PLoS ONE: TFIIB-relateret faktor 2 Over udtryk er en Prognose Marker for tidlige fase Ikke-småcellet lungekræft korreleret med Tumor Angiogenesis

Abstrakt

Baggrund

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge BRF2 udtryk i patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og udforske forholdet mellem BRF2 protein med clinicopathologic faktorer, tumor angiogenese og prognose.

Metoder

Både BRF2 protein og intratumorale mikrokar blev undersøgt ved immunhistokemisk farvning i 107 ikke-småcellet lungekræft patienter. Intratumoral m icrovessel densitet (MVD) blev målt ved at tælle CD-34 positive immunfarvet endotelceller. Western blot og RT-PCR-analyser blev anvendt til at undersøge BRF2 udtryk status i væv

Resultater

Et markant højere niveau af BRF2 ekspression blev fundet i NSCLC væv på protein niveauer. Desuden univariate og multivariate analyse viste, at BRF2 protein overekspression og høj MVD var signifikant associeret med tumor tilbagefald. Selvom BRF2 overekspression og høj MVD angivet dårlig 5-års samlet overlevelse (p = 0,004 og p = 0,019, henholdsvis), multivariat analyse viste, at kun BRF2 overekspression var en uafhængig prognostisk faktor for ugunstige samlet overlevelse (P = 0,021).

konklusioner

BRF2 er en lovende biomarkør for at identificere personer med dårlig prognostisk potentiale og en målværdi for antiangiogen terapi for patienter med tidlige fase NSCLC

Henvisning:. Lu M, Tian H, Yue W, Li L, Li S, Qi L, et al. (2014) TFIIB-relateret faktor 2 Over udtryk er en Prognose Marker for tidlige fase Ikke-småcellet lungekræft korreleret med tumorangiogenese. PLoS ONE 9 (2): e88032. doi: 10,1371 /journal.pone.0088032

Redaktør: Kapil Mehta, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: August 22, 2013; Accepteret: 2 januar 2014; Publiceret: 11 feb 2014

Copyright: © 2014 Lu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Project understøttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.571.844), og Videnskab og Teknologi Development Foundation of Shandong-provinsen (nr 2009GG10002007), og National Natural Science Foundation i Shandong-provinsen (nr ZR2009CM090), og Wu Jie Ping Foundation (nr 320.6750.12393). Sponsorer havde nogen andel i undersøgelsen design, i indsamling, analyse og fortolkning af data; i skrivning af manuskriptet; og i beslutningen om at indsende manuskriptet til offentliggørelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest almindelige årsag til kræft død for både mænd og kvinder over hele verden. Hvert år er der 1,35 millioner nye lungekræfttilfælde i verden [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ca. 75-80% af tilfældene af lungekræft [2] – [3]. På trods af de fremskridt inden tidlig påvisning, radikal kur drift, og multimodale terapeutiske modaliteter i de seneste årtier, er den samlede 5-års overlevelsesraten for lungekræft er kun 15% [4]. 30-40% af trin I patienter tilbagefald efter kirurgisk resektion [5]. Desuden viste prospektive randomiserede data, som adjuverende kemoterapi i fase IB ikke har opnået en betydelig overlevelse og endda en skadelig virkning blev observeret i fase IA [6]. Derfor er der et presserende behov for at identificere nye biomarkører, der vil hjælpe vælge de patienter med forhøjet chance for lungekræft tilbagefald og give bedre prognose og individualisering behandling.

RNA-polymerase (pol) III er ansvarlig for transskription af små, mindre end 300 nukleotider, uoversatte RNA herunder microRNA (miRNA) [7] – [8]. Siden deres opdagelse, at miRNA blevet impliceret i patogenesen af ​​forskellige humane cancere, og miRNA ekspression profilering af humane tumorer har specifikke signaturer knyttet til diagnosen, stadieinddeling, progression, prognose og reaktion på behandling [9]. Præcis transskription af RNA pol III kræver TFIIIB, mens BRF2 (TFIIB-relateret faktor 2) er en komponent i TFIIIB. Reguleringen af ​​pol III er en integreret kontrol- vækst funktioner RB, P53 og c-myc, og TFIIIB aktivitet er strengt reguleret af Maf1, kemoforebyggende agenter, onkogener og tumor undertrykkere [10] – [15]. BRF2 har vist sig at være stærkt overudtrykt i en række forskellige cancere, herunder gastrisk, nyre og melanom kræft [16] – [17]. For nylig, Lockwood et al. rapporterede, at overekspression af BRF2 kunne drive ekspressionen af ​​RNA pol III transkripter, der bidrager til pladecellekarcinom tumorigenese, og BRF2 er blevet identificeret som en hidtil ukendt slægt-specifikke onkogen i lunge pladecellecarcinom [18]. Men for at vi ved, er udtryk for BRF2 og dets overensstemmelse med clinicopathologic faktorer og prognose i kirurgisk resektion NSCLC er ikke undersøgt.

