PLoS ONE: Hæmning af JAK2 /STAT3 Pathway Reducerer Gastric Cancer Vækst In vitro og in vivo

Abstrakt

Signal Transducer og Activator of Transcription-3 (STAT3) er konstitutivt aktiveret i mange kræftformer, hvor det fremmer væksten, inflammation, angiogenese og hæmmer apoptose. Vi har vist, at STAT3 konstitutivt aktiveres i human gastrisk cancer, og at kronisk IL-11-drevne STAT3 transkriptionel aktivitet inducerer gastrisk tumorigenese i gp130

757FF musemodel for gastrisk cancerudvikling. Her viser vi, at behandling af humane AGS gastriske cancerceller med Janus-kinase (JAK) inhibitor WP1066 dosis- og tidsafhængigt inhiberer STAT3 phosphorylering, sammenholdt med reduceret JAK2 phosphorylering, reduceret proliferation og forøget apoptose. Hertil kommer, anvendelse af intraperitoneal WP1066 i 2 uger, reducerede gastrisk tumor volumen med 50% i gp130

757FF mus sammenfaldende med reduceret aktivering JAK2 og STAT3 sammenlignet med bærerbehandlede, kuld kontroller. Gastriske tumorer fra WP1066- behandlede mus havde reduceret polymorfonuklear inflammation, sammenfaldende med inhibering af talrige proinflammatoriske cytokiner, herunder IL-11, IL-6 og IL-1β, samt vækstfaktorerne Reg1 og amphiregulin. Disse resultater viser, WP1066 kan blokere proliferation, reducere inflammation og inducere apoptose i gastriske tumorceller ved at inhibere STAT3 phosphorylering, og at mange cytokiner og vækstfaktorer, der fremmer gastrisk tumorvækst reguleres af STAT3-afhængige mekanismer. WP1066 kan danne grundlag for fremtidige lægemidler mod mavekræft

Henvisning:. Judd LM, Menheniott TR, Ling H, Jackson CB, Howlett M, Kalantzis A, et al. (2014) Hæmning af JAK2 /STAT3 Pathway Reducerer Gastric Cancer Vækst

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 9 (5): e95993. doi: 10,1371 /journal.pone.0095993

Redaktør: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, USA

Modtaget: Januar 21, 2014 Accepteret: April 1, 2014; Udgivet: 7. maj 2014

Copyright: © 2014 Judd et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af midler fra; NHMRC Australia (www.nhmrc.gov.au) projekttilskud # 509.165 NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer.gov) melanom SPORE P50 CA093459-06, NIH /NCI USA (nih.gov; www.cancer. gov) hjerne SPORE 2 P50 CA127001-06. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Waldemar Priebe holde patenter og har en økonomisk interesse i udviklingen af ​​sammensatte WP1066 som følger ; W.Priebe, N.Donato, M.Talpaz, S, Szymanski, I. Fokt, A. Levitzki Forbindelser til behandling af celleproliferative sygdomme. Unites States Patent WO /2005 /058.829 12/01/2004. Bemærk også, at forfatterne har givet en ændret opgørelse af konkurrerende interesser vedrørende et patent på WP1066 indehaves af W. Priebe. Forfatterne erklærer også, at “dette ikke ændrer vores tilslutning til PLoS ONE politikker på datadeling og materialer”.

Introduktion

Af de syv Signal Transducer og Activator af transskription (STAT) familiemedlemmer , STAT3 har været mest konsekvent impliceret i en række almindelige kræftformer hos mennesker, herunder; lunge-, bryst-, ovarie-, prostata- og colon [1], [2], [3], [4]. Dette gælder også i human gastrisk cancer [5], [6], [7], hvori STAT3-aktivering ved kronisk phosphorylering på tyrosin (Y) opholde 705 er blevet forbundet med øget vækst, angiogenese, invasion og metastase af den primære cancer [ ,,,0],6], [7], [8]. Således kan hæmning af STAT3 transkriptionsaktivitet i human gastrisk cancer give et muligt middel til at reducere den høje sygelighed og forlænge livet blandt mavecancerpatienter verdensplan.

