PLoS ONE: Karakterisering af metastasedannelse og Virotherapy i Human C33A Livmoderhalskræft Model

Abstrakte

Mere end 90% af kræft dødelighed skyldes kræft, der har spredt. Derfor er det afgørende at intensivere forskningen på metastase dannelse og terapi. Her beskriver vi for første gang den metastaserende evne af den humane cervikale cancercellelinie C33A i athymiske nøgne mus efter subkutan implantation af tumorceller. I denne model, demonstrerede vi en stadig progression af lændehvirvelsøjlen og renal lymfeknudemetastaser under tumorudvikling. Udover overvejende forekommende lymfatiske metastaser, vi visualiseret dannelsen af ​​hæmatogene metastaser anvender rødt fluorescerende protein (RFP), der udtrykker C33A-RFP-celler. RFP positive cancerceller blev fundet at migrere i blodkar og danner mikrometastaser i lungerne hos tumorbærende mus. Dernæst satte vi os for at analysere indflydelsen af ​​onkolytiske virotherapy i C33A-RFP model og demonstreret en effektiv virus-medieret reduktion af tumorstørrelse og metastatisk byrde. Disse resultater tyder på, C33A-RFP livmoderhalskræft model som en ny platform til at analysere kræft metastaser samt at afprøve nye behandlingsmuligheder for at bekæmpe metastaser

Henvisning:. Donat U, Rother J, Schäfer S, Hess M, Hartl B, Kober C, et al. (2014) Karakterisering af Metastase Dannelse og Virotherapy i Human C33A livmoderhalskræft Model. PLoS ONE 9 (6): e98533. doi: 10,1371 /journal.pone.0098533

Redaktør: Hiroshi Miyazaki, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: September 6, 2013; Accepteret: 5 maj 2014; Udgivet: Juni 2, 2014

Copyright: © 2014 Donat et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskning og udvikling Division Genelux Corporation, San Diego, USA, og en service Grant til universitetet i Würzburg, Tyskland finansieret af Genelux Corp. UD og SW modtog postdoc stipendium. JR, CK, SS, og MH modtog en kandidat stipendium fra Genelux Corporation tildelt universitetet i Würzburg. AAS, JS, NGC, og RJA er funktionærer i Genelux Corporation og har økonomiske interesser i Genelux Corporation. BH er en lønmodtager af Genelux GmbH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dette arbejde blev støttet af forskning og udvikling Division Genelux Corporation, San Diego, USA, og en service Grant til universitetet i Würzburg, Tyskland finansieret af Genelux Corp. UD og SW modtog postdoc stipendium. JR, CK, SS og MH har modtaget en kandidat stipendium fra Genelux Corporation tildelt universitetet i Würzburg. AAS, JS, NGC og RJA er funktionærer i Genelux Corporation og har økonomiske interesser i Genelux Corporation. BH er en lønmodtager af Genelux GmbH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Derudover alle konkurrerende interesser angivet før forfatterne tilføje, at de ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

metastatisk spredning af tumorer er en flertrins proces hvorunder maligne celler formidler fra den primære tumor til fjerne organer [1]. Tumor celler migrere via to store ruter: Lymfesystemet og blodcirkulationen. Under lymfatisk metastase, et fælles træk for de fleste karcinomer, tumorceller forlader den oprindelige tumor websted og migrere efter afvikling i regionale lymfeknuder til fjerne dem [2]. Diagnose af lymfeknudemetastaser er af stor betydning. Selvom, lymfeknudemetastaser selv er sjældent livstruende de angiver tilstanden af ​​tumorprogression [3]. De fleste kræftdødsfald skyldes udvikling af metastaser. Derfor er en bredere forståelse af biologien for metastaser er nødvendig. Tre store platforme i øjeblikket bruges til at udvikle

in vivo

metastase-modeller. Disse omfatter kemisk induktion, hvorved kræftfremkaldende stoffer administreres for at inducere tumorgenese og metastase, syngene og xenograft transplantation modeller, der involverer transplantation af tumorceller /væv ind murine værter og gensplejsede musemodeller [4] – [5]. Her arbejder vi med en xenogen spontan transplantation model af metastaser. er blevet genereret et antal xenogene metastase-modeller i de senere år, for eksempel til prostata [6] – [8], kolorektal [9] – [10], bryst [11] – [12], gastrisk [13] – [14] eller renal celle [15] carcinomer. Derudover er der også nogle modeller af humant papillomvirus (HPV) positiv livmoderhalskræft beskrevet [16] – [18]

