PLoS ONE: FAK Sletning Fremmer p53-medieret induktion af p21, DNA-Skader Responses og Radio-Resistance i fremskredne skællede Cancer Cells

Abstrakt

Focal vedhæftning kinase (FAK) er en cytoplasmatisk tyrosinkinase der er forhøjet i en række humane cancere. Mens FAK er impliceret i mange cellulære processer, som forstyrret i cancer, herunder proliferation, actin og adhæsion dynamik, polarisering og invasion, er der kun nogle begrænset information om den rolle, FAK i stråling overlevelse. Vi har vurderet, om FAK er en generel radio-sensibiliserende target, som det er blevet foreslået af tidligere rapporter. Vi anvendte en ren genetisk system, hvor FAK blev slettet fra muse pladecellecarcinom (SCC) -celler (FAK – /-), og rekonstitueres med eksogent FAK vildtype (wt). Overraskende blev fraværet af FAK forbundet med øget radio-resistens i avancerede SCC-celler. FAK re-ekspression inhiberes p53-medieret transkriptionel opregulering af p21, og en undergruppe af andre p53 target gener involveret i DNA-reparation, efter behandling med ioniserende stråling. Endvidere p21 depletion fremmes radio-sensibilisering, hvilket indebærer, at FAK-medieret inhibering af p21 induktion er ansvarlig for den relative radio-følsomhed FAK-dygtige SCC-celler. Vores arbejde bidrager til en voksende mængde af beviser for, at der er et tæt praktisk samarbejde mellem integrin /FAK signalering og p53 /p21 vej, men viser, at FAK rolle i overlevelse efter stress er kontekstafhængig, i hvert fald i kræftceller. Vi foreslår, at der bør være forsigtig, når man overvejer at hæmme FAK i kombination med strålebehandling, da dette kan ikke altid være klinisk fordelagtig

Henvisning:. Graham K, Moran-Jones K, Sansom OJ, Brunton VG, Frame MC ( 2011) FAK Sletning Fremmer p53-medieret Induktion af p21, DNA-Skader Responses og Radio-Modstand i fremskredne skællede kræftceller. PLoS ONE 6 (12): e27806. doi: 10,1371 /journal.pone.0027806

Redaktør: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasilien

Modtaget: 27. juni, 2011; Accepteret: 25 Oktober 2011; Udgivet: December 14, 2011

Copyright: © 2011 Graham et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Cancer Research UK Program Grant (C157 /A9148). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Strålebehandling er en grundpille i kræftbehandling i flere sygdomstilstande sammenhænge, ​​men behandlingen er ikke altid helbredende. En stor indsats er rettet ikke blot at forbedre leveringen af ​​strålebehandling ved stadig mere avancerede rumlige og dosimetriske metoder, og også for at identificere kombination strategier til at forbedre stråling svar. Med hensyn til sidstnævnte, ioniserende stråling kan fremme aktivering af receptor og non-receptor-tyrosinkinaser (TK), og modulation af cytobeskyttende påvirkninger, såsom øget DNA-reparation, proliferation og reduceret apoptose [1], [2], [3] [4], [5], [6], [7]. Da disse reaktioner bidrager til cellulær radio-modstand, hvilket naturligvis kan begrænse effektiviteten af ​​strålebehandling i kræftbehandling, forståelse bidrag TK kan give nye molekylære mål for radio-sensibilisering, og potentielt forbedre tumor respons. Et eksempel er epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), som er det nuværende mest omfattende undersøgt TK i denne sammenhæng. Stærk prækliniske dokumentation indebærer en kapacitet på EGFR hæmning at forbedre anti-tumor effekt af ioniserende stråling, og det har oversat til kliniske omgivelser baseret på resultater fra et fase III forsøg i hoved- og halscancer [8], [9]. Dette viser betydningen af ​​robuste interventionsstrategier at fastslå, om særlige TK bidrager til cellulære radio-følsomhed, eller radio-resistens.