I denne undersøgelse har vi ansat immunhistokemisk metode til at undersøge BRF2 proteinekspression i kliniske NSCLC prøver , og vi analyserede relationer BRF2 udtryk med variable clinicopathologic funktioner og patient prognose. Desuden har vi vurderet de uafhængige prognostiske faktorer, der påvirker overlevelse NSCLC patienter på lang sigt.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Etik bestyrelser Qilu Hospital, og erhvervelse vævsprøven blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. Alle emner underskrevet skriftligt informeret samtykke, og dette samtykke procedure blev godkendt af Etik bestyrelser Qilu Hospital.

Patienter

Prøver blev opnået fra 107 patienter, der blev diagnosticeret med NSCLC mellem januar 2004 og oktober . 2006 ved Institut for Thoracic Surgery, Qilu Hospital, og behandles med pulmonal lobectomy plus regional lymfeknude dissektion.

Alle patienter havde ingen præoperativ strålebehandling eller kemoterapi, og havde ingen fjernmetastaser. De data om deres clinicopathologic funktioner og opfølgning var fuldstændige. 46 tilfælde af tilstødende vævsprøver blev taget fra ca. 0,5 cm væk fra den ydre kant af lunge tumorvæv, og de andre 32 tilfælde blev taget mere end 5 cm fra tumoren margen af ​​normale lungevæv som negative kontroller. For RT-PCR og Western blotting-analyse, 12 matchede par af tumorer væv og tilstødende noncancerous vævsprøver blev opnået fra pulmonale lobectomy enheder af patienter diagnosticeret med NSCLC umiddelbart efter operationen mellem SEP 2013 og okt 2013 kategorien, og opbevaret ved -80 ° C.

for alle patienter, blev histologisk type og kvalitet af kræft celledifferentiering revurderet og bestemt af klassifikationssystem af World Health Organization ændret i 2004, og postsurgical patologisk iscenesættelse blev bestemt på grundlag af det internationale iscenesættelse system.

Immunhistokemi

Alle prøver blev indsamlet under operationen, fikseret med 10% formalin og indstøbt i paraffin. Vævene blev skåret som 4 um serielle snit, og derefter afparaffiniseret under anvendelse xylen og rehydreret gennem en ethanol-serien til vand. Høj temperatur antigen-genvinding blev udført i citratpuffer i 25 minutter i en mikrobølgeovn. Så den endogene peroxidase enzym-aktivitet blev blokeret under anvendelse af 3% H

2O

2 i methanol i 20 minutter ved stuetemperatur. Objektglassene blev derefter inkuberet med primære kanin anti-BRF2 polyklonalt antistof (Abcam) og kanin-anti-CD34 monoklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology) natten over ved 4 ° C i et kammer med høj fugtighed, efterfulgt af inkubation i 30 minutter ved 37 ° C med biotinylerede sekundære antistoffer og streptavidin-peroxidase-kompleks. Endelig en 3,30-diaminobenzidin opløsning blev tilsat, og objektglassene blev modfarvet med hematoxylin og monteres med neutral balsam. For negative kontroller blev snit inkuberet med PBS i stedet for de primære antistoffer.

Evaluering af BRF2 proteinekspression og mikrokar densitet

I BRF2 farvning, området inden for det diagnostiske område blev scoret af tre uafhængige observatører og en reproducerbar semikvantitativ metode, betragtes både farvningsintensitet (0, negativ; 1, svag; 2, moderat og 3, stærk), og procentdelen af ​​positivt farvede celler (0, 0-5%; 1, 6-25 %, 2, 26-50%, 3, 51-75%, 4, 76%) blev vedtaget [19]. For evaluering af positiv farvning af BRF2 bør mindst 3 sektioner eller områder fra hver prøve blive scoret. Modstridende scoringer blev løst ved at vælge værdien konsistent mellem to observatører eller gennemsnittet af de point.

