudpunkt analyse, som består af tre trin. Først pr matrix-CGH profil baseline sandsynlighed for et brudpunkt forekommer i et gen på tilfældig blev bestemt, svarende til antallet af breakpoints i en profil, gen længde ved gen-associeret probe dækning og antallet af gen-associerede prober under anvendelse af en logistisk regression. For det andet blev det statistiske resultat defineres som antallet af profiler med mindst en brudpunkt i et givet gen. Derefter en
P
-værdi blev beregnet fra nul-fordeling af teststørrelsen. Denne nul-fordeling var en foldning (over uafhængige profiler) af Bernoulli stokastiske variable med en gen- og profil-specifikke ‘succes (= breakpoint) sandsynlighed «. For det tredje, at alle
P
-værdier i kandidatlandene breakpoint gener, flere test blev anvendt af en dedikeret Benjamini-Hochberg-typen FDR korrektion [12]. Denne korrektion tegner sig for den diskrethed af null-fordeling. Probe-baserede kromosombrudpunkt statistisk analyse blev udført under den antagelse, at pr matrix-CGH profil sandsynligheden for at være en CNA-associeret breakpoint probe er lig tværs prober. I dette tilfælde den dedikerede Benjamini-Hochberg-typen FDR korrektion svarer til standarden Benjamini-Hochberg FDR korrektion, fordi i modsætning til generne, alle prober svare til den samme null-fordeling. FDR mindre end 0,1 blev betragtet som signifikant.
Gene mutation analyse
APC
,
TP53
,
KRAS
,
PIK3CA
,
FBXW7
,
Smad4
,
BRAF
NTM
er gener med en offentliggjort mutation forekomst i CRC på ca. 3% eller mere [4]. FFPE DNA-prøver blev analyseret ved næste generation sekventering under anvendelse af TruSeq Amplikon Cancer Panel (TSACP; Illumina Inc, San Diego, CA USA). Genmutation status blev bestemt ved anvendelse af variant opkalds pipeline “Falco” [13]. Læser blev justeret til den menneskelige henvisning genom (NCBI Build37 /hg19) og varianter blev kommenteret til dbSNP poster (bygge 137). Mutationer blev kaldt, da den kommenterede variant blev observeret i mindst 20% af den læser og blev udpeget som en ikke-synonym aberration.
Netværk Based Stratificering
NBS blev brugt til at klynge CRC prøver, mens herunder oplysninger fra gen breakpoint og gen mutation molekylære interaktioner [14]. De baseline klinisk-patologiske karakteristika for CRC prøver (n = 203, se S5 tabel) lignede den analyseret af Haan et al serie. [9].
Smad4
gen erhvervet både breakpoints og mutationer, som blev slået sammen til NBS-analyse. For netværket formeringstrin den foruddefinerede STRING humane protein interaktion netværket blev anvendt som følger med NBS distribution. NBS parametre indstillet til standardværdierne med undtagelse af
k Hoteller, som blev sat til 4. Brug af sample-ligheden matrix fra NBS, prøver blev overdraget til CRC undertyper af gennemsnitlig kobling hierarkisk klyngedannelse. CRC patienter blev grupperet i fire CRC undertyper og OS satser blev visualiseret ved Kaplan-Meier kurver og den tilsvarende
P
-værdier blev beregnet ved log-rank test.
CRC undertype-associerede gener
NBS giver ikke netværksbaserede gen aberration scoringer som standard output. Derfor, for at bestemme, hvad gener var signifikant associeret med en bestemt CRC undertype, de netværksbaserede gen aberration scorer for hvert gen per prøve blev udtrukket som følger. Først for hver NBS iteration
i
af i alt
n
iterationer (n = 1000) input matricer
V
i
var rekonstrueret fra faktor matricer
W
jeg
og
H
jeg
der blev opnået under den ikke-negative matrix faktorisering procedure:
de matricer,
V
jeg
, repræsenterer de data, som anvendes af NBS til at bestemme prøvens klyngedannelse for hver iteration. En gennemsnitlig vektor af netværksbaserede gen aberration scoringer,
R
s
blev nu opnået for hver prøve
s
som gennemsnittet over input matricer
V
jeg
tværs af alle
n
iterationer:
Her
V
er
er rækken fra
V
s Hoteller, som svarer til prøve
s
i iteration
jeg
.