I modsætning til den ny dokumentation for EGFR, rolle andre TKS især ikke- receptor TKS er mindre klar. Focal Adhesion Kinase (FAK) er placeret på steder med integrin vedhæftning fra hvor det transducerer signaler i celler, der styrer flere cancerassocierede egenskaber, herunder adhæsion og actin dynamik, migration, invasion, angiogenese, beskyttelse af celler fra suspension-induceret celledød ( undertiden betegnes anoikis) og spredning i 3-dimensioner [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. FAK er ofte overudtrykkes i human cancer [18], [19], [20], [21], og spiller en rolle i tumorigenese, som påvist i flere vævstyper

in vivo

[22], [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Vi har tidligere vist, at FAK deletion inhiberer muse hudkræft udvikling og malign progression, og at FAK deletion fremmer apoptotisk død normal hud keratinocytter i kultur [25]. På det seneste har vi også gjort brug af K14-Cre-ER

T2 /f

lox

-FAK muse systemet at udlede skællede cancerceller (SCC) fra kemisk inducerede tumorer [29], [ ,,,0],30]. FAK sletning forårsager flere defekter, herunder forringet polarisering og reaktioner på retningsbestemt tidskoder, såsom kemotaktisk invasion, samt svækket vækst i 3 dimensioner (selvom vækst på 2-D plast er upåvirket) og forsinket vækst som xenografter

in vivo

[29], [30].

FAK medierede pro-overlevelse funktioner menes at spille en vigtig rolle i cancer celle overlevelse, og at dette sandsynligvis involverer p53 pathway [31]. Desuden FAK-promotoren indeholder p53 responsive elementer og kan nedreguleres ved DNA-skader i en p53-afhængig måde, mens FAK ekspression korrelerer med mutant p53 i brystcancer [32], [33], [34]. Der er også

in vitro

in vivo

dokumentation for, at FAK knock-down kan sensibilisere celler for cytotoksisk kemoterapi [2], [35], [36], [37], [ ,,,0],38], [39], [40], [41]. Derimod er der relativt få undersøgelser om betydningen af ​​FAK i stråling følsomhed. FAK fosforylering induceres følgende eksponering for ioniserende stråling

in vitro

[42], selv om dette kan kun have været en forbigående stress respons som FAK rolle blev ikke udforske. Men der er én rapport, at siRNA-medieret FAK knock-down fremmer radio-overfølsomhed i bugspytkirtelkræftceller [43], selv om den underliggende mekanisme er uklar. Derudover overekspression af FAK i HL-60-celler bibringer markant modstand mod en række apoptotiske stimuli, herunder ioniserende stråling [44], alt tyder på, at inhibering af signalering via FAK vil kunne fremme radio-følsomhed. Her har vi brugt en ren genetisk sletning /rekonstituering system til at teste FAK rolle i cellulær stråling respons

in vitro

in vivo

, specielt i FAK-mangelfulde SCC-celler (og deres FAK-udtrykkende modparter), og begynder at dissekere den underliggende mekanisme.

Resultater

Vi afledte SCC celler fra kemisk inducerede planocellulært kræft hos mus, der udtrykte en

floxet

form af ATP-bindende kodende exon i

fak

under kontrol af hud-specifik (K14)

Cre

rekombinase fusioneret til østrogen-receptor [25]. Udskæring af

floxede

–

fak

ved en enkelt behandling med 4-hydroxy-tamoxifen (4-OHT) resulterede i fuldstændig FAK proteinmangel [29], [30] (se også fig. 1C og 2B), som vi kunne vende ved re-udtrykkende vægt- FAK, tillader os at undersøge, hvordan kræftceller håndtere alvorlig forstyrrelse af integrin /FAK-signalvejen. For at vurdere radio-følsomhed, blev en begrænsende fortynding klongenicitetsassayet udført sammenligne FAK – /- med FAK wt celler ved stigende doser af stråling op til 10 Gy. Det fremgik, at den fuldstændige mangel på FAK i disse celler var forbundet med øget radio-resistens

in vitro

(fig. 1A). En statistisk signifikant forskel i overlevende fraktion blev set ved doser på 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy og 10 Gy (p-værdier på 0,0136, 0,0097, 0,0045, og 0,0036 henholdsvis analyseret af elevens uparrede t-test, n = 9).