For intratumoral mikrokar densitet (MVD), blev mikrokar registreret ved at tælle CD34 positivt farvede endotelceller som descripted tidligere [20]. Den mikrokar count (MVC) blev bestemt uafhængigt af to patologer i hvert enkelt tilfælde. Tre repræsentative områder med tæt neovaskularisering blev udvalgt under lav mikroskop effekt (× 10 objektiv og × 10 okular linse) og derefter fartøjer blev talt ved højere forstørrelse (× 20 objektiv og × 20 okular linse). Gennemsnittet af tællingerne i tre felter blev registreret. Store skibe med tykke, muskuløse vægge var udelukket.

cutoff værdi for høj og lav ekspression blev bestemt på grundlag af en heterogenitet værdien målt gennem log-rank statistisk analyse med hensyn til den samlede overlevelse [21]. Farvningen index score 4 blev valgt som cutoff point for forskelsbehandling mellem BRF2 lav og høj ekspression. Og farvningen indeks score≥4 definerede tumorer med høj BRF2 udtryk, og farvningen index score 4 angivne lav BRF2 udtryk. Tumorer med mikrokar ≥42 blev klassificeret som høj MVD, mens tumorer med mikrokar 42 blev klassificeret som lav MVD

Real-time PCR (RT-PCR)

Kirurgiske prøver blev behandlet med det samme. efter operation. Totale RNA’er blev ekstraheret fra væv ved hjælp af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) ifølge producentens protokol og behandlet med RQ1 RNase-fri DNase (Promega) cDNA blev syntetiseret. De udtryk for BRF2 og HIF-1α blev kvantificeret ved realtid polymerasekædereaktion (PCR) ved hjælp af en Bio-Rad iQ5 real-time PCR-system med EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, USA) i henhold til brugsanvisningen. Primeren for GAPDH og BRF2 er som følger: GAPDH, forward,5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,reverse,5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′;BRF2,forward,5′-GTGAAGCTCCTGGGACTGGAT-3′,reverse, 5′-GTATTTGGCTGGCACAGAAGG-3 ‘; Resultaterne er gennemsnit ± standardfejl gennemsnitlige (SEM) af 3 gentagne eksperimenter og GAPDH blev anvendt som reference udskrift.

Western blotting analyse

De friske væv blev vasket tre gange med iskold fosfat -buffered saltvand (PBS) og lyseret på is i RIPA (radio immunpræcipitationsassay) puffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) indeholdende komplet proteaseinhibitorcocktail (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Protein fra væv eller celler blev separeret via SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran (GE Healthcare, USA). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 (TBST) i 1,5 time ved stuetemperatur blev membranerne derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med anti-BRF2 (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), eller anti-GADPH (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) antistoffer. Efterfulgt af anti- kanin peberrodsperoxidase konjugeret IgG, en ECL kit (GE Healthcare, USA) blev anvendt til detektion.

Statistisk analyse

Chi-square test blev anvendt til at teste sammenhængen mellem BRF2 udtryk og MVD, og ​​sammenhængen mellem BRF2 udtryk eller MVD og klinisk-patologiske faktorer. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til beregning overlevelseskurverne, og log-rank testen blev anvendt til at sammenligne forskellen mellem overlevelse af patientundergrupper. Multivariat Cox regressionsanalyse blev brugt til at identificere væsentlige uafhængige prognostiske faktorer. Forskelle mellem grupper blev betragtet som signifikante for P-værdi 0,05. Alle statistiske analyser blev udført med SPSS 13.0 statistisk software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

BRF2 udtryk i NSCLC

Vi har registreret udtryk for BRF2 protein i de normale lungevæv, hosliggende ikke-tumorvæv og tumorvæv ved immunhistokemi. Som vist i fig. 1 A, diffus nuklear farvning af BRF2 protein ved forskellige intensiteter blev observeret i kræftceller, men BRF2 var knap påvist i normale lungevæv. Desuden blev nogle farvning observeret i cytoplasmaet af cancerceller. Imidlertid observerede vi ingen statistisk signifikant korrelation mellem BRF2 proteinekspression og eventuelle klinisk-patologiske træk ved NSCLC væv (P 0,05, tabel 1). Middelværdien af ​​BRF2 ekspression i 107 NSCLC væv var 55,14%, hvilket er betydeligt højere end i tilstødende væv og normale lungevæv (36.96%, og 34,38%, henholdsvis P = 0,034 tabel 2).