I mangel af funktionelle mutationer i STAT3 genet, afvigende STAT3 aktivitet induceres ved vedvarende aktivitet fra opstrøms tyrosinkinaser, og /eller ved unscheduled- eller overekspression af stimulerende ligander [9], [10], [11]. Dette er klart eksemplificeret i gp130

757F /F musemodel for gastrisk cancerudvikling, hvori en Phe til Tyr substitution ved 757 position på den intracellulære arm af IL-6 familien signalering receptor gp130 samtidigt forhindrer SHP2 og SOCS3 binding , hvilket resulterer i hæmning af ras /MAP kinase signaltransduktion, og hyperaktivering af STAT3 ved konstitutiv phosphorylering [23], [24], [26]. For nylig har vi og andre vist, at i gastriske tumorer, signifikante stigninger i transkription sammenfaldende med øget ekspression af gp130 ligand IL-11 i humane gastriske cancer og musemodeller for denne sygdom [5], [12], [13]. I sidstnævnte IL-6 kan undværes, men IL-11 er absolut påkrævet for tumorigenese [12], [13]. Derudover har IL-11 /STAT3 vist sig at være en vigtig drivkraft for atrofisk gastritis, den første præcancer læsion i maven efter kronisk infektion med bakterien

Helicobacter pylori

[14].

til dato er der blevet rapporteret talrige kinaser at inducere STAT3 aktivitet efter ligand /receptor-binding, imidlertid kun JAK1 og JAK2 konto for STAT3 phosphorylering ved docking med IL-11 /gp130-receptorkomplekset [15] og af disse IL-11 /gp130 fortrinsvis binder JAK2 [16]. Disse observationer tyder på, at JAK2 og STAT3 nuværende lovende mål for at designe terapeutiske antagonister til at undertrykke IL-11 /STAT3 signalering i human gastrisk cancer.

For nylig kaffesyre derivat WP1066, strukturelt relateret til lav styrke tyrosinkinasehæmmer AG490 , har vist sig at være en meget kraftigt virkende inhibitor af JAK2 /STAT3 vej hos transformerede hjerne gliom [17] og renal carcinoma [18] cellelinjer, hvilket fører til væksthæmning og induktion af klassiske pro-apoptotiske veje. Desuden WP1066 er effektiv

in vivo

mod højt maligne melanomer og leukæmier, der er positive for JAK2-V617F + mutation, som fremmer konstitutiv JAK2 kinase aktivering [19], [20], [21], [22 ]. Ikke offentliggjorte undersøgelser viser, at WP1066 er ikke en ATP-kompetitiv inhibitor, og kan blokere ekspression af phosphoryleret JAK2 og STAT3; derudover kan p-STAT3-Y705 inhiberes uafhængigt af JAK2 status. , WP1066 præsenterer således en unik mulighed for at hæmme både p-JAK og p-STAT3, og efterfølgende kraftigt blokere JAK2 /STAT3 signalvejen og STAT3 transkriptionel aktivitet.

For at teste idéen om dobbelt blokade af JAK2 og STAT3-aktivering i maven og efterfølgende mavekræft udvikling, har vi brugt både

in vitro

in vivo

tilgange til at vurdere, om WP1066 kan forsinke eller blokere gastrisk tumor vækst gennem hæmning af JAK2 /STAT3 aktivitet, og andre nært beslægtede onkogene signalveje. Her viser vi, at WP1066 effektivt inhiberer STAT3 phosphorylering, og inducerer apoptose i en gastrisk cancercellelinie, og at det kan inhibere gastrisk tumorvækst

in vivo

ved at blokere induktion af centrale STAT3-regulerede gener.

Materialer og metoder

tilberedning og opbevaring af kinase hæmmere

Inhibitor WP1066 blev udviklet og syntetiseret af Waldemar Priebe og kolleger ved University of Texas MD Anderson Cancer center, og nuværende bestand blev leveret høflighed af Houston Pharmaceuticals Inc, Houston, Texas, USA. Lagre blev resuspenderet i Hybri-Max DMSO og opbevaret ved -20 ° C. Aktier var engangsbrug, og må ikke genfryses efter optøning.

In vitro Kultur

AGS celler (ATCC, Manassas VA, USA) celler blev opretholdt i komplette medier indeholdende RPMI + Glutamax ( Gibco Life Sciences, Invitrogen OR, USA) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 50 IU penicillin ved 37 ° C i 5% CO

2-95% luft.