I løbet af en livmoderhalskræft screeningsundersøgelse (HPV positive og HPV negative cellelinier) for. onkolytisk virotherapy virkningerne af den onkolytiske vacciniavirus GLV-1h68 på disse cellelinier blev analyseret. Resultaterne viser, at de tilstedeværelser og kopien antal HPV-DNA i livmoderhalskræft celler ikke har indflydelse på den terapeutiske virkning af GLV-1h68 (tabel S1). Desuden opdagede vi dannelsen af ​​lymfeknudemetastaser efter subkutan implantation af C33A HPV-negative humane cervikale cancerceller hos immunkompromitterede mus. Derfor i denne undersøgelse har vi fokuseret på karakterisering af metastaserende evne denne cellelinie, som ikke er blevet beskrevet i litteraturen hidtil. Vi analyserede lymfe og hæmatogen spredning af C33A-RFP celler i nøgne mus efter subkutan implantation af tumorceller, hvorved lymfe cirkulation repræsenterede den vigtigste rute metastaserende tumorceller. Desuden blev en stabil progression af lymfeknudemetastaser i sammenhæng med tumorvækst demonstreret.

Derudover har vi analyseret onkolytisk virotherapy af C33A tumorer og metastaser som en ny behandlingsmulighed. Oncolytiske vira er i stand til selektivt at replikere i cancerceller, hvilket resulterer i ødelæggelse af tumorvæv, men efterlader sundt væv uskadt [19]. Her har vi fokuseret på at studere virkningen af ​​den tidligere beskrevne svækkede, rekombinant vacciniavirus GLV-1h68 [20] – [21]. Den terapeutiske virkning af denne virus på primære tumorer er blevet vist i mange carcinomer, såsom bryst-, pankreas- eller prostatacancer [21] – [23]. Endvidere har vi for nylig viste en terapeutisk potentiale GLV-1h68 ved behandling lymfe og hæmatogene metastaser, der stammer fra den humane prostatacarcinom-cellelinie PC-3 [22], hvilket indikerer, at GLV-1h68 kan være i stand til at udrydde metastaser i C33A-modellen som godt. Faktisk her viste vi en drastisk virus-medieret reduktion af C33A-RFP tumorer og deres metastatiske byrde.

Materialer og metoder

Cellelinjer

HPV-negative menneskelige livmoderhalskræft cancercellelinie C33A blev dyrket i DMEM med højt glucoseindhold (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland) suppleret med 10% FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland) og 1% gentamicin opløsning (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland). Den C33A cellelinje blev venligst stillet til rådighed af Frank Stubenrauch, PhD (UKT, University of Tübingen, [24]). Autenticitet af C33A celler blev bekræftet ved DSMZ GmbH (Leibniz Institute DSMZ-tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer, Braunschweig, Tyskland). C33A-RFP-celler blev dyrket under samme betingelser med undtagelse af tilsætning af 5 ug /ml blasticidin. Humane epiteliale nyreceller (293FT) blev opnået fra Invitrogen GmbH (Karlsruhe, Tyskland) og dyrkes i RPMI 1640 suppleret med 10% FCS og 2 mM L-glutamin (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland).

Generering af C33A-RFP celler

cDNA-sekvensen af ​​den røde fluorescerende protein (

mRFP1

) blev indsat i C33A-genomet under anvendelse Vira Power Lentiviral Expression System (Invitrogen GmbH, Tyskland) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

mRFP1

-kodende plasmid pCR-TK-SEL-mRFP blev leveret af Q. Zhang (Genelux Corporation, San Diego) og anvendt til at generere

mRFP1-

indeholdende lentivirale vektorer som tidligere beskrevet [25]. Replikationsinkompetent

mRFP1

kodende lentivira fremstillet i 293FT celler ved co-transfektion af plasmiderne PLP1, PLP2, PLP /VSVG der leverer lentivirale strukturelle og replikationsproteiner og pLenti6 /V5-DEST-mRFP ekspressionsplasmid under anvendelse af lipofectamin ™ 2000. Efter transduktion af C33A celler med mRFP-kodning lentivira og blasticidin (5 ug /ml) selektion blev en stabil RFP udtrykke C33A klon valgt.

