PLoS ONE: Ny Genomisk struktur for prostatakræft Specifik Gene PCA3 inden BMCC1: Konsekvenser for prostatakræft Detection og Progression

Abstrakt

Baggrund

prostatakræft antigen 3 (

PCA3 /DD3)

gen er en meget specifik biomarkør opreguleret i prostatakræft (PCA). For at forstå betydningen af ​​

PCA3

i PCa undersøgte vi organisationen og udviklingen af ​​

PCA3

gen locus.

Metoder /vigtigste resultater

Vi har ansat cDNA syntese, RTPCR og DNA-sekventering til at identificere 4 nye transskription start- sites, 4 polyadenyleringssteder og 2 nye forskelligt splejsede exoner i en udvidet form af

PCA3

. Primere designet fra disse roman

PCA3

exons i høj grad forbedre RT-PCR-forskelsbehandling mellem PCa, PCA metastaser og BPH prøver. Sammenlignende genomiske analyser viste, at

PCA3

har først for nylig udviklet sig i en anti-sense orientering inden for et andet gen,

BMCC1 /PRUNE2

. BMCC1 har vist tidligere for at interagere med RhoA og RhoC, determinanter af cellulær transformation og metastase, hhv. Brug RT-PCR vi vist, at jo længere

BMCC1-1

isoform – ligesom

PCA3

– opreguleres i PCA væv og metastaser og i PCA-cellelinjer. Desuden

PCA3

BMCC1-1

niveauer er lydhøre over for dihydrotestosteron behandling.

Konklusioner /Betydning

opregulering af to nye PCA3 isoformer i PCA væv forbedrer forskelsbehandling mellem PCa og BPH. Den funktionelle relevans af denne specificitet er nu af særlig interesse givet

PCA3 s

overlappende forening med et andet gen

BMCC1

, en regulator af Rho-signalering. Opregulering af

PCA3

BMCC1

i PCa har potentiale til forbedret diagnosticering

Henvisning:. Clarke RA, Zhao Z, Guo AY, Roper K, Teng L, Fang ZM et al. (2009) Nyt Genomisk Struktur for prostatakræft Specifik Gene PCA3 inden BMCC1: Konsekvenser for prostatakræft Detection og Progression. PLoS ONE 4 (3): e4995. doi: 10,1371 /journal.pone.0004995

Redaktør: Baohong Zhang, East Carolina University, USA

Modtaget: 11. november 2008; Accepteret: 5 feb 2009; Udgivet: 25 Marts 2009

Copyright: © 2009 Lavin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering er leveret af Australian National Sundhed og Medical Research Council og Cancer Råd Queensland. Zhongming Zhao understøttes af en NIH tilskud (LM009598) fra National Library of Medicine, Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memorial Trust Fund, og Institutional Research Grant IRG-73-001-31 fra American Cancer Society. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret intern malignitet hos mænd og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald. Ætiologien af ​​PCa er usikker med miljø-, hormonelle og arvelige faktorer impliceret. Indledningen af ​​PCa (dvs.. Dannelsen af ​​en histologisk identificerbare læsion) er en almindelig begivenhed, at blive opdaget ved obduktion serie i næsten en tredjedel af mænd over 45 år [1]. Heldigvis de fleste af sådanne læsioner ikke videre til klinisk signifikante tumorer. Hos patienter med klinisk-detekteret sygdom, og som anses for at have deres tumor lokaliseret til prostata, mellem 15% og 40% har dissemineret sygdom, ikke kan identificeres af nuværende billeddannende metoder, for hvilke der i øjeblikket ingen helbredende behandling. En diagnose af prostatacancer (fra prostata biopsier) initieres typisk efter en forhøjelse i serum målinger af prostataspecifikt antigen (PSA), et protein, der normalt secerneres specifikt af prostata epitelceller til at danne en komponent af ejaculate. PSA er ikke en test for kræft, og der er ingen grænser for dette enzym giver en høj følsomhed og specificitet med et kontinuum af risiko for alle PSA-værdier [2]. Et hævet serum PSA så ofte begår mænd til den invasive og upræcise procedure af transrektal ultralyd (TRUS) vejledt biopsi [3], [4]. En yderligere anklage mod de begrænsninger af PSA i PCa påvisning er forskellen mellem trus biopsi resultater og dem fra radikal prostatektomi med den tidligere under-ringer patologi [5].