Western Blotting

Proteinekstrakter blev fremstillet med enten TRIzol-reagens (Life Technologies, Vic, Australien) ifølge producentens instruktioner og proteinholdige pellets blev resuspenderet i 1% natriumdodecylsulfat indeholdende 2 mmol /l Na

3VO

4 eller RIPA buffer. Aliquoter (30 ug) blev underkastet natriumdodecylsulfat /polyacrylamidgelelektroforese. Membraner blev blokeret og inkuberet ved 4 ° C natten over i skummetmælk med følgende antistoffer; STAT3, pY (705) STAT3, ERK1 /2, pT (202), Y (204) ERK1 /2, AKT, pS (473) AKT, JAK2, pY (1007), Y (1008) JAK2 (Cell signalering, # 9132, # 9134S, # 9131, # 9102 # 4377, # 9272, # 4058, # 3752, # 3751, # 3229, # 3771), GAPDH (Abcam # 9485). Membraner blev inkuberet med peroxid-konjugeret sekundært antistof (Dako, polyklonalt svine-anti kanin, HRP konjugeret, # P0399) og visualiseret ved forøget kemiluminescens (Amersham, Buckinghamshire, UK). Til analyse bands blev kvantificeret ved hjælp af Mængde One-software-system (Biorad) og phosphorylerede proteiner udtrykt som en andel af GAPDH fra en dublet membran. Mindst n = 8 prøver blev vurderet ved enten behandling.

Cell Counting af Haemocytometry

Celler blev podet ved 5 x 10

4 celler /ml i 24-brønds format i komplette medier og lodes vokse uforstyrret i 24 timer. Celler blev behandlet med den passende koncentration af WP1066 eller DMSO som kontrol for 0-360 min. Efter behandling blev cellerne løsnet ved behandling med trypsin-EDTA 0,25% (Sigma), farvet med trypan-blåt 0,4% (Sigma) ved en 1:01 fortynding i 5 minutter ved 4 ° C, og talt på et hæmocytometer.

carboxyfluorescein diacetat succinimidylester (CFSE) Farvning

For at mærke AGS celler med CFSE, celler blev løsnet ved behandling med trypsin-EDTA 0,25% (Sigma) og resuspenderet i forvarmet PBS /0,1% BSA ved en tæthed 1 × 10

6 celler /ml. 10 mM CFSE farvestof (Invitrogen) blev fremstillet som pr fabrikantens protokol, så 5 pl /ml blev tilsat og blandet grundigt ved inversion for at sikre homogen mærkning af celler. Prøver blev inkuberet ved 37 ° C i 10 minutter, standset ved tilsætning af 5 volumener iskold medier og inkuberet i 5 minutter på is. Prøver blev derefter vasket 5 gange i medier og udplades ved 2 × 10

5 celler /brønd (6 brønde). En prøve af celler blev taget efter udpladning og mærket med 100 ug /ml propidiumiodid (PI) og analyseret ved flowcytometri for ensartethed og intensitet mærkning. Celler blev derefter dyrket i komplet medium i 48 timer, hvorefter de blev behandlet med eller uden passende WP1066 (5 uM) ved 37 ° C med 5% CO

2 95% luft i 18 timer. Celler blev derefter trypsinbehandlet som ovenfor og resuspenderet i komplette medier, mærket med 100 ug /ml PI, og analyseret ved flowcytometri ved 488 nM. Dataene blev optaget med BD FACS diva (BD Biosiences) softwarepakke og analyseret af Modfit LT softwarepakke (VSH).

Annexin V Farvning

AGS celler blev dyrket i komplette medier ved 2 × 10

5 celler /brønd i 6-brønds plader med DMSO (bærer kontrol) eller WP1066 (5 uM), eller etoposid (200 uM; positiv kontrol) ved 37 ° C med 5% CO

2 95% luft uforstyrret i 24 timer. Celler blev derefter behandlet som følger; vasket i iskold PBS, trypsineret som ovenfor, og celledensiteten bestemt ved haemocytometry før resuspension i Annexin bindingsbuffer til 1 × 10

6 celler /ml. 100 pi af denne præparation blev taget, og inkuberet med 5 pi komponent A (Annexin Fluor 488 annexin V komponent, 25 mM Hepes, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,1% bovint serumalbumin) og 1 ug /ml af PI i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Prøver blev derefter blandet med 400 pi Annexin bindingsbuffer og analyseret ved flowcytometri. Passende kontroller +/- reaktionsbestanddele var parate til at justere for skævheder i gating. Dataene blev optaget med BD FACS diva (BD Biosiences) softwarepakke.