Virus stammen

Den svækkede vacciniavirusstamme GLV- 1h68 er tidligere beskrevet af Zhang

et al

. [21]. Tre ekspressionskassetter koder for

Renilla

luciferase-GFP-fusion protein, β-galactosidase, eller β-glucuronidase blev rekombineret ind i

F14.5L

,

J2R

og

A56R

loci henholdsvis af forældremyndigheden LIVP virus genomet.

Etik erklæring

Alle dyr blev passet og håndteres i nøje overensstemmelse med god dyr praksis som defineret af de nationale og lokal dyrevelfærd organer (guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr offentliggjort af National Institutes of Health og den tyske dyreværnsloven “TierSchG”). Eksperimentelle protokoller blev godkendt af regeringen i Unterfranken, Tyskland (protokol nummer 55.2-2531.01-17 /08 og 55.2-2531.01-25 /12) og /eller Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Explora BioLabs, der ligger i San Diego Science center (San Diego, USA) (protokol numre: EB08-003; EB11-025).

Tumor implantation og virus administration

Tumorer blev genereret ved at implantere 5 × 10

6 C33A-RFP-celler i 100 pi PBS subkutant i den højre abdominale flanke af 6-8 uger gammel kvinde athymiske nøgne

Foxn1

nu

mus (Harlan Winkelmann GmbH, Borchen, Tyskland). Tumor og lymfeknude volumen blev overvåget i to dimensioner under anvendelse af en digital skydelære og beregnet som [(længde) x (bredde)

2 × 0,52]. Tumor volumen blev målt i levende mus, mens lymfeknude volumen blev målt

post mortem

, efter åbning af maven. En lymfeknude blev defineret til at blive udvidet, når den maksimale diameter over 3 mm. Til undersøgelse af virkningen af ​​onkolytiske virotherapy en enkelt dosis på 5 × 10

6 plakdannende enheder (pfu) af GLV-1h68 i 100 pi PBS blev injiceret intravenøst ​​(iv) ind C33A-RFP tumorbærende mus, efter tumoren volumen nåede 200-250 mm

3. Musene blev aflivet i henhold til retningslinjerne for eutanasi af Gnavere hjælp kuldioxid.

Fluorescens imaging

Billeder af C33A-RFP tumor-bærende mus blev taget med Maestro EX Imaging System (Caliper, Hopkinton , MA, USA). Fluorescensimagografi af tumorer, nyrer, lunger og lymfeknuder fra C33A-RFP tumorbærende mus blev udført med en MZ16 FA Stereo-fluorescensmikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland). Til billeddannelse af mus med Maestro EX Imaging System blev dyrene bedøvet ved anvendelse af 2-3% isofluran. Digitale billeder blev behandlet med Photoshop 7.0 (Adobe Systems, Mountain View, USA).

Måling af fluorescensintensitet

Måling af fluorescensintensiteten af ​​RFP-signalet i lymfeknuder og nyrer af C33A- RFP tumorbærende mus blev udført under anvendelse ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij). RGB-billeder af RFP-signalet af nyrer og lymfeknuder blev omdannet til 8-bit gråtoner med en intensitet interval 0-255. Fluorescensintensiteten repræsenterer den gennemsnitlige lysstyrke alle RFP relaterede pixels.

Immunhistokemi

til histologi, tumorer, lymfeknuder og nyrer blev skåret ud og fikseret i 16 timer i 4% paraformaldehyd /PBS, pH 7.4. Fremstilling af 100 um snit og etikettering blev udført som tidligere beskrevet [26] under anvendelse af Leica VT1000 Vibratom (Leica, Heerbrugg, Schweiz). Efter mærkning blev vævssnit monteret i Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland). Til fremstilling af 10 um snit vævsprøver blev snittet med kryostaten 2800 Frigocut (Leica, Wetzlar, Tyskland). Efter dehydrering i 10% og 30% saccharose (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) prøver blev indlejret i Tissue-Tek O.C.T. (Sakura Finetek Europe BV, Alphen aan den Rijn, Holland). Cryo-snit blev opbevaret ved -80 ° C og inkuberet med primære antistoffer i 1 time. Efter vask med PBS blev snit farvet i 1 time med sekundære antistoffer og endelig monteret i Mowiol 4-88.