For at forbedre påvisning og behandling af PCa, undersøgelser har været i gang for at identificere de gener, der er involveret i initiering og progression af sygdommen. Arvelige faktorer anses for at spille en større rolle i tilblivelsen af ​​PCa end i nogen anden malignitet. Genomisk brede associationsstudier og kandidat gen skærme viser, at arven involverer flere små foreninger langt de fleste som forbliver ukendt i tillæg til eventuelt komplekse epigenetiske eller gen-gen interaktioner. [6] – [12]. Differential display teknologi er blevet anvendt med succes til at identificere ændringer i niveauet af genekspression forbundet med overgangen fra normal til tumor, som omfatter gener involveret i lipid signalering og metabolisme; fedtsyresyntese; cellecyklusreguleringen; celleadhæsion og stromale regulering; angiogenese; ion-kanal regulering, og signaltransduktion [13], [14]. Brug af differential display Bussemakers et al [15] identificeret en cDNA, efterfølgende navngivet prostatacancer antigen 3 (

PCA3 /DD3

), som blev opreguleret i 53 ud af 56 prostatakræft sammenlignet med ikke-malign prostata væv.

PCA3

gen (25 kb – Fig 1A), som er differentielt splejset, har en høj frekvens af termineringskodoner i alle læserammer, der foreslog det var et ikke-kodende RNA (ncRNA). Derudover var der intet bevis for ekspression af et PCA3 protein [16]. Opregulering af de store ~ ​​2 kb

PCA3

transskript, hvilket udelukker exon 2 (Fig 1A), viste sig at være en følsom og specifik markør for diagnosticering af PCa [15], [16]. Ekspressionen af ​​polyadenylerede transkripter af

PCA3

foreslået, at det kan have en funktionel rolle, som er understøttet i et vist omfang af dens lokalisering til kernen og manglende påvises i cytoplasmaet [16]. Til dato ingen rolle i cancer er blevet beskrevet for

PCA3

men det er blevet foreslået, at det kan fungere i regulering af genekspression eller deltage i gensplejsning [16]. ncRNAer er for nylig blevet fundet i overraskende overflod, med nye klasser og uventede roller medierer evolution, organisering kromosomale domæner, kromatin remodeling og transkriptionel regulering (både aktivering og undertrykkelse) [17], [18]. Ud over

PCA3

, sammenligninger mellem benign prostata hypoplasi (BPH) og PCA prøver viste 14 af de 51 andre ncRNAer der blev differentielt udtrykte blev også opreguleret i PCa [19], [20]. Det er også velkendt, at en klasse af meget små ncRNAer kendt som microRNA ændres i forskellige tumortyper og kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener [19], [21], [22].

(A ) Delvis

PCA3

gen struktur som oprindeligt rapporteret af Bussemakers et al. [15] med 4 exons (åbne kasser ~ ikke at skalere) med alternativ splejsning af exon 2 og tre suppleanter transskriptionsstopsteder i exon 4. 5 ‘RACE eksperimenter (Supplerende fig. S1) identificeret fire roman

PCA3

transskriptionsinitieringssignaler sites (isoformer 1-4 markeret med lodrette pile peger ned med nukleotidsekvensen nedenfor beliggende 1150 bp, 699 bp, 640 bp og 136 bp opstrøms for det oprindelige initieringssted (omdøbt her isoform 5). 3′-RACE identificeret fire hidtil ukendte polyadenylering steder (7 i alt *) placeret i exon 4. størrelsen af ​​exon 1 udvides fra den oprindelige 120 bp til 1270 bp. isoform 4 (

PCA3-4

) er den mest højt udtrykt af de fire hidtil ukendte isoformer. Fire overlappende ORF’er indleder fra en enkelt “ATG ‘startstedet (lodret pil, der peger op) inden

PCA3-4

og afslutte inden for et af de alternativt splejsede exoner (2a eller 2b eller 2c) eller inden for exon 3 . (B) RT-PCR-amplifikation af BPH, PCA og PCA metastase prøver under anvendelse af en forward primer inde fra roman

PCA3-4

transkriptionsstartstedet og en revers primer fra hidtil ukendt exon 2a. (C) Komplet struktur