Etik Statement

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med den australske koden for pasning og anvendelse af dyr til videnskabelige formål (7

th udgave), og efter godkendelse fra Murdoch Childrens Research Institute Animal Ethics Committee (ansøgning # A583). blev gjort alt for at minimere ubehag i disse minimalt invasive procedurer.

In vivo

Eksperimenter

gp130

757F /F mus er blevet beskrevet tidligere [23]. Kort beskrevet diskrete antrale tumorer udvikles ved 4 ugers alderen og vokse hurtigt, indtil cirka 12 uger. De rekapitulere de udviklingsmæssige karakteristika tarm-typen gastrisk adenocarcinom, inklusive submukøse invasion, men ikke metastasere [24]. Dyrene blev anbragt i en SPF facilitet på Murdoch Children Research Institute og bekræftet at være fri for

Helicobacter pylori

. Tre grupper af mus blev vurderet for tumorudvikling: 1) 8 uger gamle gp130

757F /F mus, der modtog ingen behandling (n = 10); 2) gp130

757F /F mus, der modtog WP1066 fra 8 til 10 uger gamle (n = 10); og 3) gp130

757F /F mus, som modtog DMSO-vehikel fra 8 til 10 uger gamle (n = 8). Forud for eksperimentering alle dyr blev vurderet for velvære, vejet og behandling mængder beregnet i overensstemmelse hermed. Kontroldyr modtog ækvivalente volumener af DMSO-vehikel til WP1066-behandlede dyr. Mus modtog 2 indledende intraperitoneal injektioner af WP1066 ved 10 mg /kg hver 48 timer at akklimatisere dem til effekten af ​​behandling, modtog derefter 5 injektioner af WP1066 ved 20 mg /kg hver 48. time for at fuldføre de 2 ugers behandlingen. Intraperitoneal injektionssteder blev vekslede gennem fire kvadranter af abdomen hos mus. Ved afslutningen af ​​forsøget blev mus aflivet, og maver resektion for fotografering og væv kollektion.

makroskopiske og histologiske Assessment

Maver blev hurtigt dissekeret langs mindre krumning, pinned ud, fotograferet og fikseret i 4% buffered paraformaldehyd før behandling. Paraffinsnit (4 um) blev farvet med hæmatoxylin og eosin (H Kvantificering

immunhistokemisk analyse blev udført med antistoffer for Ki-67 (Pharmingen # 550.609) og aktiveret caspase 3 (Cell signaleringsteknologi # 9961). Antigen genfinding blev udført ved kogning sektioner i 30 minutter i 10 mM citronsyre (pH 6,0). Farvning blev udført med passende artsspecifikke biotinylerede sekundære antistoffer (Dako, Danmark), avidin og biotinyleret peberrodsperoxidase makromolekylære kompleks (Vector Laboratories, Burlingame, CA), 3,3′-diaminobenzidin (Sigma, St. Louis, MI) og modfarvet med hæmatoxylin. For Ki-67 kvantificering, en blindet observatør tælles antal farvede celler pr kirtel i flere sektioner per dyr ved hjælp ImageJ som før. Dataene blev udtrykt som antallet Ki-67 positive celler pr kirtel. For aktiveret caspase 3 kvantificering, en blindet observatør talte antallet af farvede celler pr område af slimhinden i 4 tilfældige områder af godt orienteret antrum per dyr under anvendelse ImageJ som før. Dataene blev udtrykt som det antal aktiverede caspase 3 positive celler pr areal af slimhinde

Semi-kvantitativ Morfometrisk Analyse af Inflammation

Inflammation blev vurderet ved hjælp af mikroskopi i et blindet mode på H . E-farvet sektioner. Antrale tumorvæv blev analyseret og mindst 3 strips per dyr (n = 7) blev givet en semikvantitativ score efter graden af ​​inflammatoriske celler fra minimum = 0 til maksimum = 3. Lymphoplasmocytic og polymorfkernede infiltrat blev vurderet uafhængigt. De gennemsnitlige værdier blev derefter sammenlignet til statistisk analyse.

Real-Time (Q) -PCR Analyse

RNA blev ekstraheret med TRIzol reagens (Life Technologies, VIC, Australien) ifølge producentens anvisninger. Totalt RNA (3 ug) blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse Moloney leukæmivirus revers transkriptase (Promega, Madison, WI) primet med 0,3 ug oligo (dT). Q-PCR-primere blev udformet under anvendelse PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems) (tabel 1). SYBR grøn kemi (Applied Biosystems) blev anvendt med L32 som normalizer. PCR-betingelserne var 95 ° C i 10 minutter, derefter 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 15 sekunder; reaktionerne blev kørt på et Applied Biosystems AB7500 RT PCR-maskine. Resultaterne blev analyseret ved hjælp af sekvens detektor software, og relative fold forskelle blev bestemt ved anvendelse af ΔΔCt metoden som beskrevet af producenten.