Antistoffer og reagenser

Endoteliale blodkar blev farvet med et hamster monoklonalt anti-CD31 antistof (Chemicon International, Temecula, USA; MAB1398Z) og endotel lymfeknuder fartøjer med en kanin polyklonalt anti-Lyve-1 antistof (Abcam, Cambridge, UK, ab14917). Kerner blev Hoechst 33342-mærkede (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Tyskland). DyLight488-konjugeret sekundære antistoffer (æsel) blev opnået fra Jackson ImmunoResearch (Pennsylvania, USA). Primære og sekundære antistoffer blev fortyndet 1:100 i PBS /0,3% Triton-X-100

Fluorescens mikroskopi

Billeder af tumor, lymfeknuder og nyrer sektioner blev fanget med følgende mikroskoper.: en stereo-fluorescensmikroskop MZ16 FA (Leica) udstyret med en digital CCD kamera og Leica IM1000 4.0 software (1300 × 1030 pixel RGB-farvebilleder), en TCS SP2 AOB’er konfokal laser mikroskop (Leica) udstyret med software LCS 2,16 ( 1024 × 1024 pixel RGB-farvebilleder) og en Axiovert 200 M mikroskop (Zeiss) med Axiovision 4.5 software (1388 × 1040 pixel gråtoner), hhv. Digitale billeder blev behandlet med Photoshop 7.0 (Adobe Systems, USA) og fusionerede at give pseudo-farvede billeder. Billeder af celler podet i 24-brønds plader blev fanget enten med stereo-fluorescensmikroskop MZ16 FA (Leica) eller med den Axiovert 200 M mikroskop (Zeiss).

Fremstilling af enkeltcelle-suspensioner og FACS-analyse

til fremstilling enkeltcellesuspensioner af tumorer, lænde- og renale lymfeknuder, lunger og nyrer hos C33A-RFP tumorbærende mus væv blev vejet, hakket og inkuberet enkeltvis i DMEM med højt glucoseindhold medium suppleret med 2% FCS, 10.000 U /ml Collagenase i (Sigma, Steinheim, Tyskland) og 5 MU /ml DNase i (Calbiochem, Darmstadt, Tyskland) ved 37 ° C. Tumorvæv blev inkuberet i 35 min, LN og RN væv i 30 minutter, nyrer i 20 minutter og lunger i 15 minutter. Efterfølgende blev vævene ledt gennem 70 um nylon mesh filtre (BD Biosciences, Erembodegem, Belgien) og overført til DMEM med højt glucoseindhold medium suppleret med 2% FCS. Efter centrifugering (1000 g, 10 min) pellets blev resuspenderet i 2 x volumen PBS /2% FCS, med hensyn til væv vægt. Efterfølgende, 100 pi af enkeltcellesuspensioner blev analyseret ved anvendelse Accuri C6 cytometer og FACS-analyse software CFlow Version 1.0.227.4 (Accuri cytometre, Inc. Ann Arbor, MI, USA). Celler blev gated ifølge deres størrelse (FSC) og kornethed (SSC). Desuden blev 100 uL af de enkelte cellesuspensioner udsået i plader med 24 brønde i 1 × 10

-1 til 1 × 10

-4 fortyndinger. Fortyndinger blev fremstillet i DMEM med højt glucoseindhold medium suppleret med 10% FCS. Tre dage efter cellesuspension såning medier blev suppleret med 5 mg /ml blasticidin, at vælge C33A-RFP celler. Celle vask og medier fornyelse blev udført to gange om ugen. Efter en uges blasticidin udvælgelse C33A-RFP celler i pladerne med 24 brønde blev farvet med krystalviolet i 3 timer, vasket og tørret. Bagefter blev celle kolonier talt.

Statistisk analyse

En to-tailed Students

t

test blev anvendt til statistisk analyse.

P

værdier på ≤0.05 blev betragtet som statistisk signifikant. Stjerner angiver en signifikant forskel mellem eksperimentelle grupper. (* Angiver p ≤ 0,05; ** indikerer p≤0.01; *** indikerer p≤0.001)

Resultater

Vækst kinetik subkutan C33A- RFP tumorer og lymfeknudemetastaser dannelse

En observeret forstørrelse af lumbale og renal lymfeknuder i C33A tumorbærende mus indikerede tilstedeværelsen af ​​metastaseret tumorceller. At muliggøre visualisering af metastatisk C33A celle-spredning, cDNA-sekvensen af ​​den røde fluorescerende protein (

mRFP1

) blev indsat i C33A-genomet. Ekspression af RFP i C33A celler blev bekræftet ved fluorescensmikroskopi (fig. 1a). Efterfølgende 5 × 10