PCA3

gen. Shading identificerer de nyligt identificerede områder af

PCA3

gen, der har 6 exoner med alternativ splejsning af exon 2a (93 bp) og exon 2b (93 bp) og exon 2c (original exon 2, 165 bp). og (D) RT-PCR-amplifikation af PCA3 under anvendelse af samme forward primer og en revers primer fra hidtil ukendte exon 2b og (E) RT-PCR-amplifikation af PCA3 under anvendelse af en forward primer fra

PCA3-5F

(inden for den oprindelige transskriptionsstartsitet) og en reverse primer spænder exon 1 og 3 [15].

for at forstå yderligere vigtigheden af ​​

PCA3

gen i PCa vi foretog en mere detaljeret undersøgelse af dette gen og dets kromosomale locus. Denne undersøgelse peger på en betydelig mere kompleks transkriptionsenhed for

PCA3

end oprindeligt rapporteret [15], [16], herunder yderligere nye exons. Vi beskriver en række roman

PCA3

splejsning varianter med mere specifikke udtryk i PCA væv og metastaser. Vi viser også, at

PCA3

er indlejret i intron i et andet gen,

BMCC1

, et gen involveret i at kontrollere oncogen transformation [23], og at begge gener viste øget ekspression i PCa og metastaser .

Resultater

Identifikation af nye PCA3 udskrifter og erfaring i PCa

fraværet af en TATA box element i et menneskeligt gen promoter er blevet forbundet med promiskuøs transkriptionel initiering.

PCA3

gen ikke indeholder en opstrøms TATA sekvens, og det var derfor af interesse at bestemme, om der forelå yderligere transkriptionsinitiering sites for

PCA3

(Fig 1A, øverste del). Vi udførte 5 ‘RACE hjælp PCa væv udtrykker

PCA3

at lede efter yderligere start-sites.

Denne fremgangsmåde viste, at exon 1 er 1150 bp længere end tidligere rapporteret (nu 1270 bp) og indeholder 4 nye transskription start-sites (Supplerende fig S1 .. figur 1A, lavere del). Disse nye transcription start sites er placeret 1150, 699, 640 og 136 bp (betegnet

PCA3

isoformer 1-4, henholdsvis) opstrøms af de tidligere rapporterede startstedet for

PCA3

[15]. Den oprindelige udskrift kaldes her som

PCA3

isoform 5 (

PCA3-5

). Tilstedeværelsen af ​​disse længere transkripter i tumorer blev omvendt relateret til transkript længde (resultater ikke vist). Transskription fra roman indvielse sted 4 (

PCA3-4

), sammenstillet umiddelbart efter FP2 region, der indeholder 3

SRY

konsensus bindingssteder (Supplerende fig. S2), var signifikant højere sammenlignet med de tre andre opstrøms initieringssteder som bedømt ved qPCR (resultater ikke vist). Transskription fra indledningen site 1 (

PCA3-1

) blev opdaget af 5 ‘RACE i kun et par prøver.

Vi udførte 3′ RACE at undersøge yderligere kompleksitet ved 3′-enden af udskriften. Fire yderligere polyadenyleringssteder blev påvist under anvendelse af 3 ‘RACE bringer det samlede antal polyadenyleringssteder til syv, placeret ved nucleotiderne 411, 542, 873, 1583, 1600, 2146 og 3545 i henholdsvis exon 4 (fig. 1A, nedre del). Af de 4 ekstra polyadenyleringssteder, blev kun to er forbundet med defineret polyadenyleringssignalsekvenser, AATAAA og ATTAAA hhv. Vi observerede, at en fremadrettet primer baseret på den nye sekvens (

PCA3-4)

sammen med en omvendt primer for exon 2 meget effektivt forstærkede

PCA3

i PCa (7/8) og metastaser prøver (7/8), men ikke har kunnet påvise

PCA3

i BPH prøver (0/8) (fig 1B). Klinisk oplysninger om disse patienter er givet i supplerende tabel S1. Disse primere ikke kun amplificeret et cDNA-fragment med den forventede størrelse (265 bp), men også 2 højere molekylstørrelse bands i nogle prøver (figur 1B, supplerende Fig. S3). De yderligere bånd blev udskåret fra gelen og sekventeret for at afsløre tilstedeværelsen af ​​2 roman

