PLoS ONE: Parallel Single Cancer Cell Whole Genome Amplification Brug Button-Valve Assisted Blanding i nanoliter Chambers

Abstrakt

heterogenitet af tumorceller og deres ændring i løbet af sygdommen opfordrer behovet for real tid karakterisering af individuelle tumorceller at forbedre vurderingen af ​​behandlingsmuligheder. Nye generationer af terapier er ofte forbundet med specifikke genetiske ændringer køre behovet for at bestemme den genetiske sammensætning af tumorceller. Her præsenteres en mikrofluid anordning til parallel enkelt celle hele genomet amplifikation (pscWGA) for at opnå tilstrækkelige kopier af en enkelt celle genom til at probe for tilstedeværelsen af ​​behandlingsmål og hyppigheden af ​​dens forekomst blandt tumorcellerne. Individuelle celler blev først fanget og fyldt i otte parallelle forstærkningsenheder. Dernæst blev cellerne lyseret på en chip og deres DNA forstærkes gennem successiv indførelse af dedikerede reagenser, mens du aktivt blanding med hjælp af integrerede knap-ventiler. Reaktionen kammervolumen for scWGA 23,85 nl, og startende fra 6-7 pg DNA indeholdt i en enkelt celle, omkring 8 ng DNA blev opnået efter WGA, svarende til over 1000 gange amplifikation. De forstærkede produkter fra individuelle brystcancerceller blev opsamlet fra indretningen til enten direkte undersøge amplifikation af specifikke gener ved qPCR eller for re-amplifikation af DNA’et til opnåelse af tilstrækkeligt materiale til hele genomet sekventering. Vores pscWGA enhed giver tilstrækkelig DNA fra enkelte celler til deres genetiske karakterisering, og vil uden tvivl give mulighed for automatiseret prøveforberedelse til enkelt kræftcelle genomisk karakterisering

Henvisning:. Yang Y, Swennenhuis JF, Rho HS, Le Gac S, Terstappen LWMM (2014) Parallel Single Cancer Cell Whole Genome Amplification Brug Button-Valve Assisted Blanding i nanoliter Chambers. PLoS ONE 9 (9): e107958. doi: 10,1371 /journal.pone.0107958

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: April 30, 2014, Accepteret: August 16, 2014; Udgivet: 18 September, 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse er finansieret af NanoNextNL, en mikro og nanoteknologi konsortium bestående af regeringen i Holland og 130 partnere. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Denne undersøgelse er finansieret af NanoNextNL, en mikro og nanoteknologi konsortium af virksomheder, universiteter, videninstitutioner og universitetets medicinske centre. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Til karakterisering af tumorer, udtryk for specifikke proteiner eller gener leveres normalt som stede eller fraværende, f.eks ER + eller ER-, HER2 + eller HER, og EGFR mutation til stede eller fraværende. Denne bestemmelse har store konsekvenser for de umiddelbare terapeutiske beslutninger, og at underkaste patienter til specifikke behandlinger. For eksempel patienter, hvis cancer celler har en forstærkning af ErbB2 (HER2) genet er mest sandsynligt at drage fordel af Her2 målretning stoffer som Trastuzumab. [1] Desværre tumorer er meget mere kompleks: ekspressionsniveauer kan variere i udstrakt grad inden for en tumor og kan ændres i løbet af sygdommen. [2] – [4] F.eks somatiske mutationer kan kun være til stede i en lille delmængde af tumoren [5] og tumorceller kan blive resistente over for behandling forbundet med genetiske ændringer. For at demonstrere tilstedeværelsen og omfanget af denne heterogenitet i tumorceller analyse på enkelt celle niveau er nødvendigt for ikke at gå glip af denne vigtige oplysninger [5] -. [7]