6 C33A-RFP celler blev subkutant (s.c.) implanteret i den højre flanke hos nøgne mus. Hver uge op til 49 dage efter implantation seks til syv C33A-RFP tumor-bærende mus blev undersøgt. Som en del af disse analyser volumener tumorer, columna (LN1, LN2) og renal (RN1, RN2) lymfeknuder blev målt (Fig. 1b + c) og fluorescens billeddannelse af tumorer og lymfeknudemetastaser blev udført (fig. 1d) . Vi viste en støt stigning af tumorvolumen fra uge til uge efter implantation af C33A-RFP-celler. Samtidig blev de volumener af lænde- og renale lymfeknuder stigende så godt, hvilket indikerer en mulig tumorcelle kolonisering proces resulterer i lymfeknude volumenekspansion. Fluorescensimagografi bekræftede RFP signaler i de forstørrede lymfeknuder, hvilket viser C33A-RFP metastaser. Især volumenet af LN1, lænde- lymfeknude placeret tættest på primære C33A-RFP tumor, var stigende første og største, som ville forventes for regionale lymfeknudemetastaser.

tumorer og lymfeknuder fra seks til syv mus pr tidspunkt blev analyseret (7 og 21 dpti: n = 7; 14, 28, 35 og 49 dpti: n = 6). en Bright felt (BF), RFP og overlay billeder af C33A-RFP celler, skala søjle repræsenterer 100 um. b Time kurve af C33A-RFP tumorvækst. c Volumen af ​​lumbal og renal lymfeknuder over tid. d Repræsentative billeder af tumorer (øvre række) og tilsvarende lymfeknuder (nedre række) af C33A-RFP tumorbærende mus ved de angivne dage efter tumorcelleimplantation. Billeder af tumorer (T) blev taget af levende mus ved hjælp af Maestro EX Imaging System. Imaging af lumbal (LN1, LN2) og renal (RN1, RN2) lymfeknudemetastaser i maven af ​​tumor-bærende mus blev udført

post mortem

, efter åbning af maven og fjerne organer. Scale søjler repræsenterer 2 mm. e Procentdel af alle lymfeknuder positiv for RFP over tid. f Andel af LN1, LN2, RN1 og RN2 henholdsvis positiv for RFP per tidspunkt.

Desuden fluorescens billeddannelse i den tid løbet af 49 dage viste en støt stigning af mængden af ​​lymfeknuder positive for RFP efter tumorcelleimplantation, startende med 21% RFP positive lymfeknuder på dag 7. det beløb forhøjes til 88% lymfeknuder positive for RFP ekspression ved slutningen af ​​forsøget (fig. 1e). Endvidere blev procentdelen af ​​RFP positiv LN1, LN2, RN1 og RN2 analyseret pr tidspunkt. På dag 7 efter implantation var positive for RFP 86% af alle afslørede LN1s, mens der ikke RFP signal var påvises i LN2, RN1 eller RN2 fører til den antagelse, at metastatisk kolonisering med C33A-RFP celler sker først i den regionale lymfeknude LN1. Fjorten dage efter tumorcelleimplantation (dpti) alle detekterede LN1s (100%) og 50% af RN1s var positive for RFP, hvilket indikerer, at efter metastaserende at LN1 de C33A-RFP celler spredt til næste lokale lymfeknuder (renal lymfeknude RN1) . Metastaseret C33A-RFP celler i LN2 og RN2 blev først detekteret på dag 28 efter implantation (fig. 1f). Tilsammen viste vi en kontinuerlig progression af metastase af lændehvirvelsøjlen og renale lymfeknuder falder sammen med C33A-RFP tumorvækst fra uge til uge efter s.c. tumorceller implantation.