PCA3

exoner både 93 bp i størrelse (fig 1C). Disse to differentielt splejsede exoner (2a og 2b), som har bona fide konsensus splejsningssites ved deres ender havde deres ekspression bekræftet ved RT-PCR-amplifikation under anvendelse af hidtil ukendte exon specifikke primere Amplifikation af

PCA3

hjælp af PCA3-4F primer sammen med en primer, der svarer til exon 2a opdaget 5/8 PCa og 4/8 metastatiske prøver og igen givet fremragende diskrimination med BPH (fig 1D). Lignende resultater blev påvist under anvendelse PCA3-4F og en revers primer for exon 2b (resultater ikke vist). Dette forbedrer på brugen af ​​den oprindelige primersæt ansat af Bussenmakers et al [15], der også påvist en mindre intens signal i de fleste BPH tilfælde som det fremgår af data opnået her (fig. 1E). Identifikationen af ​​exoner 2a og 2b bringer til 6 det samlede antal

PCA3 Salg exoner (fig. 1C). Disse data indikerer, at flere nye udskrifter for

PCA3

udtrykkes forskelligt i PSA.

Nukleotidsekvensanalyse identificeret fire formodede ORF’er initierende fra en enkelt ATG ligger 54 nukleotider i romanen

PCA3- 4

isoform (fig 1A, nedre del). Den første af disse, 70 aminosyrer (aa) i længde, udvides gennem exon 1 og 4 aa i en hidtil ukendt exon 2a. Det andet, 82 aa i længden, forlænges gennem exon 1, springes exon 2a, og forlænget 16 aa i exon 2b. Den tredje, 76 aa i længden, også udvidet gennem exon 1, springes exons 2a og 2b og udvidet 10 aa i exon 2c. Den fjerde, 73 aa i længden, også udvidet gennem exon 1, springes exons 2a og 2b og 2c og udvidet 7 aa i exon 3. Disse ORF’er indlede 83 nukleotider opstrøms af den oprindelige udskrift (

PCA3-5

) beskrevet af Bussemakers et al. [15], og kunne ikke have været forudsagt i tidligere analyser af den oprindelige udskrift som ikke identificere nogen væsentlige ORF. Det vil være af interesse at bestemme, om disse ORF’erne koder for proteiner.

PCA3

er indlejret i intron 6 i

BMCC1

gen

For at forstå bedre den tætte sammenhæng mellem

PCA3

genekspressionsniveauer og prostatakræft vi undersøgte udviklingen og organiseringen af ​​

PCA3

gen locus (figur 2A). Vi brugte

PCA3

mRNA sekvens (3923 bp, AF103907) for at søge homologe sekvenser i andre genomer. Ved hjælp af en cutoff E-værdi 1 × 10

-4 i BLAST søgning betydelige hits fandtes kun i mammale genomer. Exon 4 er den mest konserverede region af genet. Et segment (403 bp) i exon 4, blev fundet i alle de tilgængelige pattedyrgenomer (evolutionære konserveret regioner (ECR_ex4c pile ‘B’ i fig 2B og 3A . 3B) Dette segment, sammen med den humane

PCA3

gensekvens, blev brugt til at udtrække de genomiske sekvenser for

PCA3

homologer i andre arter. Som et resultat, vi opnåede menneske

PCA3

homologer i 14 pattedyr, herunder 4 primater .

(A)

PCA3

gen (ovenfor) er indlejret i intron 6 af

BMCC1 Hotel (

PRUNE2

) isoform 1 (

BMCC1-1

). Gray kasser betegne exons af

BMCC1

og sorte bokse betegner exons af

PCA3.

de to gener er i den modsatte retning (NCBI Build 36). Tre andre isoformer af

BMCC1

er også blevet beskrevet, hvoraf ingen omfatter det komplette sæt af exons stede i

BMCC1-1

. (B) VISTA plot af

BMCC1

gen . Peak højder indikerer graden af ​​bevaring mellem arter af exons (blå) og evolutionære bevarede dele (ECR inden introns – pink) sammenlignet med human. Bemærk, at genet orientering er anderledes i fig 2A, øvre og nedre paneler. Vi skønnede mutationen hastighed sekvensen niveau DNA ved at sammenligne menneskelige og chimpanse sekvenser og bruge en divergens på 6 millioner år (MYR). Mutationen sats i