(a) Subkonfluente populationer af FAK – /- og FAK wt celler blev trypsineret og fortyndet i vækstmedium til en slutkoncentration, der ville tillade enkelt koloni vækst. 100 pi af denne suspension blev tilsat til hver brønd i en plade med 96 brønde. Efter inkubation i 6 timer for at tillade cellevedhæftning pladerne blev bestrålet med 0, 2, 4, 6, 8 eller 10 Gy. Cellerne blev analyseret i tre eksemplarer for hver strålingsdosis. Efter 7 dage blev antallet af kolonier per plade talt, og overlevende fraktion beregnes. Den grafiske repræsentation vist repræsenterer middelværdien ± SEM fra tre separate forsøg. Overlevende fraktioner ved hver dosis af stråling blev sammenlignet med un-bestrålede celler ved studerendes uparrede t-test, n = 9. (B) 2 × 10

5 FAK – /- og FAK wt celler blev injiceret subkutant i den højre flanke af kvindelige nøgne mus. Xenografter fik lov til at nå ca. 150 mm

3. Dyrene blev derefter bestrålet med 5 Gy bestråling af hele kroppen eller mock bestrålet. Efter 7 dage blev xenotransplantater målt og musene blev aflivet. De gennemsnitlige xenograft mængder ± SEM før stråling (øverste paneler) og efter stråling (lavere paneler) er vist. Statistisk analyse af mock bestrålet versus bestrålede volumen på 7 dage blev vurderet ved studerendes uparrede t-test, * betegner p 0,05, n = 10. (C) Proteinekstrakter blev fremstillet fra xenotransplantater, adskilt ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose og blottet med anti-FAK (øvre) og anti-β-actin (lavere) antistoffer. En prøve af fem forskellige ekstrakter fra hver gruppe er vist. En positiv kontrol (FAK vægt- celleekstrakt) blev tilsat til den endelige bane af FAK – /-. Xenograft prøver

(A) FAK – /- og FAK wt celler blev bestrålet med 5 Gy på 70% sammenløb og lysater fremstillet på de angivne tidspunkter. Immunoblotting blev derefter udført med anti-p21 (øvre panel), og anti-β-actin (nedre panel). (B) Protein ekstrakter blev fremstillet ud fra subkonfluerende FAK – /- og FAK vægt- cellepopulationer, adskilt ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, og blottet med anti-FAK (øvre panel), anti-p21 (midterste panel) og anti β-actin (nedre panel) antistoffer. (C) RNA blev ekstraheret fra subkonfluerende FAK – /- og FAK wt celler, PCR udført og analyserede produkt. p-actin loading er også vist (nedre panel). (D) Proteinekstrakter blev fremstillet fra FAK – /- og FAK vægt- cellepopulationer på niveauet for konfluens angivet. Immunoblotting blev derefter udført med anti-p21 (øvre panel) og anti-β-actin (nedre panel) antistoffer.

Vi har også testet, om FAK påvirket radio-følsomhed

in vivo

ved at sammenligne FAK – /- og FAK vægt SCC xenografter. 2 × 10

5-celler blev injiceret subkutant i den højre flanke af kvindelige nøgne mus, og dyrene blev enten bestrålet med 5 Gy (i form af bestråling af hele kroppen) eller mock bestrålet når xenotransplantater nåede ca. 150 mm

3. Denne størrelse blev valgt som FAK – /- tumorer havde overvundet en indledende forsinkelse i deres vækst

in vivo

, og deres spredning sats på dette punkt ikke signifikant forskellig fra deres FAK wt modstykker. Tidligere undersøgelser viste, at CD1 stammen af ​​nøgne mus kunne tåle 5 Gy kroppens samlede dosis i 10-14 dage. Efter 7 dage blev xenotransplantater målt, og dyrene blev aflivet. Tumor mængder blev beregnet før og efter 5 Gy bestråling eller mock bestråling, og analyseret ved studerendes uparrede t-test. En statistisk signifikant reduktion i tumorvolumen blev observeret i de bestrålede FAK wt xenotransplantater sammenlignet med mock-bestrålede kontroller (p = 0,0030, n = 10), men dette blev ikke gentages i FAK – /- xenotransplantater (p = 0,3300, n = 10) (fig. 1B). Proteinekstrakter blev fremstillet ud fra 5 mus i hver gruppe og underkastet western blotting for at bekræfte niveauet af FAK-ekspression i FAK – /- og FAK wt tumorer (. Figur 1C). De lave niveauer af FAK stede fra FAK – /- tumorer udledt materiale er sandsynligt fra den lille mængde stromale eller immun infiltrat (Fig 1C.)