C33A-RFP tumorceller metastaserer via både lymfe og hæmatogene ruter

Under vores mikroskopiske undersøgelser påviste vi tilstedeværelsen af ​​C33A-RFP celler i lymfeknuder fartøjer forbinder lændehvirvel og renal lymfeknude metastaser i C33A-RFP tumor-bærende mus, hvilket viser lymfekarrene som rute sekundær metastase i denne model (fig. 2a, b) .Desuden cirkulerende C33A-RFP celler blev også påvist i erythrocyt indeholder blodkar placeret ud til LN-RN-forbindende lymfekar, hvilket afspejler den hæmatogen rute metastatisk migrering af tumorceller (fig. 2c). Især fluorescensimagografi afslørede RFP signaler i lungerne hos C33A-RFP tumorbærende mus, som normalt er den første organ til at få metastaseret i tilfælde af metastatisk spredning via hæmatogen rute. Op til dag 28 efter tumorcelleimplantation ingen lunge viste sig at være positive for RFP, hvorimod på dag 35 tre ud af seks og på dag 49 fem ud af seks lunger blev testet positive for RFP pletter (fig. 2d).

en Migration af C33A-RFP celler i en lymfeknuder fartøj forbinder LN1 og RN1 42 dpti. Scale søjler repræsenterer 2 mm. b Lyve-1-farvning af 100 um tværsnit af delen mellem LN1 og RN1. Scale søjler repræsenterer 200 um. c Migration af C33A-RFP-celler i en lymfe (fyldt pilespids) og i en erythrocyt indeholder blodkar (åben pilespids) 32 dpti. Scale søjler repræsenterer 2 mm (venstre) og 500 um (højre). d RFP signaler i lungerne hos C33A-RFP tumorbærende mus. Herover: repræsentativ billede af en lunge 42 dpti. Scale bar repræsenterer 2 mm. Herunder: procentdel af lunger testet positiv for RFP pletter over tid. Lunger af seks til syv mus pr tidspunkt blev undersøgt (7 og 21 dpti: n = 7, 14, 28, 35 og 49 dpti: n = 6)

Sammenfattende vi klart demonstreret. at C33A-RFP celler bruger lymfe samt hæmatogene ruter for metastatisk spredning i fm implanteret tumor-bærende nøgne mus.

Desuden observerede vi en ophobning af RFP signal i nyrer fra disse mus ved fluorescensimagografi under tidsforløbet for 49 dage (fig. 3). Histologisk analyse af tumorer, LN og rns af tumor-bærende mus 31 dpti afsløret en organiseret struktur RFP udtrykke C33A celler i tumorer og lymfeknudemetastaser, hvilket ikke var tilfældet for RFP i nyrerne (Fig. 4a). Endvidere viste vi, at de renale RFP signaler blev placeret hovedsageligt i cortex og CD31 mærkede blodkar i medulla og bækken af ​​nyrerne (fig. 4b). Billeder af det renale cortex med større forstørrelse afslørede RFP akkumulering i nefroner, hvorved RFP syntes at være placeret celle-uafhængigt i punktformet mønstre (fig. 4C). Ingen mikrometastaser blev observeret i nyrer. Derfor antager vi, at det stærke RFP signal i nyrerne af C33A-RFP tumor-bærende mus kan skyldes aflejring af RFP i renal cortex, efter blod filtrering i nefroner. I modsætning til hvad vi har observeret i nyrerne, blev påvist mikrometastaser i lungerne hos C33A-RFP tumorbærende mus 42 dpti (fig. 4d venstre). Desuden var single C33A-RFP celler fundet i blodkarrene i lungerne samt RFP fragmenter svarende til dem observeret i renal cortex af nyrerne (fig. 4d højre).

Seks til syv mus blev analyseret pr tidspunkt (7 og 21 dpti: n = 7; 14, 28 og 35 dpti: n = 6). En repræsentant billeder af RFP-signal i nyrerne. Øverste række: overlejring af lysfelt og RFP billeder. Nederste række: billeder af RFP-signal. Scale søjler repræsenterer 2 mm. b gennemsnitlige fluorescensintensitet af RFP signal i nyrer fra C33A-RFP tumorbærende mus over tid.

Kerner i a, b og c blev farvet med Hoechst-farvestof. a Overlays af lyse felt, RFP og Hoechst billeder af 10 um sektioner af en tumor, LN, RN og nyre 31 dpti. Scale søjler repræsenterer 50 um. b Billeder af 100 um sektioner af en nyre 31 dpti, farvet med anti-CD31-antistof og Hoechst farvestof. Scale bar repræsenterer 2 mm. c 10 um nyre sektion farvet med Hoechst-farvestof. Til højre: konfokal billede. Scale søjler repræsenterer 100 um (til venstre) og 10 um (til højre). d CD31 og Hoechst-farvning af 100 um lungesnit 42 dpti. Fyldt pilespids: i et blodkar migrerende C33A-RFP celle; tom pilespids: RFP positive fragmenter. Scale søjler repræsenterer 250 um (venstre) og 50 um (højre). Alle billeder er repræsentative eksempler.