PCA3

gen blev anslået til at være 1,26 × 10

-9 pr nukleotid per år, højere end (1,00 × 10

-9 pr nukleotid om året) i den ikke –

PCA3

del af

BMCC1

gen, hvilket tyder på

PCA3

region kan have en moderat højere mutation sats. Tre stærkt konserverede ecrs inden

BMCC1

er pile (A, B C); Arrow ‘A’ (ECR_in1, 277 bp) er en yderst konserverede ikke-kodende sekvens med 91% lighed mellem human og opossum der er anbragt inde intron 1 af

PCA3

; Arrow ‘B’ (ECR_ex4c, 403 bp) en ECR placeret inden

PCA3

exon 4, som er bevaret i alle pattedyr, og synes at have været omdrejningspunkt for den lineære udvikling i

PCA3

gen (se fig. 3); Arrow ‘C’ (361 bp) er den mest stærkt bevaret ECR (et bevaret ikke-kodende sekvens med 99% lighed mellem mennesker og opossum) inden

BMCC1

(intron 6) umiddelbart nedstrøms for

PCA3

.

To mRNA sekvenser (AB050197 og BC019095) blev oprindeligt kommenteret opstrøms og nedstrøms for

PCA3

. Disse to mRNA sekvenser var for nylig fusioneret og kommenteret som to isoformer af

BMCC1

gen (også kaldet

PRUNE2

, NCBI Gene ID: 158.471). Ifølge disse kortlægning steder,

PCA3

gen ligger i intron 6 i længere

BMCC1

isoform 1 (

BMCC1-1

). For at bekræfte dette, vi søgte efter

PCA3

sekvenser andre steder i det menneskelige genom og opnåede kun ét hit, som præcis kort til

BMCC1

gen locus.

BMCC1

gen er ~295 kb i længden og har en modsat gen orientering til

PCA3

. Nylige udtryk undersøgelser viser, at

BMCC1

behandlingen er mere kompleks end oprindeligt troede, og består af fire variant isoformer som ikke blev fuldt kommenterede på NCBI (Build 36,2). Fig. 2A viser den strukturelle forhold mellem

PCA3

og

BMCC1

gener.

BMCC1

isoform-2 (

BMCC1-2 /PRUNE2-2

/BC019095 /NM_138818) omfatter de første 6 exoner af

BMCC1

som kommenteret på NCBI (Build 36,2) .

BMCC1-2

opsiger umiddelbart opstrøms for

PCA3

gen. Isoform-3 (

BMCC1-3 /BMCC1

/ABO50197) rapporteret af Machida et al. [23] ikke overlapper

BMCC1-2

men snarere omfatter 13 forskellige exons (exons 7-19) placeret umiddelbart nedstrøms

PCA3

. Den transkriptionsinitieringsstedet for isoform-4 (

BMCC1-4

/KIAA0367 /BNIPXL /AY43213) rapporteret af Soh og lav [24] ligger endnu længere nedstrøms i den anden exon af

BMCC1-3

. Isoform-1 (

BMCC1-1 /PRUNE2-1

/NM_015225) på den anden side, er en nyere beregningsmæssigt genereret henvisning gen, der omfatter de 19 exons (NM_015225) afledt fusionere

BMCC1-2

og

BMCC1-3

og som havde indtil nu manglet fuld udskrift støtte. Her brugte vi RT-PCR primere spænder

BMCC1-2

BMCC1-3

(Fig. 2A) og nukleotidsekvens analyse (resultater ikke vist) for at verificere eksistensen af ​​

BMCC1-1

udskrift og bekræftede sit udtryk i PCA væv (se fig. 4A). Den større størrelse af

BMCC1-1

er også i overensstemmelse med ~12 kb mRNA udskrift identificeret af Machida et al. [23].

PCA3

lokaliserer inden intron 6 (~110 kb) af

BMCC1-1

.

PCA3

repræsenterer ca. 25 kb af denne intron, men det er i den modsatte retning til

BMCC1

. Tre af de BMCC1 proteinisoformer BMCC1-1 (3088 aa – NM_015225), BMCC1-3 (2724 aa) [23] og BMCC1-4 (769 aa) [24] har forskellige kodning start-sites, men alle tre er in- ramme og indeholder nedstrøms BCH kodning domæne.