For at undersøge genomet af en enkelt celle i en omfattende og pålidelig måde, skal hele genomet amplificeres samtidig bevare den oprindelige repræsentation af generne til at udføre nedstrøms analyse såsom hele genomet sekventering [6] – [8], matrix sammenlignende genom hybridisering (aCGH) [9], [10] eller real-time kvantitativ PCR (RT-qPCR) [11], [12]. På dette tidspunkt alle disse teknikker kræver snesevis af nano-gram til et par mikro-g materiale af hele genomet. Multiple Displacement Amplification ved phi 29 polymerase er en attraktiv tilgang til enkelt-celle hele genomet amplifikation under isotermiske betingelser. [13] DNA-amplifikation under anvendelse af phi29 enzym har den fordel, at det kan producere lange DNA-strenge ( 10 kb) i store mængder (op til 1~2 ug) på relativt kort tid (2 timer). [14] – [16] Imidlertid den ekstremt lave koncentration af DNA fundet i en enkelt celle genom i stadig stort volumen af ​​WGA blanding (20-50 pi) ofte giver anledning til ikke-specifikke amplifikationsprodukter og amplifikation bias. [17] – [19] Desuden sortering og manipulation af individuelle celler til at udføre enkelt celle analyse kan være meget udfordrende og hver manipulation kan give anledning til tab af materiale. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) [8], [20], mikromanipulering [10], [11], laser capture microdissection (LCM) [9], [21] og DEP Array [22], [23] har alle været ansøgte enkelt celle isolation, men behandling af cellerne til opnåelse af DNA til nedstrøms analyse (fx lyse, nukleinsyreisolering og amplifikation) ikke eller kan ikke integreres. På den anden side, mikrofluidik og mikrofabrikerede strukturer giver mulighed for enkelt celle manipulation og samtidig være let koblet til en enkelt celle analysetrin. [24] – [26] Desuden mikrofluidik præsenterer en nøgle-fordel for WGA, da reaktioner finder sted i et langt mindre mængder end ved traditionel pipettering og mikrorør (pico-liter versus mikro-liter). Denne fordel er især fremhævet for WGA af enkelte bakterieceller ved hjælp af reaktions- volumener af 60 nl resulterer i en lavere baggrund og højere dækning med mindre forstærkning skævhed [27].

I mikrofluidenheder, blanding forekommer naturligt ved passiv diffusion . Især diffusionen af ​​store molekyler såsom phi29 polymerase tager længere tid end mindre molekyler og begrænser pålidelig og reaktionshastighed i mikrofluidapparater. Roterende mixer er blevet brugt til at fremskynde denne blandingsprocessen i mikrofluidapparater. [28], [29] Den samlede størrelse af disse strukturer begrænser antallet af parallelle reaktorer, der kan placeres på én enhed og prøveblandingen skal transporteres til en anden reaktor til det næste trin i analysen. Desuden overfladearealet af en reaktor er meget større, hvilket kan øge prøvetab problemer på grund af stikning på kanalvæggene. Alternativt kan ventil strukturer implementeres i en kontinuerlig reaktor til aktiv blanding af reagenserne.

Her introducerer vi en mikrofluid anordning til parallel enkelt celle WGA. For demonstration en enhed med 8 parallelle reaktionskamre designet og testet til at indlæse otte individuelle tumorceller, der efterfølgende blev lyseret under basiske forhold efterfulgt af neutralisering skridt, og WGA. DNA fra enkelte celler blev opformeret ved hjælp phi29 polymerase i begrænset PDMS kammer til nedstrøms off-chip-analyse. Knap ventil-assisteret blanding opnået WGA af individuelle tumorceller med et reagens volumen på -20 nl sammenlignet med 20 pi i traditionelle WGA reaktioner.

E.coli

DNA blev først brugt som modelsystem til at tilpasse WGA hjælp phi29 polymerase, efterfulgt af individuelle celler fra brystcancercellelinier for tumor scWGA. Kvaliteten af ​​on-chip amplificeret DNA blev vurderet ved qPCR målrette 10 forskellige gener.