C
s
er en normalisering faktor, defineret som antallet af iterationer, hvor en prøve
s
blev udvalgt til klyngedannelse. Bemærk, at hvis en prøve ikke blev valgt under klyngedannelse alle
V
er
værdier er sat til nul. Mann-Whitney U tests blev udført i løbet af de midlede netværksbaserede gen-aberration scores at teste om et specifikt gen bidraget til dannelsen af en CRC subtype. For hver gen disse
R
s
scoringer blev grupperet i henhold til CRC undertype til at bestemme
P
-værdier, der angiver, om et gen bidraget væsentligt til dannelse af en specifik CRC undertype.
Multi-Dendrix
data input til Multi-Dendrix analyse var identisk med data input bruges til NBS-analyse, bortset fra gener, der delte de samme breakpoints, som blev nu samlet i “pools” (S8 tabel). Multi-Dendrix parametre blev sat til at k7t7s11 [15].
Resultater
Påvisning af tilbagevendende breakpoint gener
kromosomal CNA status 352 primære avancerede CRC prøver blev bestemt ved hjælp af 180K Agilent arrays, der dækker genomet med en gennemsnitlig probe afstand på ca 17kb, som tidligere beskrevet [9]. Efter DNA kopital segmentering blev de genomiske placeringer af ændringer i DNA-kopital status nu anvendes til at estimere positionen af CNA-associerede kromosombrudpunkterne (Fig 1A og 1B). Statistisk vurdering gav 1605 genomiske breakpoint steder med gentagelser i flere CRC prøver (FDR 0,1; S1 Table), hvilket indikerer, at placeringen af CNA-associeret pauser er ofte ikke-tilfældige. Når gruppering breakpoints ved gen påvirket, blev identificeret i alt 748 tilbagevendende breakpoint gener (FDR 0,1; S2 tabel). Genomet og forekomst af kromosomale breakpoints på q-arm af kromosom 13 er tilvejebragt i figur 1C og for alle andre kromosomer i S1 Fig.
Genet med højeste forekomst af kromosomale breakpoints var
MACROD2
, som var påvirket i 40,9% af CRC prøver. Yderligere 169 tilbagevendende breakpoint gener blev ramt i . 3% af avancerede CRC prøver, svarende til mutationsfrekvenser af almindeligt berørte onkogener og tumorsuppressorgener (Fig 2)
Gene breakpoint frekvenser (røde søjler) var baseret på en analyse af 352 CRC prøver og gen-mutation frekvenser (blå søjler) på en analyse af 204 prøver. Gener markeret med en “*” indikerer en pulje af gener, der deler sonde (r) i forbindelse med kromosomale breakpoints:
PCMTD2 *
pool omfatter også
LINC00266-1; PARK2 *
også
PACRG
;
ZNF337 *
også
NCOR1P1
,
FAM182A
,
FAM182B
,
FRG1B
,
MIR663A
,
MLLT10P1
;
CD99 *
også
XG
;
PARP8 *
også
EMB
.
Klinisk relevans af tilbagevendende breakpoint gener
Tilbagevendende breakpoint gener kan repræsentere genomiske regioner, der er sårbare over for kromosomale pauser,
jeg
.
e
. en epifænomen forbundet med CNA’er. Alternativt kan tilbagevendende breakpoint gener drive kræft og undergår positiv selektion under tumorigenese, og dermed påvirke det kliniske resultat som patient samlet overlevelse (OS). Derfor, for hver af de tilbagevendende breakpoint gener, der blev identificeret, OS af undergruppen af patienter med den specifikke gen breakpoint blev sammenlignet med den undergruppe af patienter uden denne breakpoint. Ingen af de enkelte tilbagevendende breakpoint gener var signifikant associeret med OS (log-rank
P
-værdier efterfulgt af Bonferroni korrektion for multiple test, data ikke vist).