Samlet set histologiske analyser afslørede en klar, organiseret struktur af RFP udtrykke C33A celler i tumorer og lymfeknudemetastaser, mens RFP signal i nyrerne syntes at være hovedsagelig et resultat af protein deposition og ikke kun af metastaseret RFP-positive tumorceller. RFP signal i lungerne syntes at være forårsaget af både, spredt og afregnes C33A-RFP celler og RFP deposition.

Påvisning af levedygtige C33A-RFP celler i tumorer, LN, rns, lunger og nyrer af tumor-bærende mus

for yderligere at undersøge, om RFP signal i tumorer, LN, rns, lunger og nyrer af C33A-RFP tumorbærende mus resulterede fra levedygtige C33A celler, encellede suspensioner af disse væv af 5 mus 49 dpti blev forberedt og analyseret ved FACS. Vi fandt, at 83% af cellerne i tumor cellesuspensioner var positive for RFP, 42% i LN, 32% i RN, 11% i lunge og 18% i nyre suspensioner (fig. 5A). Derfor RFP-positive tumorceller var påviselige i alle analyserede væv af C33A-RFP tumorbærende mus.

Væv af alle 5 mus blev analyseret (n = 5). en Mængde af RFP positive (RFP +) og negative (RFP-) celler i enkeltcelle-suspensioner af tumor, LN, RN, lunge og nyrer. 10.000 hændelser blev analyseret ved FACS. b Vækst af forskellige fortyndinger (10

-1-10

-4) af C33A-RFP enkeltcellesuspensioner i brønde i plader med 24 brønde efter en uges blasticidin markering. Venstre billede: medieforbrug i brønde indeholdende 2 dage gamle medier. Højre billede: brønde efter farvning med krystalviolet. c Antal kolonidannende C33A-RFP celler per gram tumor, LN, RN, lunge og nyre, hhv. Cell kolonier blev talt for hvert organ efter blasticidin-udvælgelse og krystalviolet farvning.

For at afgøre, hvor mange af disse RFP positive celler var faktisk levedygtige tumorceller, vi udførte en blasticidin udvalg assay. Efter en uges blasticidin forbrug selektionsmedium (indikeret ved at ændre farven af ​​phenolrødt fra rødt til gult) korreleret med mængden af ​​levedygtige celler (fig. 5b, venstre). Crystal violet farvning viste desuden, at tumoren, LN og RN suspensioner indeholdt mere levedygtige C33A-RFP celler end lunge og nyre suspensioner (Fig. 5b, højre). Kun nogle få positive C33A-RFP cellekolonier blev observeret i brønde i lunge og nyre suspensioner i 10

-1 fortyndinger, mens RFP positive celler blev bemærket i alle fortyndinger af tumoren, LN og RN suspensioner.

Efterfølgende blev de farvede C33A-RFP cellekolonier talt i de passende fortyndinger og antallet af kolonidannende C33A-RFP celler pr gram væv blev bestemt for tumorer, metastaser og organer. Det viste sig, at 8,6 × 10

6 (± 2,9 × 10

6) kolonidannende C33A-RFP celler blev opdaget per gram tumorvæv, 1,7 × 10

7 (± 5,9 × 10

6 ) i LN og 1,5 × 10

7 (± 1,7 × 10

7) i RN. I modsætning hertil kun 4,8 × 10

3 (± 9,7 × 10

3) blev påvist kolonidannende C33A-RFP celler lunger og 8,1 × 10

3 (± 1,7 × 10

4) i nyrerne (fig. 5c).

således demonstrerede vi en signifikant lavere mængde levedygtige C33A-RFP-celler i lunger og nyrer end i tumorer og lymfeknudemetastaser af tumorbærende mus, hvilket viste, at C33A-RFP metastaser dannelse sker hovedsageligt via lymfe rute.