Eksperimentelle metoder

Chip Fabrikation og Device Forberedelse

De mikrofluidenheder blev fremstillet af flerlagede blød litografi teknik. [30], [31] For det første masken designs blev udarbejdet af CleWin software (WieWeb software, Hengelo, NL) og udskrives på en 5 “soda lime glas med en maske generator LBPG Heidelberg DWL200 (Heidelberg Instruments MIKROTECHNIK GmbH). Føreren forme blev fremstillet ved en fotoresist-baserede fotolitografisk teknik. Positiv fotoresist (AZ 40 XT, MicroChem Corp.) blev spin-coated på en 4 “siliciumskive, og mønstret ved hjælp af fotolitografi. Til pålidelig drift af mikroventiler blev den tværsnitsform af mikrokanaler i hovedsagen fluide kanaler afrundet ved opvarmning af formen ved 140 ° C i en min efter udvikling. Det øverste strømningstekniske lag blev fremstillet ved at hælde uhærdede PDMS (GE RTV 615, elastomer: cross-linker = 5:01) til formen for at opnå en tykkelse på 7 ± 0,5 mm. Den nederste kontrollag blev fremstillet ved spin-coating af uhærdede PDMS (elastomer: tværbinder = 20:01) på master formen ved 2500 rpm i 1 min. Den resulterende tykkelse af kontrollag var 25 ± 2 um. Fluidik og kontrol lag blev hærdet i 45 min og 30 min, henholdsvis ved 80 ° C. Fluidik lag blev skrællet af fra formen og huller til ind- og udløb blev udstanset med en 25-gauge dorn (SYNEO Co, Angleton, TX, USA). Efterfølgende blev strømningsteknisk lag justeret i forhold til kontrollen lag ved hjælp justeringsmærkerne på begge lag under et stereomikroskop og de justerede lag blev bundet ved bagning dem ved 80 ° C i 60 minutter. De bundne lag blev derefter skrællet fra formen, og huller til kontrol porte blev udstanset. Endelig blev den flerlagede PDMS anordning dækket af en forud renset objektglas (Fisher Scientific, Landsmeer, NL) og holdes i ovnen ved 80 ° C i 12 timer for at forbedre vedhæftningen. Før brug indretninger blev præ-coatet ved at strømme en BSA-opløsning (0,5 mg /ml) gennem kanalerne i 20 min. BSA-løsninger blev skubbet ud af luften.

Whole Genome Amplification

ILLUSTRERET GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) blev anvendt til WGA. Lysen (400 mM KOH, 10 mM EDTA, 100 mM DTT), neutralisering (0,4 ml 1 M HCI og 0,6 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5), og skubber puffere (1X Tris · EDTA, 0,2% Tween -20) blev introduceret til de dedikerede indløb på enheden. Forstærkningen reaktion blev udført på en AmpliSpeed ​​slide cycler (Advalytix AG, München, Tyskland) i 2 timer sæt ved 34 ° C. Efter amplifikation blev prøverne opsamlet fra de enkelte forstærkningsenheder og overført til en PCR-plade efterfulgt af en inaktivering trin ved 65 ° C i 10 min. Til re-forstærkning af de on-chip forstærkede prøver blev 17 ul af WGA blandingen tilsættes til en pi af on-chip forstærkede prøve baseret på producentens protokol, og reaktionen blev udført ved 30 ° C på en Bio-Rad CFX 384 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA,) i 70 minutter. Dette blev efterfulgt af en inaktivering trin ved 65 ° C i 10 minutter.

Kvantificering og Kvalifikation

qubit 2,0 Fluorometer og qubit’en dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Breda, NL) blev anvendt til at kvantificere dsDNA. Real-time SYBR green qPCR blev anvendt til kvantificering målspecifik DNA. For

E.coli

WGA, blev primere mod en lille underenhed (SSU), 369 bp, af 16 S rRNA-genet anvendt ved en koncentration på 500 nM. For enkelt kræftcelle forstærkning, primere designet til at målrette lille underenhed af GAPDH (12p3), ERBB2 (17p12), CCND1 (11q13), MYC (8q24.21), PRMT2 (21q22.3), URB2 (1q42.13), FGFR1 (8p12), P53 (17p13.1), TRAM1 (8q13.3), og PAK1 (11q13-Q14) blev anvendt i en koncentration på 500 nM.

Cell Kultur og Forberedelse

brystkræft cellelinien, SKBR-3 (ATCCHTB-30) og MCF-7 (ATCCHTB-22) celler, blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (Sigma Aldrich, Zwijndrecht, NL), suppleret med 10% kalvefosterserum (Sigma Aldrich), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich), 1% penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich) ved 37 ° C i 5% CO2 atmosfære. Før eksperimenter blev celler farvet med CellTracker Orange CMTMR (Molecular Probes, Breda, NL) ved 37 ° C i 30 minutter og frigøres med 0,05% trypsin /EDTA (Gibco, Paisly, UK). Derefter blev cellerne vasket en gang med dyrkningsmedium og resuspenderet i PBS-opløsning.