(A) Vista plot viser bevarede strukturer

PCA3 gen

. Kun primater synes at have en komplet

PCA3

gen. De to evolutionære konserverede regioner deles af

BMCC1

PCA3

(se fig. 2B)

er pile Hotel (pil A ~ ECR_ex4c og pil B ~ ECR_in1). Begge ecrs synes bevaret i pattedyr (identitet 90%). ECR_in1 er også til stede på dette websted i kylling og firben, men ikke i fisk, frø, eller hvirvelløse dyr. (B) ECR_ex4c synes omdrejningspunkt for den lineære udvikling struktur

PCA3

. (C) Oversigt over pattedyr

PCA3

exons deler høj bevaringsværdi i forhold til menneske. Genet struktur annotation var baseret på Bussemakers et al. [15]. Niveauet for bevarelsen af ​​

PCA3

exons i løbet af pattedyr evolution stiger 3 ‘→ 5’ baseret på tilstedeværelsen af ​​meningsfulde ecrs i hvert exon. Den nøjagtige sekvens identitet for hele exon mellem mennesker og andre arter er vist i supplerende tabel S2. Det er vigtigt at bemærke, at ingen ECR fra

PCA3

exons blev fundet i alle ikke-pattedyrart i denne analyse.

cDNA blev fremstillet af patientens vævsprøver, herunder otte BPH, PCa eller PCA metastaser henholdsvis til anvendelse i de følgende PCR-reaktioner. (EN). RT-PCR udført på BPH, PCa og metastaser (MET) med forskellige sæt af primere til

PCA3

og BMCC1 Øverste række;

BMCC1-2

RT-PCR ved hjælp af en forward primer for

BMCC1

exon 5 (BMCC1-Ex5F) og en reverse primer specifik for den udvidede form af exon 6 (BMCC1-Ex7R) unikt for

BMCC1-2

2. række;

BMCC1-1

specifikke RT-PCR ved anvendelse af primere for

BMCC1

exon 6 (BMCC1-Ex6F) og exon 7 (BMCC1-Ex7R). 3. række;

BMCC1

-BCH region specifikke RT-PCR ved anvendelse af primere BCHF og BCHR. 4.p;

PCA3

blev forstærket (35 cykler) med primere specifikke for

PCA3

isoform 5 exon 1 (PCA3-5F og Ex1 /3R primer). 5

th række; β

2microglobulin kontrol PCR (B). RT-PCR sammenlignende udtryk analyse af

PCA3

,

BMCC1-1

og

BMCC1

-BCH region for ALVA41, DU145, LNCaP og PC3 prostata cancer linjer, RPWE1 en normal prostata-cellelinien, JHP en kontrol lymfoblastoidcellelinje, RM654 en lymfoblastoidcellelinie fra en patient med AOA2 og MCF7 en brystcancer-cellelinie. RT-PCR blev udført med primeren sætter specifik for

PCA3

isoform 5 (PCA3-5F) og Exon 1/3 (Ex1 /3R) og for

BMCC1-1

og

BMCC1

-BCH region som angivet ovenfor. (C) Semi-kvantitativ PCR-analyse af

PCA3

BMCC1-1

udtryk i LNCaP cellelinje i respons til dihydrotestosteron. Resultaterne blev normaliseret i forhold til niveauet af β

2microglobulin. Fire cellekulturer blev udsultet for serum i 2 dage før inkubation med dihydrotestosteron (ug /ml). Resultater blev normaliseret og udtrykt som gennemsnit fold stigning i forhold til niveauet af ekspression før behandling. Fejl barer er standardafvigelser og p-værdier blev bestemt ud fra sammenligning med ubehandlede prøver ved hjælp af en t-test.

Har BMCC1 genet været under selektion?

Da

PCA3

er indlejret eller indlejret i

BMCC1

det var interessant at studere evolutionære ændringer i dette gen. BLAST søgninger afslørede, at

BMCC1

homologer er til stede i pattedyr, kylling og firben, men ikke i afrikansk frø, fisk eller hvirvelløse dyr (figur 2B). Vi brugte VISTA software til at udføre global tilpasning af

BMCC1

homologe gener. Tilpasningen i figur 2B viser, at

BMCC1

er kun konserveret fra menneske til hund /mus med undtagelse af en række yderst konserverede ECR, der strækker sig fra menneske til lizard (herunder dem pile A og C i fig. 2B ).