Statistisk analyse

Data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien. Værdier opnået fra kvantitativ analyse af genekspression eller antallet af farvede celler blev sammenlignet mellem prøverne ved ANOVA, og hvor en statistisk signifikant forskel blev fundet enkelte grupper blev yderligere analyseret med den passende parametriske eller ikke-parametrisk statistik ved hjælp af Sigmastat statistiske pakke. Statistisk signifikans blev defineret som p ≤ 0,05.

Resultater

WP1066 Hurtigt Undertrykker Phosphoryleret Y (705) STAT3 og inducerer Phosphorylering af ERK1 /2 i AGS celler

JAK- STAT pathway og ERK1 /2-vejen er de to store signaltransduktionsveje nedstrøms for gp130. Disse to veje har gensidige og inverse regulatoriske virkninger på hinanden, bedst ved den negative regulering af pSTAT3 efter ERK1 /2-aktivering [47]. Salg

WP1066 dosis-respons eksperimenter blev udført ved behandling AGS celler med 0 , 1, 2 eller 5 uM WP1066 i 60 minutter og måling phosphorylering af JAK2, STAT3, ERK1 /2 og SHP-2. Som forventet blev pJAK2 stærkt hæmmet af WP1066 på alle testede koncentrationer og ved 80% ved 5 uM. 5 uM WP1066 gav også maksimal inhibering af pSTAT3 og gensidig aktivering af pErk1 /2 (fig. 1A) med en reduktion i den samlede STAT3 ved 5 uM, eller højere koncentrationer (data ikke vist). Sammenfaldende med stigningen i pERK, pSHP2 aktivering var dosisafhængig forbedret efter WP1066 administration (fig. 1A).

A. Dosis-respons: AGS-celler blev behandlet med WP1066 ved 0, 1, 2 og 5 uM i 60 minutter og ekstrakter immunoblottedes med antistoffer specifikke for (i) pJAK2 og JAK2; (Ii) pSTAT3 og STAT3; (Iii) pErk1 /2 og ERK1 /2; (Iv) pSHP2 og SHP2. Dataene blev også udtrykt som et forhold mellem det phosphorylerede til total proteinprodukt i hvert tilfælde. Resultaterne af 3 eksperimenter er vist som OD-forhold ± standardafvigelse (SE). Statistisk signifikans for hver behandling i forhold til 0 pM WP1066 vises, hvis p 0,05. B. Time-kursus: AGS celler blev behandlet som i fig. 1A men med 5 uM WP1066 i 0, 15, 30, 60 og 180 min. Data blev behandlet som for fig. 1A.

For tiden-kursus studier blev AGS celler behandlet for 0-360 min med 5 uM WP1066 og fosforylering af JAK2, STAT3, ERK1 /2 og SHP-2 blev analyseret ved Western blotting ( fig. 1B). WP1066 behandling resulterede i en hurtig hæmning af pJAK2, med en 75% nedgang i 30 minutter og højst 90% fald i 60 min. Derefter cellerne udvindes og returneres til basal JAK2 phosphorylering af 360 min. Mønsteret af nedsat STAT3-aktivering afspejlede af JAK2 phosphorylering. I modsætning hertil blev ERK1 /2 fosforylering markant forøget som respons på WP1066 behandling, med en stigning på 250% i 15 min, og en maksimal 460% stigning med 60 minutter, før han vendte tilbage til basale niveauer af 360 min. SHP2- aktivering tæt fulgt ændringer i ERK udtryk med maksimal induktion på 60 min.

WP1066 Forhindrer AGS Vækst gennem Undertrykkelse af spredning og induktion af apoptose

Aktiveret STAT3 er en etableret drivkraft for human mavekræft celle vækst og proliferation [5], og langvarig aktivering af ERK1 /2 inducerer apoptose af gastriske epitelceller [25]. Efter at have vist, at WP1066 regulerer STAT3 og ERK1 /2 signalering i en gensidig måde, vi testede, om det også kan forstyrre cellevækst og inducere apoptose af AGS celler.