Fluorescens in situ-hybridisering (FISH)

SKBR-3 og MCF-7-celler blev dyrket og høstet som beskrevet ovenfor. Begge cellelinier blev fastsat i suspension ved hjælp Carnoys fiksativ (Methanol (Fisher Scientific, Loughborough, UK): eddikesyre (Merck, Hohenbrunn, Tyskland), 3:01), og faldt på en almindelig objektglas. Objektglas blev tilladt at tørre i 30 minutter, inden de blev inkuberet i 15 minutter i 2 x SSC (20x SSC = 3 M natriumchlorid (Merck), 0,3 M natriumcitrat (Merck), pH 7,0), 0,5% Igepal (Sigma-Aldrich), hvorefter objektglassene blev dehydreret i gradueret ethanol (70%, 85%, 100%) for én min hver. 3,5 pi Her2 /neu (ERBB2) (kreatech, Amsterdam, NL) probe mix blev påført objektglassene efterfulgt af en Ø12 mm dækglas (Thermo Scientific, Breda, NL). Efter kanten af ​​dækglasset blev forseglet med gummi cement (kreatech), blev prober og mål denatureret i 10 min ved 76 ° C og fik lov at hybridisere i 16 timer ved 37 ° C. Efter hybridisering dækglassene blev fjernet og en stringent vask blev påført under anvendelse af 0,4x SSC, 0,3% Igepal ved 72 ° C i 2 min. Objektglas blev skyllet i 5 minutter i 2 x SSC 0,1% Igepal og dehydreret i gradueret ethanol (70%, 85%, 100%) i 1 minut hver. Slides blev endelig monteret i DAPI /antifade (kreatech).

Resultater og Diskussion

Device Karakterisering

Designet og arbejdsvilkår principper for den parallelle enkelt celle WGA-enhed er illustreret i Figur 1. indretningen indbefatter 8 forstærkningsenheder med 6 indløb (åbne blå cirkler) og 10 udgange (udfyldte blå cirkler) (figur 1A), og den består af to lag, et strømningsteknisk lag (i blåt) og en kontrol lag (i rød og pink). Hver forstærkning enhed (se figur 1B) består af tre cirkulære kamre (1,2 nl) og en firkantet kammer (20,25 nl). De afspærringsventilerne (i rødt) drives pneumatisk og giver mulighed for både manipulation af cellerne og lastning af løsningerne. Blandeventilerne (i pink) placeret i midten af ​​de tre cirkulære kamre drives på samme måde. Den vigtigste kanal har tre indløb for den respektive indførelse af cellesuspensionen, lysis buffer, og neutraliseringsbuffer, som er forbundet med multipleksing kanaler til at skubbe indholdet til 8 individuelle forstærkningsenheder på den modsatte side. WGA produkter kan afhentes på de 8 individuelle outlet reservoirer. Indretningen operation er illustreret i figur 1C, hvor farve farvestoffer blev indført i indretningen til visualiseringsformål, og afbildes under et mikroskop. Det blå farvestof repræsenterer WGA blandingen, den orange farvestof cellesuspensionen, det grønne farvestof lysis buffer, den røde farvestof neutralisering buffer og den lilla farve det skubbende buffer. Først det blå farvestof blev anvendt til at fylde alle rektangulære kamre. Dernæst blev den orange farve er lagt i hovedkanalen og skubbet i de otte første cirkulære kamre. Den samme operation blev udført i det grønne og røde farvestoffer. Endelig opløsningen til stede i de tre runde kamre og det blå farvestof i kvadratet kammer blev blandet. Reagenser blandedes opnået ved aktivering af de tre knapper ventiler, og denne operation procedure er vist i en film (Film S1). For scWGA, brugte vi på knappen ventil aktivering kun for WGA reaktion skridt i figur 1 (C-j). På grund af det lave Reynolds tal findes i mikrofluidkanaler, blanding forekommer ved passiv diffusion. For at øge blandingseffektiviteten for DNA-amplifikation blev knap-formede ventiler integreret i de lukkede forstærkningsenheder af indretningen, i centrum af de tre cirkulære kamre. Tryk de tre knapper ventiler sekventielt hjælper blande reagenser fra de cirkulære og firkantede kamre. Blandingsforholdet effektivitet knap ventilerne blev først vurderet i at blande tests med en blå farve farvestof. Efter pladsen WGA kammeret blev fyldt med blå farve farvestof, blev de tre cirkulære kamre fyldt med MiliQ vand, og stopventilen blev åbnet mellem de cirkulære og firkantede kamre. Derefter blev knap ventiler åbnes og lukkes successivt ved en given frekvens. Ved at observere blandingen af ​​farverne sekvensen af ​​åbning og lukning knap ventiler blev optimeret. For at få adgang blande effektivitet, blev værdien af ​​lysstyrken for den første cirkel kammer registreret under blanding i det område, angivet som en rød cirkel linje i figur 2A. Tiden for fuldstændig blanding ved diffusion alene viste sig at være ca. 30 minutter, medens knappen ventil bistået blanding ved 2 Hz blev meget hurtigere og tog kun ca. 4 min, som vist i figur 2B. Afslutning af blanding blev indstillet således, at lysstyrken målt ved anvendelse Billede J software i det første kammer nået 110 (blå farve) fra 220 målt fra den transparente MilliQ. De opererer ventiler blev testet ved frekvenser mellem 0,1 og 30 Hz i 5 minutter, og blandingen Resultaterne er præsenteret i figur 2C. Blanding effektivitet faldt under 0,5 Hz og over 5 Hz, og der var brug for mindst 4 min ventil aktivering for optimal blanding. Som molekylvægten påvirker den molekylære diffusionskoefficient og da molekylvægten af ​​fødevarer farve farvestof er væsentligt mindre end den af ​​phi29 polymerase (MW 68.000), vi også anvendt rhodamin konjugeret dextran (MW 70.000) og acridin orange mærket DNA til at vurdere blandingen i indretningen ved fluorescensmikroskopi. Blanding var faktisk langsommere end levnedsmidlet farve farvestof og nåede færdiggørelse i ca. 20 minutter ved 1 Hz. (Figur S1).