Disse ECR ligger stort set mellem

BMCC1

intron 6 og exon 9 (også i

PCA3

). Vi sammenlignede aminosyresekvenser baseret på menneskelige og chimpanse

BMCC1-1

CDS sekvenser. Den totale aminosyre længde er 3088 (human) og 3089 (chimpanse). Efter vi justeret menneskelige og chimpanse-sekvenser, fandt vi 40 ikke-synonyme mutationer og 21 synonyme mutationer. For hele regionen, forholdet mellem ikke-synonym løbet synonym substitution sats (DN /DS) er 0,90. A dN /dS forhold større end 1 i en kodende region antyder ofte positiv selektion. Exon 8 er den længste exon i

BMCC1

og har 6598 bp, som koder 2199 aminosyrer. Vi fandt de fleste ikke-synonyme mutationer i exon 8 og antallet af ikke-synonyme mutationer [25] er næsten tre gange større end synonyme mutationer [12]. DN /dS forholdet var 1,38, hvilket tyder på en nylig positiv selektion på dette underområde. Desuden fandt vi, at 39 af de 40 ikke-synonyme substitutioner i

BMCC1

gen var i exon 8 og 9, som havde kun 14 synonyme udskiftninger. Der var kun én substitution, hvilket er synonymt i exon 7. Når vi undersøgte exon 8-9 eller exon 7-9, vi konsekvent fundet, at dN /dS-forholdet var større end 1 (exon 8-9, 1,30; exon 7 -9, 1,22), hvilket tyder på en positiv selektion i naboregionen af ​​

PCA3

.

PCA3

opstod i pattedyr og for nylig udviklet sig i primater

PCA3

er ikke så godt bevaret i pattedyr som

BMCC1

og var ikke tidligere påvist i gnavere [15]. For at bestemme oprindelsen af ​​

PCA3

vi sammenlignet

PCA3

gensekvenser tværs arter. Vi udførte en global tilpasning af de 15 pattedyr

PCA3

ortologer. Fig. 3A viser en VISTA plot af de konserverede regioner inden for

PCA3

gen region. En mere detaljeret VISTA plot med fokus på

PCA3

exon 2-4 leveres i fig. 3B. Som beskrevet, er det

PCA3

gen stærkt konserveret i primater. For eksempel, når sammenlignet med den humane

PCA3

sekvens, alle fire exonsekvenser og hovedparten af ​​de intronsekvenser i de fire primater har høj identitet med human (fig. 3A).

Sammenligning af sekvenskonservering mellem disse 15 pattedyr, afslørede et lineært mønster af forandringer i forhold til disse fire exoner i løbet af pattedyr evolution. Exon 4 er langt den største exon (3454 bp) og til sammenligning exon 4 blev delt (5 ‘→ 3’) i 3 regioner [a, b og c, der svarer til de tre termineringssteder beskrevet af Bussemakers et al. [15]. ECR_ex4c, den konserverede segment af exon 4c tidligere beskrevet (pile ‘B’ i fig. 2B og fig. 3) fremkommer i alle 15 pattedyr, herunder opossumen, hvilket er en out-gruppe af de 14 eutherians. Mens opossum har kun denne ene konserverede region i forhold til 4

PCA3

exons, gnavere har 1-2 små ekstra ecrs i exon 4b (fig. 3A og 3B). Exon 4a optrådte første gang i kanin. Exon 3 blev påvist i elefant, træ spidsmus, ko, hund, gris, hest, og i alle primater, men ikke i kanin, gnavere, eller opossum. Ifølge VISTA plot en meningsfuld exon 2 er kun til stede i svin, hest og alle primater (fig. 3B).

Endelig exon 1 er til stede i primater (Fig. 3A). Denne lineære evolutionære mønster af gen-dannelse er sammenfattet i fig. 3C hvor resultater tyder på, at: (1) rester af

PCA3

gen opstod i pattedyr; (2) disse levn efterfølgende gennemgik en lineær mønster af evolution: exon 4c → exon 4c /4b → exon 4c /4b /4a → exons 4/3 → exon 4/3/2 → exoner 4/3/2/1; og (3)

PCA3

synes at modnes i primater med alle deler en komplet supplement af exons (fig. 3C). Den nøjagtige sekvens identitet for hver af det komplette menneske

PCA3

exoner sammenlignet med andre arter, er vist i supplerende tabel S2.