SCC-celler vi her anvendte udtrykte vildtype p53 (bekræftet. ved sekventering (ikke vist)), og vi identificeret en FAK-afhængig forskel i induktion af p53 målgenet, p21, efter bestråling (fig. 2, jf også senere). Specifikt induktion af p21 sås efter 2 timer efter behandling FAK – /- celler med 5 Gy bestråling; Derimod blev p21 ikke induceret når FAK var til stede (fig. 2A). Interessant basale niveauer af p21-protein og mRNA i sub-sammenflydende populationer af begge FAK – /- og FAK wt celler var ens (figur 2B og 2C, henholdsvis.), Mens p21 niveauer blev forhøjet i begge cellelinier med stigende konfluens (Fig . 2D). Dette var i overensstemmelse med den bredt accepteret rolle for p21 i kontakt-induceret cellecyklusstandsning (fig. 2D), og viste, at en anden stimulus var i stand til at øge p21 niveauer uanset FAK status. For at sikre uoverensstemmelsen i induktion af p21 efter udsættelse for ioniserende stråling var ikke relateret til forskelle i celletæthed, omhu i alle forsøg at sikre, at cellerne blev bestrålet på sammenlignelige sammenløb, typisk 70%.

FAK -dependence af p21 forordning blev gengivet

in vivo

. Specifikt blev nøgne mus injiceret subkutant med 2,5 x 10

5 FAK – /- eller FAK wt celler blev xenotransplantater lov til at etablere, og dyrene blev derefter bestrålet med 5 Gy bestråling når tumorerne nåede ca. 500 mm

3 i volumen. Mus blev aflivet ved 0, 2 timer, 6 timer og 24 timer efter bestråling (n = 3 per gruppe) og p21-niveauer blev bedømt ved både western blotting af tumorlysater og immunhistokemi (IHC) farvning af paraffin indlejret væv. De FAK – /- xenotransplantater udviste en stigning i p21 proteinniveauer så tidligt som 2 timer efter bestråling (fig 3A, venstre paneler.); p21 niveauer dukkede maksimal omkring dette tidspunkt. Stigningen i p21 var også synligt ved IHC (fig. 3A, højre paneler). Mean p21 positivitet (baseret på scoring af 20 felter) blev analyseret på tværs af alle tidspunkter, og dette viste en signifikant forskel i p21-niveauer i tumorer i bestrålede

versus

un-bestrålede dyr (Kruskal-Wallis, p = 0,038, n = 3). Endvidere individuel sammenligning af de separate tidspunkter illustrerede en statistisk signifikant stigning i p21 scoring i forhold til baseline niveau (Mann Whitney, p = 0,0404, n = 3). I modsætning hertil har de FAK WT xenografter ikke påvise nogen konsekvent stigning i p21 niveauet ved nogen af ​​de undersøgte tidspunkter. Western blotting af FAK WT-udtrykkende tumorlysater bekræftede tilstedeværelsen af ​​FAK, men der var ingen mærkbar stigning i p21 proteinniveauer (fig. 3B). Yderligere analyse af IHC (fig. 3B, højre paneler) bekræftede var der ingen signifikant stigning i p21-ekspression på 2 timer (p = 0,6625), 6 timer (p = 0,6625), eller 24 timer (p = 0,3827) (Mann Whitney, . n = 3), i sammenligning med kontrolgrupperne

(A) FAK – /- SCC celler eller (B) FAK wt SCC-celler blev injiceret subkutant i den højre flanke af kvindelige nøgne mus. Når xenotransplantater nåede ca. 500 mm

3, mus blev bestrålet med 5 Gy og aflivet ved 0, 2 timer, 6 timer og 24 timer (n = 3 pr gruppe). Halvdelen af ​​xenotransplantatet blev fikseret i formalin og derefter indlejret i paraffin, og den anden halvdel blev lynfrosset i flydende nitrogen. Proteinekstrakter blev fremstillet ud fra de frosne snit, adskilt ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, og blottet med anti-FAK (øvre blot-panel), anti-p21 (midterste blot-panel), og anti-β-actin (nedre blot-panel ). De paraffinindlejrede snit blev farvet med p21 og p21-positive celler visualiseret ved IHC (højre paneler). Repræsentative lyse felt billeder af p21 farvede væv ved 0, 2 timer, 6 timer og 24 timer efter stråling er vist (skala bar, 0,1 mm).