(A) Skematisk afbildning af indretningen. Enheden indeholder 8 forstærkning enheder med 6 indgange og 10 udgange. (B) Forstørret billede af to forstærkningsenheder. Den blå farve repræsenterer flow kanaler, den røde farve repræsenterer kontrol lag for afspærringsventilerne og den lyserøde farve repræsenterer kontrol lag til knappen ventiler. Forstærkerenhedernes består af tre cirkulære kamre (1,2 nl) til cellesuspensionen, lyseringsbuffer, og neutralisering buffer og en firkantet kammer (20,25 nl) designet til WGA blanding. Blandeventiler er placeret i midten af ​​tre cirkulære kamre. (C) Device operation proces. Bright-field billeder af en forstærkning enhed med farve farvestoffer demonstrere drift proces. (A-j).

(A) Lys-field billede af en forstærkning enhed, hvor pladsen kammeret er fyldt med blå farve farvestof og tre cirkulære kamre med vand, taget ved t = 0. Gennemsnit lysstyrke værdien af ​​det første kammer (rød cirkel) blev overvåget som en funktion af tid efter åbning af ventilen. (B) blanding effektivitet knap ventiler. Målt gennemsnitlige lysstyrkeværdier i første runde kammer med shunt drift-angivet som sort og uden blandeventil drift angivet som grøn. (C) Blanding effektivitet test ved forskellige frekvenser af blandeventil drift. Gennemsnitlige lysstyrkeværdier af det første kammer målt under 5 min.

Whole Genome Amplification på en Chip

Tilpasning af WGA protokol for isoterm DNA-amplifikation med phi29 enzym på en mikrofluidapparat blev udført ved hjælp af

E.coli

hele genomet som model prøve. Først en

E.coli

DNA-opløsning (6 ng /pl) blev indlæst i den vigtigste kanal, og ved at lukke ventilerne på hovedkanalen en nøjagtig volumen på 1,2 nl kunne måles og lagt i den første kamre i forstærkerenhederne af indretningen, som svarer til den mængde DNA (7,2 pg) fundet i en enkelt cancercelle. En bufferopløsning (1X Tris EDTA, 0,2% Tween 20) blev skubbet gennem det første kammer i hvert forstærkning enhed til at fylde de tre cirkulære kamre, samtidig med, at ventilerne mellem cirkulære og firkantede kamre blev lukket ordentligt at isolere WGA mix kamre. WGA mix blev efterfølgende indført fra den direkte indløb til alle firkantede kamre før reaktionen. Side ventiler af kvadrat kamre adskilt de enkelte forstærkningsenheder. Efter åbning afspærringsventilerne mellem cirkulære og firkantede kammer, amplifikationsreaktionen blanding bestående af phi29 polymerase, vilkårlige hexamerer og dNTP’er på pladsen kammer og