BMCC1 opreguleres i PCa og androgen inducerbare

Siden

PCA3

opreguleres i PCa og da vi viste her, at dette gen er indlejret i et andet gen

BMCC1

, impliceret i cellulær proliferation, vi fastslået, om

BMCC1

var også forskelligt reguleret i PSA. Vi anvendte et sæt af RT-PCR-primere, der spænder det område af

BMCC1

gen (exon 6 og 7), specifik for fuldlængde

BMCC1-1

transkript. Angivelse af

BMCC1-1

var tydelig i normale prostata og BPH prøver og blev opreguleret i PCa og metastaser (fig 4A, supplerende Fig. S4). Dette blev bekræftet ved anvendelse af primere svarende til BCH C-terminale region af BMCC1 og for BMCC1-2. Faktisk forstærkning af denne isoform gav bedre forskelsbehandling mellem PCa og BPH (fig. 4A, øvre panel). Udvide disse eksperimenter PCA og andre cellelinjer viste, at begge gener blev stærkt udtrykt, specifikt i PCA LNCaP (fig. 4B). Desuden

BMCC1-1

blev påvist i en anden PCa cellelinie DU145 men på lavere niveauer.

PCA3

kommer også til udtryk i DU145 men krævede yderligere runder af forstærkning for detektion. De kortere

BMCC1

isoformer (

BMCC1-3

og /eller

BMCC1-4

) blev også påvist (ved anvendelse af primere specifikke for BCH-regionen) i en EBV-transformerede lymfoblastoidcellelinje (JHP), men jo længere

BMCC1-1

isoform blev ikke påvist (fig 4B). Tidligere data har vist, at niveauet af

PCA3

kan induceres i LNCaP-celler efter behandling med dihydrotestosteron, som efterligner virkningerne af binding af androgen receptor (DHT) [16]. Vi afgjort, om

BMCC1-1

var også lydhør over for hormonal induktion. Resultaterne i fig. 4C viser, at både

PCA3

BMCC1

er maksimalt induceret i LNCaP cellelinje i en koncentration på 0,5 mM DHT.

Diskussion

Vi har afsløres her en række nye fund for

PCA3

biomarkør gen, som dramatisk opreguleret i PSA. Bussemakers et al. [15] havde tidligere vist, at

PCA3

bestod af 4 exoner og at forskellige transkripter opstod på grund af alternativ splejsning af exon 2 og tilstedeværelsen af ​​3 polyadenyleringssteder i exon 4. Vore data viser, at transkriptionsenheden for

PCA3

er betydeligt mere kompliceret end dette. Foruden transkriptionsstartsitet rapporteret af Bussemakers et al. [15] har vi identificeret 4 yderligere transcription start-sites, der strækker sig opstrøms med over 1 kb, der øger størrelsen af ​​exon 1 til 1,27 kb. De udskrifter initierende på disse nye steder udtrykkes forskelligt med kortere isoform 4 (

PCA3-4

) mere stærkt udtrykt i PCa og metastaser. Schalken et al. [16] fastslået, at et fragment på 500 bp umiddelbart opstrøms fra det oprindelige transkriptionsstartsitet (beskrevet her som

PCA3-5

) har alle de kritiske aktivator og repressor sites til at køre

PCA3

udtryk . Vores beskrivelse af yderligere

PCA3

starte sites længere opstrøms af de to kortere isoformer (

PCA3-4

PCA3-5

) er indeholdt i en større transkriptom, og at det er sandsynligt, at der findes andre betjeningselementer længere opstrøms. Dette arrangement af transkriptomet ikke er nyt, da mange gener er arrangeret i komplekse overlappende og interlaced mønstre i eukaryote genomer [26]. I denne rapport udenom mekanismer er påberåbt til forarbejdning på 3′-enden af ​​udskriften. Det samme kan være tilfældet ved 5 ‘enden. Vi beskriver også 2 nye differentielt splejsede exoner (exon 2a og 2b) for

PCA3

som er placeret mellem exon 1 og det oprindelige exon 2 (nu exon 2c) [15]. [16]. [16].