Behandling af AGS celler med 5 pM WP1066 (Fig. 2A ) resulterede i en væsentlig reduktion i celle nummer i forhold til DMSO kontroller (DMSO; 100% ± 3,14 vs. WP1066, 36,02% ± 3,18, p 0,05). For at bestemme om denne reduktion i celleantal skyldtes ændret celleproliferation eller apoptose, eller en kombination af begge, blev CFSE og Annexin V-farvning udført på behandlede celler. AGS celler behandlet med WP1066 blev mere intenst mærket med CFSE end dem behandlet med DMSO, tegn på reduceret antal celledelinger og derfor proliferation (Fig. 2B). Derudover blev en større del af AGS celler behandlet med WP1066 mærket med Annexin V (figur 2C) sammenlignet med celler behandlet med DMSO, hvilket viser, at WP1066 også apoptose i AGS celler (WP1066 1.3 fold stigning, p = 0,049).

spredning: A. AGS celler blev behandlet med WP1066 ved 5 uM i 18 timer, farvet med trypanblåt og levedygtige celler tælles. Data er udtrykt som procentdelen af ​​levedygtige celler sammenlignet med vehikel alene. N = 3, gennemsnit ± SE. B. CFSE sporing blev anvendt til at måle ændringer i AGS celleproliferation efter behandling med WP 1066. De rå fluorescensdata indsamlet er vist sammenlignet med DMSO kontrol for et repræsentativt eksperiment. Apoptose: C. AGS celler behandlet i 24 timer med DMSO (metode kontrol), WP1066 (5 uM) eller etoposid (200 uM; positiv kontrol) og vedhæftende celler blev farvet med Annexin V derefter tælles manuelt. Data er udtrykt som fold ændring i forhold til DMSO-vehikel fra et repræsentativt eksperiment. * P = 0,047.

WP1066 Blocks Gastrisk Tumor Vækst i gp130

757FF Mus ved Undertrykkelse af Tumor Cell Proliferation og Styrkelse af apoptose

gp130

757FF mus udvikler distal mavetumorer kendetegnet ved forhøjede gastrisk IL-11 drevet STAT3-aktivering [12], [13]. Da pJAK2 og p-STAT3 blokeres af WP1066

in vitro

, vi testede, om WP1066 også ville blokere gastrisk tumor udvikling

in vivo

. Behandling af gp130

757FF mus 3 gange om ugen i 2 uger med 10-20 mg /kg WP1066 væsentligt reduceret gastrisk tumor vækst med 47% fra 42.11 ± 3.21 mm

2 til 22.36 ± 3.64 mm

2 ( p. 0,05) (fig 3A-D). DMSO behandlede tumorer var ikke anderledes end tumorer observeret i 8 uger gamle mus, den alder, hvor WP1066 behandling påbegyndes, bekræfter, at gastrisk tumorvækst er relativt stabilt fra 8-10 uger [27], og at WP1066 behandling faktisk forårsager tumorregression stedet stasis (fig. 3A-D).

gp130

757FF mus (8 uger gamle) blev behandlet ip med 10 mg /kg af WP1066 eller DMSO to gange med et mellemrum på én dag mellem doser, efterfulgt af doser på 20 mg /kg hver 2 dage i 2 uger. Antrale tumorer i 8 uger ubehandlede mus (A) og 10 ugers DMSO-behandlede køretøjer kontroller (B) var ikke anderledes i det gennemsnitlige område, men WP1066 behandling resulterede i -50% mindre tumorer (C). Dette blev bekræftet ved kvantitativ morfometri (D), hvor antrale tumorer var signifikant mindre i WP1066 mus sammenlignet med 10 W.O. DMSO kontroller og 8 W.O. ubehandlede mus (n = 7-10; p 0,05). Virkningen af ​​WP1066 på celleproliferation blev vurderet ved farvning sektioner med et antistof for Ki-67. Der var et signifikant fald i antallet af Ki-67 positive celler pr kirtel i WP1066 behandlede mus (F) sammenlignet med kontroller (E) og kvantificeres visuelt (G). Antallet af apoptotiske celler kvantificeret efter caspase 3 farvning af antrale sektioner af en DMSO-kontrol (H) og WP1066 (I) mus, og blev kvantificeret ved at tælle farvede celler /mm

2 i maveslimhinden (J).