Vi udvundet RNA fra sub-sammenflydende populationer af FAK – /- og FAK wt celler på forskellige tidspunkter efter 5 Gy bestråling og QRT-PCR blev udført under anvendelse af primere for endogen p21. Der var en bifasisk stigning i p21 mRNA-niveauer, toppede på 2 timer og 6 timer efter bestråling i FAK – /- celler; derimod p21 mRNA niveauer ikke blev induceret i FAK vægt- cellelinien efter bestråling (fig. 4A). RNA blev også ekstraheret fra begge cellelinier 2 timer efter en række strålingsdoser (0, 2, 5, 10, 20, og 30 Gy) og analyseret ved QRT-PCR. Vi fandt, at p21-mRNA-niveauer steg i FAK – /- SCC-celler på en dosis-afhængig måde (området fra 2 Gy til 10 Gy); yderligere dosisøgning resulterede ikke i yderligere forøget p21 mRNA. Dosis-afhængig stigning i p21 transkription var svækket efter re-ekspression af FAK vægt- i FAK-deficient SCC-celler (fig. 4B). I parallelle eksperimenter fandt vi, at øget steady state niveauer af p21-protein var tydelige efter bestråling i forskellige doser i FAK – /- SCC-celler, og at dette var svækket, når FAK ekspression blev gendannet (. Figur 4C, sammenlign venstre og højre paneler) . Til at supplere den genetiske deletion af FAK, anvendte vi også en FAK kinase inhibitor (PF-562.271; [45]) i en dosis på 0,5 um (som er optimal for inhibering af FAK kinase aktivitet i disse celler (ikke vist)) til 2 timer før bestråling og opsamlet proteinlysater til immunoblotting ved 0, 2, 4, og 6 timer efter 5 Gy. p21 niveauer blev synligt forøget med 2 timer efter stråling i 0,5 uM PF-562.271 behandlede FAK wt celler sammenlignet med ubehandlede celler (figur 4D.)

(A) RNA blev ekstraheret fra subkonfluerende FAK -. /- og FAK wt cellepopulationer på forskellige tidspunkter efter 5 Gy bestråling. QRT-PCR-analyse blev derefter udført tre gange. Fold stigning i p21-mRNA-niveauer blev beregnet under anvendelse af ddC (t) metode med β-actin som et loading kontrol. Grafisk repræsentation af kombineret middel ± SEM fra tre forsøg påvises. (B) RNA blev ekstraheret fra sub-sammenflydende FAK – /- og FAK vægt- cellepopulationer 2 timer efter 0, 2, 5, 10, 20, og 30 Gy bestråling. cDNA blev derefter genereret og QRT-PCR for p21 udført som beskrevet ovenfor. (C) Proteinekstrakter blev fremstillet fra FAK – /- og FAK wt cellepopulationer 2,5 timer efter udsættelse for forskellige doser af stråling. Ekstrakterne blev separeret ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, og blottet med anti-p21 (øvre paneler) og anti-β-actin (nedre paneler). (D) FAK wt celler blev inkuberet i 2 timer med enten FAK inhibitoren PF-562.271 ved 0,5 uM eller 0,1% DMSO alene, derefter bestrålet med 5 Gy. Proteinekstrakter blev fremstillet ved 0, 2, 4 og 6 timer og immunblots probet med anti-p21 (øvre paneler), og anti-β-actin (nedre paneler). Repræsentative immunblots fra 0,1% DMSO (til venstre) og 0,5 uM stof behandlet (til højre) cellepopulationer vises.