Kræft-relaterede biologiske processer er kompleks og kontrolleret af den fælles indsats af flere gener. Derfor udførte vi en kombineret analyse af de 170 mest udbredte ( 3%) tilbagevendende breakpoint gener, der er beskrevet ovenfor, og genmutation status vigtige cancer gener. Brug DNA isoleret fra formalin-fikseret paraffin-indstøbt arkivering væv, mutation status
TP53
,
APC
,
KRAS
,
PIK3CA
,
FBXW7
,
Smad4
,
BRAF
NTM
blev bestemt ved målrettet næste generation sekventering, som det lykkedes for 204 CRC prøver (figur 2, S3 og S4 Tabeller). Som et tilfælde manglede breakpoints og mutationer for de valgte gener, 203 sager var til rådighed til at give både gen breakpoint og gen mutation data som input til netværksbaserede Stratificering (NBS) [14]. NBS blev påført udbrede sparsomme gen breakpoint og gen mutationsbegivenheder til den foruddefinerede protein-interaktion netværk STRING efterfulgt af gruppering af patienter i CRC undertyper baseret på de berørte undernetværk [14]. Denne analyse afslørede fire CRC undertyper (fig 3A og S6 Table). Baseline klinisk-patologiske patient karakteristika var meget sammenlignelige på tværs af de fire CRC undertyper (en-side Fisher Exact test; S5 Table). OS analyse afslørede signifikante forskelle mellem disse undertyper (log-rank
P
= 0,001, Fig 3B), med CRC undertype 3 med en signifikant ringere OS end de andre tre CRC undertyper (HR = 2,17; log-rank
P
= 0,0002, fig 3C), med 218 dage forskel i median overlevelse
(A) Co-clustering matrix af CRC prøver genereret af NBS-analyse.. Matricen farveintensitet repræsenterer ligheden score. Farven bar på toppen angiver patientgrupper relateret til de fire CRC undertyper (k = 4), bestemt ved hierarkisk klyngedannelse efter NBS-analyse. (B) Kaplan-Meier plot for samlet overlevelse (i dage) af CRC subtype 1 (n = 80 patienter), undertype 2 (n = 45 patienter), subtype 3 (n = 27 patienter) og subtype 4 (n = 51 patienter ). Der er betydelige forskelle i OS blandt de fire CRC undertyper (log-rank
P
= 0,001), med dårligste OS for undertype 3 CRC patienter. (C) Kaplan-Meier plot til OS af CRC undertype 3 patienter
versus
patienter i andre CRC undertyper, der viser en hazard ratio (HR) på 2,17 og en median OS af 392 dage
versus
610 dage, henholdsvis (log-rank
P
= 0,0002).
Når yderligere udforske de netværk, der er forbundet med denne CRC klassifikation, de fleste af de medvirkende gener viste sig at være tilbagevendende breakpoint gener suppleret med nogle af de almindeligt muterede CRC onkogener og tumorsuppressorgener (S7 Table). På et individuelt gen niveau inden for de identificerede CRC undertype-associerede gener, de fattige prognostiske CRC undertype 3 var
en
.
o
. beriget for gen punktmutationer i
BRAF
(tosidet Fisher Exact test:
P
0,0001) og
FBXW7 Hotel (
P
= 0,01 ), og for gen breakpoints i
WWOX Hotel (
P
0,0001),
FHIT
(
P
0,0001), og
PIBF1 Hotel (
P
= 0,03). Fordi mutationer i
BRAF
er ofte forbundet med mikrosatellitmarkørerne ustabile (MSI) tumorer [16] undersøgte vi fordelingen af MSI prøver på tværs af de fire CRC undertyper. Interessant, otte ud af ti MSI prøver i denne gruppe af 203 CRC’er var i undertype 3 (tosidet Fisher Exact test:
P
0,0001; S5 tabel). Tilsammen indikerer disse data, at CNA-associerede tilbagevendende breakpoint gener er klinisk relevant, da de bidrager til CRC klassificering af undertyper med prognostisk værdi.
Biologisk relevans af tilbagevendende breakpoint gener
For yderligere at undersøge, hvorvidt tilbagevendende breakpoint gener kan drive CRC udvikling, blev Multi-Dendrix algoritme anvendes til at identificere onkogene veje eller gen-moduler baseret på to kriterier, nemlig: 1) de omstændigheder senest et modul skal være gensidigt udelukkende, og 2) disse begivenheder bør dække næsten alle cancer prøver undersøgt [15]. Input data til denne analyse var identisk med for NBS,
jeg
.
e
. genet mutation status otte almindeligt påvirket CRC gener og breakpoint status for de 170 mest udbredte ( 3%) tilbagevendende breakpoint gener fra 203 CRC prøver. Denne analyse afslørede fire forskellige genmoduler, tre moduler, der indeholder både genmutationer og gen breakpoints og et modul, der udelukkende består af tilbagevendende breakpoint gener (Fig 4). blev observeret Den stærkeste gensidig eksklusivitet mellem
TP53
mutationer og
PIBF1
breakpoints, et gen, hvis breakpoints var mest fremherskende i CRC undertype 3, der viste fattigste prognose. Det genomiske placering af
PIBF1
på q-arm af kromosom 13 er fremhævet i fig 1D, der illustrerer berigelse af gen breakpoints i den distale del af dette gen. Desuden også
MACROD2
,
PPP1R12B
,
AKAP13
,
ERGIC1
,
PTPRT
,
SLC22A5
,
HIST1H1A
,
NMU
, og
rock1
breakpoint gener var repræsenteret i en af gen-moduler, og bidrog til CRC undertype klassifikation (figur 4 og S7 tabel). Disse data indebærer, at flere tilbagevendende breakpoint gener spiller en vigtig biologisk rolle i CRC udvikling.