for at afgøre, om spredning blev ændret i gastriske tumorer, blev Ki-67 positive celler /kirtel kvantificeret i den behandlede kohorte. WP1066 behandling reducerede signifikant gastrisk epitelcelleproliferation (DMSO 62 ± 7,7 vs. WP1066 41,6 ± 6,5 Ki-67 farvede celler /kirtel, p 0,05;. Figur 3E-G) viser, at WP1066 kan hæmme tumorvækst ved at hæmme celledeling. For at vurdere virkningerne af WP1066 på tumorcelle apoptose blev snit fra WP1066 eller DMSO-behandlede kohorter farvet med et antistof mod spaltede caspase 3, en markør for apoptotisk celledød (fig. 3H, I). Der var signifikant flere apoptotiske profiler i WP1066-behandlede tumorer end kontroller, der viser en klar pro-apoptotiske effekt af WP1066 (WP1066 25,25 ± 5,32 vs DMSO 2,65 ± 0,76 farvede celler /mm

2 slimhinde, p 0,05;. Fig 3J ).

WP1066 Specielt Mål JAK2 og STAT3 phosphorylering at undertrykke Gastrisk tumorudvikling i gp130

757FF mus

Fordi gp130

757FF mus udvikler tumorer som reaktion på konstitutiv gp130 aktivering [20] , testede vi, om WP1066 undertrykt nedstrøms signalveje

in vivo.

WP1066 behandling i 2 uger førte til en nedgang på 25% i den relative mængde af samlede STAT3 i antrale slimhinde sammenlignet med DMSO behandlede grupper (fig. 4A) . Mængden af ​​total JAK2, AKT og ERK1 /2 blev ikke ændret af WP1066 behandling. Dette antyder, at kronisk behandling af gp130

757FF mus med WP1066 undertrykker ekspression af STAT3.

gp130

757FF mus (8 uger gamle) blev behandlet som i fig. 3 og antrale ekstrakter kvantificeret ved Western blotting for total JAK2, STAT3, ERK1 /2 og AKT (A) og pJAK2, pSTAT3, pErk1 /2 og Pakt (B). Membraner blev samtidigt hybridiseret med en GAPDH antistof som en loading kontrol. Intensiteten af ​​signalet blev kvantificeret ved densitometri og udtrykt som en procentdel af signalet i forhold til kontrollerne standardiseret til intensiteten af ​​GAPDH signal. n = 6-10; * Signifikant (p 0,05)

Immunoblotanalyse af signaleringsaktivering viste en signifikant reduktion i pJAK2 (80,12% ± 5,70 af DMSO kontrol), pY705 STAT3 (26,84% ± 7,2 af DMSO kontrol;. Fig . 4B) og pErk1 /2 (72,66% ± 5.23.of DMSO kontrol. figur 4B). AKT fosforylering blev ikke ændret af WP1066 behandling. Reduceret aktivering af JAK2 og STAT3 er i overensstemmelse med

in vitro

data og kendte virkninger af WP1066.

WP1066 Undertrykt det inflammatoriske respons i Antral mucosa af gp130

757FF Mus

Da en kronisk inflammatorisk respons i maven er afgørende for tumorudvikling [27], testede vi, om en del af virkningsmåden for WP1066 er at undertrykke STAT3-medieret inflammatorisk respons, der normalt bidrager til tumorudvikling. Histologisk analyse viste, at polymorfonuklear infiltration i antrum af WP1066 behandlede mus var signifikant mindre end i kontrolmusene (Fig 5A;. DMSO 2,45 ± 0,24 vs WP1066 1,46 ± 0,22, p 0,05), mens lymphoplasmocytic infiltrat var ikke forskellig mellem de to grupper (figur 5B;. DMSO 1,73 ± 0,16 vs WP1066 1,32 ± 0,20, p 0,05).

gp130

757FF mus (8 uger gamle) behandles som for fig. 3, havde antral mavevæv udtaget til histologi og pro-inflammatorisk genekspression ved Q-PCR efter mRNA ekstraktion. Behandling af gp130

757FF mus med WP1066 forårsagede en signifikant reduktion (p 0,05) i polymorfkernede infiltrat (A) i antrale maven, men lymphoplaysmocytic infiltrat var uændret (B). Genekspression i forhold til husholdersken GAPDH for IL-6 (C), IL-11 (D), IL-1 α (E), IL-1β (F) og COX-2 (G), blev kvantificeret ved den ΔΔCT metode . Alle n = 8; * P. 0,05 sammenlignet med DMSO kontroller