Som forventet p21 steady state niveauer i SCC cellerne var i det mindste delvist afhængig af p53, og stråleinduceret p21 i SCC-celler blev inhiberet af knock-down af p53 ved hjælp siRNA (fig. 5A-C). Men vi bemærkede også, at p53 induktion efter bestråling ikke var særlig stærk og var ens i begge FAK – /- og FAK vægt- SCC-celler (figur 5D.), Hvilket viser, at tilstedeværelsen af ​​FAK førte til nogle afkobling af p53 og p21 induktion og følsomhed over for bestråling i disse cancerceller. Densitometri blev udført for at kvantificere fold ændringer i p21 og p53 proteinniveauer efter bestråling af FAK-dygtige og FAK-deficient SCC-celler (Figur S1). Disse resultater indebærer, at i det væsentlige forøget transkription og ekspression af p21-protein forekommer i FAK – /- celler efter klinisk relevante doser af ioniserende stråling, og at denne reaktion er svagt ved tilstedeværelse af FAK. Således FAK funktioner i disse avancerede cancerceller undertrykke p53-afhængig transskription af p21 efter bestråling. Dette er ikke synligt knyttet til differential induktion af standsning af cellecyklus (figur S3 (bestemt som beskrevet i metode-S1)) eller apoptose, som er vanskelig at detektere efter SCC celle bestråling som bedømt ved manglen på sub-G1 DNA-indhold (ikke vist) . Dette er til trods differentiel regulering af ekspression af p53 målgenet PUMA (fig S4), der kan være forbundet med apoptose

(A) FAK -. /- Celler blev transficeret med 100 nM siRNA (enten krypterede pool eller p53 siRNA) ved 50% konfluens. Efter 24 timer, proteinekstrakter blev fremstillet og immunblots probet med anti-p53 (øvre panel), anti-p21 (midterste panel) og anti-β-actin (nedre panel). (B) Densitometri sammenligne p21-niveauer i FAK – /- proteinekstrakter behandlet med enten en kodet pulje af siRNA eller p53 siRNA blev udført. P21 proteinniveauer blev normaliseret for p-actin og viste resultater er repræsentative for en af ​​tre separate forsøg. (C) FAK – /- celler ved 50% konfluens blev transficeret med enten 100 nM scrambled siRNA eller 100 nM p53 siRNA, inkuberet i 24 timer og derefter bestrålet med 5 Gy. Lysater blev opsamlet ved angivne tidspunkter og immunblots probet med anti-p53 (øvre panel), anti-p21 (midterste panel) og anti-β-actin (nedre panel). (D) Proteinekstrakter blev fremstillet fra FAK – /- og FAK wt celler 2 timer efter udsættelse for forskellige doser af stråling (0-30 Gy). Ekstrakterne blev separeret ved SDS-PAGE og immunblots probet med anti-p53 (øvre paneler) og anti-β-actin (nedre paneler). Den højre vognbane i hver gel indeholder protein ekstrakter fra FAK – /- eller FAK wt celler udsat for behandling natten over med 0,1 uM actinomycin D.

Tidligere arbejde har etableret en klar sammenhæng mellem FAK og p53, der fremmer overlevelse efter stress-induceret signalering (i celler, som mangler p21),

via

FAK FERM domæne binding til p53 i kernen, letter p53 nedbrydning og overlevelse [46]. Derfor vi immunpræcipiteret FAK fra lysater af FAK wt SCC-celler før og efter 5 Gy bestråling, og immunoblottedes for p53 og for Src (som en positiv kontrol). Som forventet blev Src bundet til FAK, og dette var uændret ved bestråling (fig S2A (bestemt som beskrevet i Methods S1)). Vi fandt imidlertid, at FAK ikke interagere med p53 (fig. S2A). Lysater blev undersøgt for FAK, Src og p53 at sikre lige belastning (fig. S2B). Vi fandt også, at p53 var effektivt translokeres til kernen i begge FAK – /-. Og FAK wt celler efter bestråling (ikke vist)

Eftersom p21 er blevet forbundet med både modstand og følsomhed over for DNA-beskadigende midler, herunder ioniserende stråling, vi næste forarmet p21 hjælp siRNA. Vi opnåede omkring 90% knock-down af p21 i SCC-celler (fig. 6A og 6B). Clonogenicity blev derefter vurderet ved 0, 4 og 8 Gy og gjort sammenligning mellem cellepopulationer transficeret med p21 siRNA, krypterede siRNA eller kontrol cellepopulationer, som havde været mock transficeret. Vi fandt en signifikant forskel i overlevende fraktion ved 8 Gy (p = 0,0129) mellem den krypterede siRNA- og p21 siRNA-behandlede celler, således at p21 fremmet radio-resistens i SCC-celler (fig. 5C). Der er derfor en stærk sammenhæng mellem stråling-induceret p21 i FAK-mangelfulde celler (men ikke i deres FAK-udtrykkende modstykker), og konstateringen af, at FAK tab inducerer radio-resistens, hvor p21 har en kausal rolle i SCC celler.