De knuder omfatter både gen breakpoints (rød skitsere) og genmutationer (blå omrids). Kanter (grå linjer) forbinde gener, der er gensidigt udelukkende påvirket. Tykkelsen af de grå linjer og det tilsvarende antal afspejler robusthed score. observeres Den stærkeste gensidig eksklusivitet mellem
PIBF1
og
TP53
. Gener markeret med en “*” indikerer en pulje af gener, der deler sonde (r) i forbindelse med kromosomale breakpoints:
ZNF337 *
pool omfatter også
NCOR1P1
,
FAM182A
,
FAM182B
,
FRG1B
,
MIR663A
,
MLLT10P1
;
ZNF519 *
også
ANKRD20A5P
,
ANKRD30B
.
Diskussion
Molekylær karakterisering af somatiske DNA aberration er en nyttig strategi til støtte prognose og terapi forudsigelse af individuelle patienter. Mens analysen af ikke-synonyme punktmutationer i almindeligt muterede cancer gener og bestemmelse af kromosomal CNAs blevet standard for praksis til karakterisering tumorprøver, storstilet genom-dækkende detaljeret analyse af SV’er er stadig i sin vorden. Vi her vist, at CNA profiler giver at opdage gener, hvis funktion kan blive påvirket af CNA-associerede kromosomale pauser. I alt 748 tilbagevendende breakpoint gener blev identificeret baseret på en analyse af en stor serie (n = 352) med høj opløsning matrix-CGH prøver af primære tumorer fra patienter, der har deltaget i to kliniske fase III studier i metastatisk CRC. Ud over deres overflod også forekomsten af tilbagevendende breakpoint gener var relativt høj, med 170 gener påvirkes af kromosomale brud i mere end 3% af kræfttilfælde. Som sådan forekomsten af gener, der berøres af CNA-associerede kromosomale brud er sammenlignelig med forekomsten af punktmutationer i velkendte og almindeligt berørt CRC onkogener og tumorsuppressorgener (fig 2).
En af nøglen spørgsmål, vi havde til formål at løse, er, om kromosomale pauser inden gener er blot en epifænomen forbundet med kromosomal ustabilitet, eller om tilbagevendende breakpoint gener repræsenterer kræft drivere med biologisk og klinisk relevans. Mens ingen af de enkelte tilbagevendende breakpoint gener udstillet væsentlig indvirkning på OS, spredning af de 170 mest udbredte breakpoint gener i kombination med otte almindeligt muterede gener på et foruddefineret netværk lov til at klassificere CRC i fire undertyper af NBS. En af de CRC-undertyper, CRC subtype 3, havde en signifikant ringere prognose end de andre (figur 3), hvilket indikerer, at klinisk distinkte undertyper kunne identificeres. I en multivariat analyse (data ikke vist) faktorerne »WHO performance status«, »LDH på randomisering ‘,’ forudgående adjuverende terapi ‘,’ tumor fase primær tumor”, “antallet af berørte organer« og »MSI status” blev bibeholdt. Fordi genomiske mutationer er kausale for tumorigenese og diktere tumor adfærd, er det meget vel muligt, at fænotypiske faktorer, som i sidste ende er et resultat af underliggende biologi, maskere den prognostiske virkning af de genomiske CRC undertyper. En sådan afhængighed mellem klinisk-patologiske prognostiske parametre og CRC undertyper som beskrevet her derfor ikke tilbagevise univariat prognostisk værdi af denne klassifikation.
CRC undertype 3 viste sig at være beriget for tumorer med
BRAF
mutationer (33% af tilfældene
versus
5% i de øvrige CRC prøver S7 Table) og MSI tumorer (30% af tilfældene
versus
1% i de øvrige CRC prøver).