E.coli

DNA i de cirkulære kamre begyndte at sprede og var aktivt blandet med hjælp af knappen ventiler aktiveres ved 1 Hz. Efter 2 timer blev prøverne skubbet ind i en gel loading pipettespids anbragt ved udløbet fra kanalen ved at indsætte 5 pi skubbe puffer fra indløbet, og indholdet af pipettespidsen blev efterfølgende transporteret til et PCR-plade. Efter inaktivering af de indsamlede prøver ved 65 ° C i 10 minutter blev qPCR målretning SSU af 16 S rRNA-genet gennemføres for at kontrollere kvaliteten af ​​det amplificerede produkt. De realtid qPCR-kurver ved hjælp af seksten prøver af 1 pi on-chip amplificeret DNA er vist i figur 3 (grønne linjer), og de svarer til en gennemsnitlig Cq af 14,77 ± 0,55 (n = 16). Til sammenligning blev fjorten prøver af 6 ng /pl DNA-opløsning i 1,2 nl kammer analyseret uden nogen forstærkning. De, der er repræsenteret ved de sorte linier i figur 3, og resulterede i en gennemsnitlig Cq værdi på 23.43 ± 0.02 (n = 14). Større mængde start DNA show senere Cq værdi på RT-qPCR og forskel på CQ-værdier (ΔCq) kan kvantificere forskellen af ​​beløbet mellem prøver baseret på standard kurver. ΔCq af prøver uden amplifikation og prøver efter amplifikation var ca. 9. Derfor qPCR målretning SSU af 16 S rRNA-genet resulterede i en målspecifik DNA-amplifikation af 512 fold (2

ΔCq = 2

9, 100% effektivitet). Lignende eksperimenter udført uden at blande ved hjælp af knappen ventiler resulterede i en gennemsnitlig Cq værdi på 20,18 ± 2,07 (n = 7), som tydeligt viser den fordel aktiv blanding under forstærkning trin (figur S2).

Real- tid qPCR kurver rettet mod SSU 16 S rRNA-genet af individuelle indsamlede prøver fra enheden. On-chip forstærkede prøver er repræsenteret som grønne kurver (n = 16), mens kontrolprøver uden forstærkning er repræsenteret som sorte kurver (n = 14).