(A ): ekspressionsmønsteret for BRF2 i lungekræft væv. (A) Høj BRF2 ekspression i lunge adenocarcinom. (B): Høj BRF2 ekspression i lunge pladecellecarcinom væv. (C): Negativ BRF2 ekspression i lunge adenocarcinom. (D): Negativ BRF2 ekspression i lunge pladecellecarcinom væv. (E): intratumorale mikrokar blev farvet som brown af den anti-CD34 monoklonalt antistof i lungekræft væv (forstørrelse × 400). (B): Kvantitativ realtids-PCR-analyser af BRF2 mRNA i tolv par af matchede NSCLC og noncancerous væv med GAPDH som ladningskontrol i begge paneler. (C): Protein niveauer af BRF2 udtryk blev evalueret ved western blotting fra parret noncancerous væv og NSCLC Vejviser

For at undersøge status for BRF2 genekspression i NSCLC, vi brugte Real. -tid PCR for at måle mRNA-ekspression i 12 par af primære cancertumorer og tilstødende noncancerous prøver. Sammenlignet med deres tilstødende noncancerous prøver, 8 af 12 NSCLC havde opreguleret ekspression (fig. 1B og fig. 1 C). Konsekvent, viste Western blot analyse, at de 8 tilfælde havde også højere BRF2 protein-ekspression end tilstødende væv.

Sammenhæng mellem MVD og clinicopathologic faktorer af NSCLC

intratumoral MVD blev kvantificeret ved at tælle CD34-positive endotel celler i cancervæv (fig. 1a) og farvningen intensiteten af ​​MVD varierede bredt fra 12 til 118 mikrokar /200 ganges forstørrelse felt. Vi fandt, at MVD var signifikant korreleret med invasion dybde (P = 0,013), men ikke med andre clinicopathologic faktorer NSCLC (P 0,05; tabel 1)

univariate og multivariate overlevelsesanalyse

. af de 107 patienter, 53 (49,5%) patienter døde inden for 5 år efter operationen, og tumor tilbagefald udviklet under opfølgning i 57 (53,3%) patienter. Kaplan-Meier-analyser sammenlignes ved log-rank testen blev anvendt til at beregne effekten af ​​de clinicopathologic faktorer på den samlede overlevelse og sygdomsfri overlevelse. Univariate analyse viste, at høj MVD (40,0% vs. 63,8%; P = 0,019) og BRF2 protein overekspression (39,0% vs.64.6%; P = 0,004) signifikant forudsagt faldt samlet 5-års overlevelse. Desuden høj MVD (65,0 vs. 38,3%, P = 0,008) og BRF2 proteinoverekspression (62,7% vs. 41,7%, P = 0,006) viste en større risiko for tilbagefald (fig. 2); Desuden multivariat analyse identificeret BRF2 overekspression (P = 0,036) og MVD (P = 0,034) som selvstændige prognostiske faktorer for progressionsfri overlevelse. Men kun BRF2 overekspression bevaret sin betydning som en selvstændig prognostisk faktor for den samlede samt progressionsfri overlevelse (P = 0,021, tabel 3 og tabel 4). Vejviser

Til udforske korrelationen mellem BRF2 overekspression med MVD, vi yderligere undersøgt overlevelsen forskelle patienter stratificeret til lav MVD og høj MVD ifølge BRF2 proteinekspression status. For patienter uden BRF2 overekspression, vi registreret en højsignifikant ringere samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (PFS), henholdsvis hos patienter med forhøjet MVD sammenlignet med patienter med lav MVD (P = 0,003 for OS og P = 0,001 for PFS, tabel 5). Men der var ingen signifikante forskelle i overlevelse mellem lav-MVD gruppe og high-MVD gruppe for patienter med BRF2 overekspression (P 0,05, tabel 5). Og statistisk analyse viste, at der var betydeligt mere MVD i tumorer med BRF2 protein høj ekspression end hos dem med BRF2 protein lavt udtryk (P 0,001, Mann-Whitney U test. Figur 3).