BRAF
er muteret ved meget højere frekvenser i MSI tumorer end i kromosomale ustabile tumorer, og inden MSI tumorer,
BRAF
mutation er kendt for at være associeret med dårlig prognose [16]. Selvom MSI tumorer har en relativt god prognose i tidligt stadie sygdommen, de også er forbundet med eksplicit dårlig prognose i metastaserende CRC [17]. MSI tumorer har ofte en lavere frekvens af CNA afvigelser end tumorer, der er mikrosatellit stabil (MSS), og derfor har mindre CNA-associerede kromosomale breakpoints end MSS tumorer. Dette antyder, at MSI tumorer kan blive samlet i en særskilt CRC subtype uanset (ændringer i) -funktionen af tilbagevendende breakpoint gener. Efter dette ræsonnement, ville man forudsige, at dårlig prognose CRC undertype 3 mangler tilbagevendende breakpoint gener med øget mutationsfrekvenser sammenlignet med de andre CRC undertyper. Men viste vores data ellers (S7 Table), med betydelig berigelse af breakpoint frekvenser i CRC undertype 3
versus
de andre CRC prøver til
WWOX Hotel (33%
versus
5%),
FHIT Hotel (59%
versus
13%), og
PIBF1 Hotel (15%
versus
3%). Disse data understreger, at tilbagevendende breakpoint gener bidrager væsentligt til klinisk relevant CRC klassificering.
Som vores data understøtter den kliniske relevans af tilbagevendende breakpoint gener, forventes det, at kromosomale brud inden for disse gener eller anden måde resultere i positiv selektion af cancerceller og stimulere tumor udvikling. Funktionel analyse af tilbagevendende breakpoint gener til at forstå deres biologiske virkninger var uden for rammerne af den aktuelle undersøgelse. Men for mange af disse en rolle i tumorigenese er blevet beskrevet, i litteraturen.
WWOX
FHIT
har længe været kendt for at opholde sig fælles skrøbelige steder og har vist sig at virke som undertrykkere af tumor udvikling ved gen-knockout musemodeller [18]. Desuden
WWOX
overekspression blev vist at fremme immunresponset i et gliom model [19], mens
FHIT
positivt regulerer ekspression af MHC klasse I molekyler på cancerceller [20]. Disse data tyder på, at tab af funktion af
WWOX
FHIT
hjælp til at flygte immunosurveillance. Ligeledes progesteron immunmodulatorisk bindende faktor
PIBF1
blev identificeret som en secerneret faktor, der kan forhindre graviditet tab ved at dæmpe immunresponsen. I betragtning af at
PIBF1
breakpoints blev overvejende observeret i den distale del af genet (Fig 1D) det er fristende at spekulere, at
PIBF1
gen breakpoints forstyrre dens kernelokaliseringssignal hvorpå det bliver en udskilt protein med anti-tumor immune-undertrykke kapaciteter [21]. MSI tumorer menes at fremkalde en anti-tumor immunrespons, der forhindrer metastatisk spredning, men når omgås disse tumorer blive meget aggressive [16]. I denne forbindelse er det interessant at bemærke, at breakpoint gener, der bidrog mest til klassificering af dårlig prognose CRC undertype 3,
jeg
.
e
.
WWOX
,
FHIT
, og
PIBF1
, er alle blevet impliceret at modulere immunreaktioner.
MACROD2
var den mest fremherskende tilbagevendende breakpoint gen i vores kohorte, påvirkes i 41% af CRC tilfælde. Dette gen var også en af de hyppigst observerede omarrangerede gener gennem et samlingspunkt sletning i andre undersøgelser [3,22].
MACROD2
er i stand til at hydrolysere endogene mono-ADP-ribosyl grupper, en reversibel posttranslationel modifikation del, fra målproteiner såsom
GSK3b
. Dette gendanner funktionen af
GSK3b
, som er en vigtig inhibitor af Wnt signalvejen. Derfor fraværet af funktionelle
MACROD2
kan nedsætte kinase aktivitet
GSK3b
og dermed fremme Wnt signalering [23-25]. Desuden
MACROD2
kan spille en rolle i at modulere funktionen af histon proteiner og ansættes i tilfælde af DNA-skade responset [23,25].
For yderligere at imødegå den biologiske relevans af tilbagevendende breakpoint gener vi forsøgte at konstruere moduler af formodede kræft kørsel gener, ved hjælp af Multi-Dendrix. På den ene side kan denne analyse afslører onkogene veje ved at se efter hinanden udelukkende gen mutation mønstre, der dækker næsten alle CRC prøver. På den anden side, hvis en tilsyneladende homogen gruppe af tumorer består af distinkte tumor undertyper, gensidig eksklusivitet mellem gener kan også afspejle tilstedeværelsen af (tidligere ikke-erkendte) cancer undertyper. blev observeret Den stærkeste gensidig eksklusivitet mellem
TP53
mutationer og
PIBF1
breakpoints (Fig 4).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.