WGA af tumorceller

for at demonstrere gennemførligheden af ​​den genetiske karakterisering af individuelle tumorceller i mikrofluidapparat vi brugte celler fra brystcancercellelinje SKBR-3 og MCF-7. Da mængden af ​​DNA (6-7 pg) indeholdt i en enkelt celle er for lav til en direkte undersøgelse af dens sammensætning, blev hele genomet amplificeret som beskrevet tidligere. I den vigtigste kanal kan undersøges morfologi og immunofænotype af cellerne, og efter kontrol af, at cellerne passer vores udvælgelseskriterier enkelte celler kan flyttes ind i det første kammer af forstærkning enheder. En cellesuspension af SKBR-3 og MCF-7-celler farvet med CellTracker Orange blev injiceret i hovedkanalen, og vi identificeret celler, der skal udsættes for yderligere analyse af deres fluorescens-farvning og morfologi, såsom størrelse og form. Efter læsning af de enkelte celler i det første kammer af en forstærkning enhed, var luft presset til at tømme den vigtigste kanal. Som multipleksede flydelinier er forbundet til den primære kanal hver linje kan åbnes enkeltvis ved betjening kombination af ventiler og kun de celler af interesse kan bearbejdes yderligere. [32] Billeder af en SKBR-3 celle i en amplifikation kammer er vist i figur 4A B. Efter at cellen blev flyttet ind amplifikationsenheden anden blev lyseringsbuffer indlæst, som vist i figur 1C, måles ved at lukke ventilerne, og skubbes ved hjælp 1X Tris · EDTA, 0,2% Tween-20 at blande det med cellen . For at imødekomme lydstyrken ventilen mellem den første og anden cirkel kamre blev åbnet og lysis fandt sted i de første to kamre i 10 min ved diffusion. På samme måde blev neutraliseringsbuffer indført og neutralisering fandt sted i de tre circle kamre, også i 10 minutter baseret på diffusion. Ventilaktivering til blanding var ikke nødvendig for lysis og neutralisering diffusion mellem 2 eller 3 cirkulære kamre var hurtig nok til at udføre reaktionen. Faktiske lysis af cellerne blev monitoreret ved mikroskopi. WGA blanding blev fyldt i de firkantede kamre ved hjælp af separate indløb og udløb, og derefter blev de knap ventiler drevet ved 1 Hz under 2 timer reaktion at blande cellelysatet og WGA blandingen, og amplificere DNA. Ca. 8,27 ng DNA blev opnået fra on-chip-amplifikation, og, som en enkelt celle indeholder 6-7 pg af DNA, blev mere end 1000 gange amplifikation opnået. Validering af template-specifik DNA blev udført ved qPCR målretning GAPDH gen locus som ændringer af GAPDH ikke er blevet rapporteret i begge cellelinier. Den brystcancercellelinje SKBR-3 og MCF-7 blev anvendt til at påvise forskelle i ERBB2 genamplifikation. Figur 4C viser de realtid qPCR kurver af GAPDH i seks individuelle SKBR-3-celler (sorte kurver) og seks individuelle MCF-7-celler (grønne kurver), analyseret under anvendelse af to forskellige enheder. CQ værdier for GAPDH forstærkning kvantificeret baseret på standard kurver var 23,22 ± 0,6. Dette indebar, at 33% af den totale mængde DNA, målt ved qubit’en assayet, var template-afhængig produkt. I figur 4D og E FISH billeder, efter hybridisering af erbB2-prober (rød) og centromeren af ​​kromosom 17 (grøn) af en SKBR-3 og MCF-7 celler er vist. Ud fra følgende betragtninger 2 kopier af kromosom 17 og 2 kopier af ErbB2 genet blev observeret i MCF-7 celle, fire kopier af kromosom 17 og 10 kopier af ERBB2 genet blev fundet i den SKBR-3 celle. Dernæst blev den samme analyse udført ved hjælp scWGA i vores mikrofluidapparat hjælp ERBB2 specifik qPCR, til individuel SKBR-3 og MCF-7 celler. Som vist i figur 4 F, den midlede ERBB2 Cq værdi i det amplificerede DNA fra individuelle SKBR-3-celler var 24,95 ± 0,68 (n = 6) mod 29,80 ± 1,96 (n = 5) for individuelle MCF7-celler, mens GAPDH Cq værdi for både cellelinjer var 23,22 ± 0,6 (n = 12) er vist i figur 4C. Den nedre Cq værdi målt for SKBR-3-celler korrelerer godt med de multiple kopier af ERBB2 genet observeret af FISH (figur 4D), hvilket antyder, at vores on-chip WGA efterfulgt af qPCR for specifikke gener kan anvendes til at afgøre, hvorvidt et gen forstærkes.

(a) lys-felt mikroskop billede af en enkelt SKBR-3 celle isoleret i en mikrofluid kammer, fusioneret med et fluorescens billede. (B) fluorescens billede af en enkelt SKBR-3 celle farvet med CellTracker Orange i mikrofluid kammer. (C og F) qPCR målretning GAPDH og erbB2 gener af on-chip amplificeret DNA til kvantificering og karakterisering under anvendelse af 1 ul af on-chip amplificerede prøver (5 pi) fra individuelle SKBR-3 (n = 6) og MCF-7 (n = 6) som skabeloner. (C) Real-time qPCR kurver GAPDH genamplifikation. Amplificeret DNA af enkelt SKBR-3 er repræsenteret ved hjælp af sorte kurver mens den for enlige MCF-7-celler er repræsenteret som grønne kurver. Threshold linje er i grå. (D og E) Billeder af fluorescens in situ hybridisering (FISH) med ErbB2 prober (rød) og centromeren af ​​kromosom 17 prober (grøn) til individuel SKBR-3 (D) og MCF-7 (E). Kerner blev farvet med Hoechst (blå) (F) CQ-værdier i ErbB2-gen i en kasse plot. CQ-værdier i ErbB2 var repræsenteret som sort boks i SKBR-3 (n = 6) og røde boks i MCF-7 (n = 5, * Cq af 1 prøve mangler på grund af PCR-fejl). . (25% -75%: □, Median værdi: -, Middelværdi: □, Min /Max: °, Rækkevidde på Min /Max: I)