(a) FAK – /- SCC-celler blev transficeret med 100 nM siRNA (enten en krypteret pool eller p21 siRNA) ved 50% konfluens. Efter inkubation i 24 timer blev proteinekstrakter immunoblottet og probet med anti-p21 (øvre panel) og anti-β-actin (nedre panel). (B) Densitometri sammenligne p21-niveauer i FAK – /- proteinekstrakter behandlet med enten en kodet pulje af siRNA eller p21 siRNA blev udført. P21 proteinniveauer blev normaliseret for p-actin niveau og viste resultater er repræsentative for en af ​​tre separate forsøg. (C) FAK – /- celler blev mock transficeret eller transficeret med 100 nM af enten en krypteret siRNA pool eller p21 siRNA ved 50% konfluens. Efter 24 timer blev cellepopulationer trypsineret og fortyndet i vækstmedium til en slutkoncentration, der ville tillade enkelt koloni vækst. 100 pi af denne suspension blev derefter tilsat til hver brønd i en plade med 96 brønde. Efter inkubation i 6 timer for at tillade cellevedhæftning pladerne blev bestrålet med 0, 4 eller 8 Gy. Pladerne blev sat op i tre eksemplarer for hver strålingsdosis. Efter 7 dage blev antallet af kolonier per plade blev talt og den overlevende fraktion beregnes. Grafen viser middelværdien ± SEM fra tre separate forsøg. Overlevende fraktioner af p21 siRNA behandlede celler blev sammenlignet med scrambled siRNA behandlede celler ved hver dosis af stråling og statistisk signifikans vurderet af elevens uparrede t-test, * betegner p 0,05, n = 9.

Endelig , vurderede vi, om FAK mangel påvirket mere generelle træk forbundet med DNA-skader. Vi fandt, at mRNA-niveauer i en række p53 target gener, som er involveret i reparation efter ioniserende stråling, nemlig

GADD45

,

p53R2

ddb2

, og er kendt skal nedreguleres af c-Myc [47], blev stimuleret in FAK – /- SCC-celler, men konsekvent mindre i deres FAK-udtrykkende modparter (fig. 7). Dette gjaldt især for

ddb2 dele på 2 timers tid punkt, for

GADD45 dele på senere tidspunkter, og for

p53R2

hele 0-24 timer efter bestråling ( fig. 7A, B og C). Da vi har vist, at FAK er påkrævet for c-Myc opregulering nedstrøms

Apc

deletion i musetarm [22], kan det være, at FAK svækker strålingsinduceret ekspression af genomet integritetsopretholdelsesmiddel gener i SCC-celler

via

c-myc-medieret repression. Vi bemærkede dog, at BRCA1 giver et eksempel på en DNA-skader lydhør gen, der kun minimalt påvirket af FAK tab; ja, er BRCA1 udtryk undertrykt af FAK mangel på senere tidspunkter efter bestråling (fig. 7D). Vi konkluderer således, at stråling-induceret transkription af en undergruppe af p53-responsive gener moduleres af tilstedeværelsen eller fraværet af FAK, og er således ikke blot på grund af generel p53 dysfunktion.

RNA blev ekstraheret fra subkonfluerende FAK – /- og FAK vægt- cellepopulationer på forskellige tidspunkter efter 5 Gy bestråling. QRT-PCR-analyse blev udført under anvendelse af primere rettet mod Ddb2 (A), GADD45 (B), p53R2 (C) og BRCA1 (D), og disse var alle normaliseret for p-actin.