Bekæmpelse metastaser i C33A-RFP model

Når, metastatisk spredning af C33A-RFP celler i nøgne mus efter sc implantation af tumorceller var præget, vi satte os for at undersøge muligheden for en onkolytisk virotherapy som en ny mulighed for C33A-RFP tumorer og metastaser behandling. For nylig er det blevet vist, at den onkolytiske vacciniavirus GLV-1h68 er et effektivt middel til at bekæmpe hematogene samt lymfatiske metastaser i human prostatacancer model PC-3 [22], [27]. Baseret på dette, GLV-1h68 synes at være en lovende kandidat til at udrydde C33A-RFP metastaser. Først blev 12 C33A-RFP tumorbærende mus injiceret 11 dpti med 5 × 10

6 plakdannende enheder (pfu) af GLV-1h68 eller PBS som en kontrol, hhv. Så tidligt som 14 dage efter virus /PBS injektion (dpi) tumor volumen i GLV-1h68 behandlede gruppe begyndte at falde. Fra 18 dpi på en statistisk signifikant reduktion af tumorvolumener C33A-RFP blev opnået på grund af virus behandling sammenlignet med PBS-behandlede kontrol tumorer (fig. 6a). Tumorvolumener blev reduceret til den oprindelige størrelse. Histologiske analyser af virus behandlede og kontrol tumorer 21 dpi afslørede en massiv spredning af GLV-1h68 i tumorer i virus gruppen, forbundet med en lavere fluorescensintensitet af RFP og Hoechst, hvilket indikerer virus-medieret, udtalt nekrose af tumorvæv (fig. 6b ). Endvidere volumener lumbal og renale lymfeknuder i PBS-gruppen var signifikant højere sammenlignet med dem i virusset behandlede gruppe 21 dpi, hvilket indikerer en metastaser inhiberende virkning af GLV-1h68 (fig. 6c). I yderligere analyser, lymfeknuder positive for C33A-RFP blev bestemt ved fluorescensmikroskopi. Det viste sig, at 16 ud af 22 forstørrede lymfeknuder (72,3%) var positive for RFP i PBS koncernen, mens kun en ud af 15 forstørrede lymfeknuder (6,7%) blev testet positiv for RFP i GLV-1h68 behandlede gruppe ( fig. 6d), hvilket viser virus-medieret terapeutisk virkning på lymfeknudemetastase formation. Desuden mikroskopiske analyser af lændehvirvelsøjlen lymfeknudemetastase sektioner viste, at hverken RFP eller virus-kodet GFP er detekterbar 21 dage efter virus injektion. I modsætning hertil blev et stærkt RFP signal påvist i lymfeknuder fra PBS-behandlede C33A-RFP tumorbærende mus. Til sidst, RFP i nyrer og lunger af C33A-RFP tumorbærende mus blev analyseret mikroskopisk og sammenlignet i PBS og virus-behandlede grupper. I begge tilfælde blev der observeret en drastisk reduktion af RFP grund af virus behandling (fig. 6f, g).

Time kurve af C33A-RFP tumorvækst i 12 mus efter administration af onkolytiske vacciniavirus GLV-1h68 og PBS henholdsvis (n = 6). Analyser af C33A-RFP tumorer og metastaser i b-g blev udført 32 dpti og 21 dage efter indgivelse af GLV-1h68 eller PBS (dpi). Seks mus blev undersøgt hver gruppe (n = 6). b Venstre: C33A-RFP tumor-bærende mus 21 dpi. Højre: 100 um sektioner af en PBS og en GLV-1h68 behandlede tumor. Kerner blev farvet med Hoechst farvestof, er GFP udtrykt af GLV-1h68 og RFP ved C33A celler. c bind af lændehvirvelsøjlen og renale lymfeknuder og d procentdel af RFP positive lymfeknuder i PBS og GLV-1h68 behandlet C33A-RFP tumorbærende mus (venstre). Højre: Billeder af lumbal og renal lymfeknuder i PBS og GLV-1h68 behandlede mus. e 100 um sektioner af en PBS (venstre) og et GLV-1h68 (højre) behandlet lumbal lymfeknudemetastase. f Venstre: Procentdel af nyrer er positive for RFP i PBS og GLV-1h68 behandlede mus. Til højre: Billeder af nyrer i PBS og virus gruppe. g Procentdel af lunger positive for RFP i PBS og GLV-1h68 gruppe. Alle billeder er repræsentative eksempler. Alle skala søjler repræsenterer 2 mm.

Alt i alt, vi demonstrerede en effektiv virus-medieret reduktion af tumorstørrelse og metastatisk byrde i C33A-RFP tumor-bærende mus 21 dpi.

Diskussion

Siden metastatisk spredning af karcinomer repræsenterer den største årsag til kræft dødsfald, der er et presserende behov for at intensivere forskning med fokus på området tumormetastaser.