For genetisk analyse såsom sekventering eller high-throughput array analyse, større mængde DNA (mikrogram) er påkrævet. For at evaluere egnetheden af ​​reamplificeret produkter til gen-repræsentation, vi amplificeret off-chip 1 pi af 5 pi on-chip amplificeret DNA fra en enkelt SKBR-3 celle i 17 pi WGA mix, efterfulgt af qPCR målretning 10 forskellige loci på hele genomet. Til dette har vi vælger 10 gener, der er af interesse for kræftforskning feltet og placeret på forskellige kromosomer. De amplificerede produkter af disse gener kan give oplysninger om repræsentationen af ​​udgangs-DNA i de amplificerede produkter. 10 ng 8 genindførte forstærkede prøver indsamlet fra to enheder (4 prøver pr enhed) blev sammenlignet med 10 ng genomisk DNA (gDNA) i SKBR-3. Figur 5A viser koefficienten af ​​varians (CV,%) af de CQ værdier på 4 prøver i hver enhed præsenteret som grønne og sorte søjler for de 10 loci overvejes. Gennemsnittet af CV for disse 10 gener var 3,8% for den første indretning (grøn) og 2,9% for den anden indretning (sort), og blev observeret under 7% variation i any10 gener mellem prøverne i den samme enhed. De ΔCq værdier for de enkelte 8 prøver sammenlignet med gDNA blev bestemt for de 10 gener (se figur 5B). De enkelte linjer i figur 5B svarer til en reaktion på chip. ΔCq varierede mellem gener men alle 10 gener blev amplificeret i 10 ng scWGA prøver (n = 8). De kopi numrene på de målgener blev anslået på grundlag af de qPCR standard kurver gDNA. De grå søjler i figur 5C repræsenterer kopi antal individuelle scWGA i 10 ng DNA, mens de sorte bjælker repræsenterer kopi antal genomisk DNA i 10 ng. De midlede kopi tal for de 10 gener i 10 ng DNA er: 128 kopier af ERBB2, 47 eksemplarer af CCND1, 140 eksemplarer af MYC, 201 eksemplarer af PRMT2, 213 eksemplarer af URB2, 1182 eksemplarer af FGFR1, 42 eksemplarer af P53, 348 kopier af TRAM1, 332 kopier af PAK1 og 513 kopier af GAPDH, hvilket svarer til procentdele af repræsentation af 4,8%, 1,4%, 6,6%, 7,5%, 5,4%, 34,1%, 1,5%, 9,1%, 10,7%, og 15,5% hhv. Forsinkede CQ værdier og baggrund forstærkning resulteret i færre kopi antal gener sammenlignet med gDNA i 10 ng. Siden blev observeret det samme resultat, når små kopier af gDNA blev forstærket, vi antager denne skævhed er et artefakt forårsaget af den kommercielle kit. Desuden fluorescens-baserede DNA kvantificering, re-amplifikation, qPCR procedurer, og kvantificering baseret på standardkurver af genomisk DNA kan variere resultaterne. Andre ikke-isoterme og isotermiske DNA amplifikationsmetoder kan implementeres i vores mikrovæskeanordning selvom reaktionen mængder og reaktionen skridt vil være nødvendigt at tilpasse og for ikke-isoterme temperaturregulering vil skulle indføres.

CQ-værdier 10 ng DNA-templates bestemmes af SYBR grøn qPCR rettet mod 10 gener. (A) Koefficienten for varians (%) af CQ værdier på 4 prøver amplificeret på samme chip. Prøver på 2 forskellige enheder angives som grønne og sorte bjælker. (B) Individuel linje repræsenterer en amplificeret prøve på en chip fra en enkelt celle. Y-aksen repræsenterer delta CQ værdier mellem 10 ng DNA amplificeret på en chip fra enkelt celle og genomisk DNA. (C) Anslået kopi antal individuelle prøver repræsenteret som grå bjælker. (N = 8) Sorte søjler repræsenterer estimerede kopiantal af genomisk DNA i 10 ng.

Konklusioner

Her præsenterede vi en mikrofluidanordning til parallel behandling af enkelte celler til at opnå tilstrækkelige mængder af DNA fra hele genomet forstærkning for downstream analyse. Knap-formede membraner blev gennemført som blandeventiler, og sekventiel aktivering af disse ventiler forbedret blande effektivitet. WGA i en 23,85 nl reaktionsvolumen blev optimeret ved anvendelse af

E. coli

gDNA.