Som nævnt, var der ingen let påviselig apoptose eller differential cellecyklusstandsning, der kan henføres til FAK status. Derfor har vi næste undersøgt phosphorylering på serin 139 i histon γH2AX der forekommer som respons på ioniserende stråling [48] og anses for at være en pålidelig surrogat af dobbeltstrengsbrud reparation. Kvantificering af den procentdel af kerner, der indeholder 5 eller ≥5 γH2AX foci viste, at begge FAK – /- og FAK wt befolkninger havde ≥5 γH2AX foci i stort set alle celler 1 time efter bestråling med 5 Gy (figur 8A.). Men FAK – begyndte cellerne at rydde disse foci inden for 6 timer, og disse vendte tilbage til baseline niveau inden for 24 timer – /; i modsætning FAK re-ekspression i de FAK wt celler forårsagede en langsommere foci clearance rate (sammenlign 6 og 24 timers tidspunkterne, (Fig 8A) Dette er i overensstemmelse med en mere effektiv DNA-reparation aktivitet i FAK -.. /- celler, og en langsommere reparation når FAK er til stede Repræsentative billeder af γH2AX immunofluorescens i FAK -. /- celler (før og 1 time efter 5 Gy bestråling) er vist (fig 8B). Vi fandt også, at FAK -. /- SCC-celler dukkede at have generelt højere niveauer af γH2AX foci under kontrolbetingelser (0 timer) end deres FAK-udtrykkende modparter (billederne ikke vist), idet de fleste FAK – /- celler, som viser flere foci og omkring 10-15% visning ≥5 foci (fig. . 8A, 0 timer) dette antyder, at FAK-deficiente SCC-celler kan have større genetisk ustabilitet end deres FAK wt kolleger; mindst fremgår det, at FAK – /- SCC-celler har generelt forbedret DNA-reparation funktioner og dette korrelerer med radio-resistens . Det er interessant, vi fandt ikke nogen forskel i FAK-afhængig regulering af stråling-induceret fosforylering af enten p53 eller Chk2 (fig. S5)

(A) FAK -. /- Og FAK wt celler blev udpladet ved lav densitet på dækglas, inkuberet i 24 timer og bestrålet med 5 Gy. På forskellige tidspunkter blev cellerne fikseret, permeabiliseres, farvet med anti-phospho-γH2AX (serin 139) og fremkaldes med konfokal mikroskopi. Antallet af foci pr nucleus ( 5 foci eller ≥5 foci) blev dokumenteret i mindst 100 celler. De viste resultater er repræsentative for en af ​​to separate forsøg. (B) Repræsentative billeder demonstrerer un-bestrålede og bestrålede FAK – /- celler på 1 time efter 5 Gy vises, grøn – phospho-γH2AX og blå – DAPI (skala bar, 20 pm), pil i øverste højre boks viser på en kerne med. 5 foci og brudt pil i nederste højre boks peger på en kerne med ≥5 foci

diskussion

Vi viser her, at, i skarp kontrast til en foregående rapport, hvori FAK knock-down sensibiliserede bugspytkirtelkræftceller for ioniserende stråling [43], FAK deletion (og en FAK kinase inhibitor) kan undertrykke signalering til strålingsinduceret, p53-medieret induktion af p21, og dette er forbundet med radio- resistens i avancerede SCC-celler. Vi synes, det er vigtigt at registrere, at FAK rolle i cellulære responser for ioniserende stråling, og måske pro-overlevelse signalering i almindelighed kan være kontekstafhængig, og at der er behov for forsigtighed, når man overvejer terapeutiske kombinationer af FAK-hæmmere og strålebehandling, da dette måske ikke altid være klinisk gavnlig.

i arbejdet her beskrevne, viser vi, at du sletter FAK (eller hæmme dets kinase aktivitet) kan frigive begrænsninger FAK-steder på signalering fra p53 til induktion af flere target gener, nemlig p21 og mindst en undergruppe af p53-regulerede gener involveret i DNA-reparation i SCC-celler. Desuden FAK – /- SCC-celler synes at være mere effektive til reparation efter strålingsinduceret DNA beskadigelse. Men i disse celler vi ikke finde nogen signifikant effekt af FAK sletning på p53 protein stabilitet (uanset om som reaktion på bestråling eller DNA skade narkotika), p53 phosphorylering eller evnen af ​​p53 til at translokere til kernen, og vi kunne ikke finde beviser af en FAK /p53-kompleks, der er blevet rapporteret til at operere i andre sammenhænge. Således er vores arbejde bidrager til en voksende mængde af beviser for, at der er funktionel krydstale mellem FAK og p53 signalveje, men viser, at der er yderligere måder, hvorpå dette kan forekomme. Selvom vi ikke helt forstår den mekanisme, fandt vi, at i SCC-celler, som vi kunne slette FAK ved genetisk rekombination, til FAK funktioner undertrykke den stråling-induceret DNA-reparationsmekanismer funktioner af p53 ved at blokere induktion af p21, og at dette er forbundet