Da gastrisk betændelse typisk formidles af et lille antal vigtige pro-inflammatoriske cytokiner og enzymer, vi målte udtryk for en udvalgt gruppe af disse ved Q PCR i DMSO og WP1066-behandlede maver. Ekspression af alle proinflammatoriske mediatorer med undtagelse af IFNy, TNFa og iNOS blev væsentligt inhiberet af WP1066 behandling som følger; IL-6 (. Figur 5C; 6,0 ± 2,6 gange), IL-11 (figur 5D;. 8,7 ± 3,4 gange), IL-1α (figur 5E;. 10,9 ± 4,3) fold), IL-1β (Fig 5F. ; 3 ± 0,9 gange) og COX2 (figur 5G;. 2,94 ± 1,05). Derfor WP1066 inhibering af STAT3 aktivitet og tumorprogression var delvist skyldes reduceret polymophonuclear infiltration og reducerede STAT3-afhængig transskription af pro-inflammatorisk IL-6, IL-11, IL-1a, IL-1p og COX2 gener.

WP1066 inhiberede ekspression af Amphiregulin i Antral mucosa af gp130

757FF Mus Salg

virkningen af ​​WP1066 behandling på ekspressionen af ​​vækstfaktor-ligander, der vides at spille en rolle i væksten og differentieringen af ​​maven og i udviklingen af ​​gp130

757FF tumorer blev også vurderet. WP1066 inhiberede ekspressionen af ​​amphiregulin (1,85 ± 0,60 gange, s 0,05), men ikke HB-EGF (fig. 6) i den antrale slimhinde af behandlede mus. Desuden viste maven proliferative ligand og STAT3-reguleret gen Reg1 en stærk hæmmende tendens efter WP1066 behandling sammenlignet med DMSO kontrol antrum (figur 6;. P = 0,069).

gp130

757FF mus ( 8 uger gamle) blev behandlet som for fig. 5. mRNA for Reg1, amphiregulin og HB-EGF blev analyseret ved Q-PCR-analyse og kvantificeres ved den ΔΔCT metode. EGFR-ligander var forskelligt reguleret, således at amphiregulin mRNA blev signifikant reduceret i de WP1066 behandlede mus i forhold til kontroller (p 0,05), mens HB-EGF var uændret. Den ikke-EGFR ligand Regi viste en stærk tendens til nedsat udtryk (p = 0,069). Alle n = 8; * Statistisk forskellige (p ≤ 0,05).

Diskussion

I denne undersøgelse demonstrerer vi, at WP1066 dosisafhængigt hæmmer JAK2 /STAT3 signalvejen i human gastrisk cancer (AGS) celler , med en deraf følgende reduktion på 60% i celledeling, og en mindre stigning i apoptose. Mekanismen for dette skyldes sandsynligvis den dobbelte hæmning af phosphorylerede former af JAK2 og STAT3 dermed mindske STAT3 transkriptionel aktivitet, som det er blevet vist for adskillige cancercellelinier, herunder gliom [17], [28], [29], myeloid leukæmi [ ,,,0],30], og melanom [20]. På den anden side, WP1066 ansøgning resulterede i en gensidig forøgelse ERK1 /2-aktivering sammenfaldende med øget pSHP2, den phosphatase ansvarligt for aktivering af ras /MAP-kinase signalering pathway. En lignende observation med hensyn til ERK-aktivering er foretaget for andre kræft cellelinjer afledt renal karcinom [18], og gliom [28]. Derfor cross-regulering af STAT3 og ERK-medieret signalering nedstrøms for IL-6 familien cytokiner tilsyneladende forekommer almindeligt i en serier af væv og cellelinier [31].

WP1066 var også effektivt, når det gives

in vivo

, hvor det blokerede STAT3-aktivering (75%) i gp130

757FF mus antrale tumorer, og også reduceret samlet STAT3-protein, hvilket antyder, at det kan nedsætte ekspression af

Stat3

gen i maver af behandlede mus. Dette understøttes af, at der findes konsensus sites for aktiveret STAT3 bindende for

Stat3

promotor, med aktivering af

Stat3

genet som påvist ved hjælp af mutant

Stat3

promotor-reporter konstruktioner og EMSA [48] eller chip-seq [49], og foreslår, at WP1066 kan hæmme autokrine aktivering af STAT3 efter hæmning af JAK2 /STAT3 fosforylering.

som forventet, pJAK2 niveauer blev også reduceret ved tilstedeværelse af

H.