Mann WhitneyUtest viste, at tumorer med BRF2 protein høj ekspression viste signifikant højere intratumoral MVD end tumorer med BRF2 protein lav ekspression (p 0,001).

Vi analyserede yderligere den prognostiske betydning af BRF2 protein i selektiv patient undergrupper stratificeret efter histologi type NSCLC. Univariate analyse viste, at den samlede 5-års overlevelsesraten for patienter med BRF2 protein høj ekspression var betydeligt lavere end for de resterende patienter blandt planocellulært karcinom, og vi fandt også en sådan tendens i adenocarcinom, på trods af den statistiske analyse giver ikke mening ; (P = 0,007 og P = 0,130, respectly, fig. 4)

(a): pladecellekarcinom.. (B):. Adenocarcinom

Diskussion

Evnen til at formere sig ukontrollabelt er den dominerende karakteristisk for mange typer af cancerceller. Evaluering af molekylære prognostiske faktorer er et vigtigt område for kræftforskning. BRF2 kodes af et gen lokaliseret på kromosom 8p12 [22]. Flere undersøgelser har vist, at BRF2 overudtrykkes i flere typer cancer [23] og foreslå den onkogene rolle BRF2. Imidlertid har få studier undersøgt udtryk og betydning BRF2 i NSCLC, især for prognosen for NSCLC.

I denne undersøgelse viste vores resultater, at der ikke var nogen signifikant sammenhæng mellem BRF2 udtryk og de klinisk-patologiske funktioner i NSCLC (p 0,05). Imidlertid blev høj MVD signifikant associeret med T-status i NSCLC, men ikke forbundet med alder, køn, rygning, histologi og differentiering. Til en vis grad, T fase er en kritisk proces med tumorudvikling, og forskellen i sammenhængen mellem MVD og klinisk-patologiske træk kan afspejle, at mikrokar massefylde er et vigtigt aspekt af tumorudvikling. Vi fandt imidlertid ingen signifikant forskel i BRF2 ekspression mellem lungeadenocarcinom og lunge pladecellecarcinom ved immunohistokemisk farvning.

Især viste vores resultater, at BRF2 proteinoverekspression var almindelige i tidlige NSCLC væv og signifikant associeret med forøget angiogen aktivitet målt som intratumoral MVD, hvilket tyder på, at BRF2 spiller afgørende rolle i NSCLC tumorigenese ved induktion eller /og fremme af tumor angiogenese. Selvom flere vækstfaktorer har vist sig at regulere angiogenese og vaskulær udvikling, er lidt om den komplekse mekanisme af genekspression og oversættelse [24] regulering. Vores resultater fremhæve den potentielle rolle BRF2 i tumor angiogenese.

Vores overlevelse analyse viste, at høj MVD og BRF2 protein overekspression signifikant forudsagt faldt samlet 5-års overlevelse og højere gentagelse sats. Yderligere analyse ved hjælp af Cox-regressionsmodel bekræftede, at BRF2 udtryk og MVD var uafhængige faktorer forudsige progressionsfri overlevelse for NSCLC patienter, hvilket tyder på, at BRF2 protein og MVD kan være potentielle prognostiske faktorer for tilbagefald af debuterende NSCLC-patienter. Men i multivariat analyse, kun BRF2 udtryk kunne selvstændigt og væsentligt forudsige den samlede 5-års overlevelse på trods af konstateringen af, at høje MVD var signifikant associeret med tumor tilbagefald. Vores data viste, at BRF2 overekspression havde et overvældende indflydelse på OS og PFS, mens MVD viste en signifikant effekt på OS og PFS kun i patienter uden BRF2 overekspression.

Samlet set vores data støtter den antagelse, at BRF2 protein overekspression er almindelig i den tidlige fase NSCLC og signifikant korreleret med tumor angiogenese og tilbagefald. Desuden BRF2 overekspression er en uafhængig prognostisk faktor for NSCLC-patienter.