PLoS ONE: En Antitubulin Agent BCFMT inhiberer spredning af kræftceller og fremkalder celledød ved at hæmme mikrotubulusdynamik

abstrakt

Brug cellebaseret screeningsassay identificerede vi en hidtil ukendt anti-tubulin middel (Z) -5 – ((5- (4-brom-3-chlorphenyl) furan-2-yl) methylen ) -2-thioxothiazolidin-4-on (BCFMT), der inhiberede proliferation af human cervical carcinoma (HeLa) (IC

50, 7,2 ± 1,8 pM), human brystadenocarcinom (MCF-7) (IC

50, 10,0 ± 0,5 pM), stærkt metastatisk brystadenocarcinom (MDA-MB-231) (IC

50, 6,0 ± 1 pM), cisplatin-resistente humane ovariecarcinom (A2780-cis) (IC

50, 5,8 ± 0,3 uM) og multiresistent muse-brysttumor (EMT6 /AR1) (IC

50, 6,5 ± 1 uM) celler. Anvendelse af flere gratis strategier blev BCFMT sig at inhibere cancercelleproliferation ved G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus tilsyneladende ved at målrette mikrotubuli. Desuden BCFMT kraftigt undertrykt dynamikken i individuelle mikrotubuli i levende MCF-7-celler. På halvmaksimal proliferation inhiberende koncentration (10 uM), BCFMT reducerede satserne for dyrkning og afkortning faser af mikrotubuli i MCF-7-celler med 37 og 40%, hhv. Endvidere steg den tid mikrotubuli tilbragt i pausen (hverken vokser eller afkortning påviseligt) tilstand ved 135% og reducerede dynamik i (dimer udveksling per tidsenhed) af mikrotubuli med 70%.

In vitro

, BCFMT bundet til tubulin med en dissociationskonstant på 8,3 ± 1,8 uM, hæmmet tubulin samling og undertrykt GTPase aktivitet af mikrotubuli. BCFMT inhiberede kompetitivt bindingen af ​​BODIPY FL-vinblastin til tubulin med en inhibitorisk koncentration (K

i) på 5,2 ± 1,5 uM tyder på, at den binder til tubulin på vinblastin site. I dyrkede celler, BCFMT-behandling depolymeriseret interfase mikrotubuli, urolig spindlen organisation og akkumulerede checkpoint proteiner (BubR1 og MAD2) ved kinetochores. BCFMT-behandlede MCF-7-celler udviste forøget nukleare akkumulering af p53 og dets nedstrøms p21, hvilket følgelig aktiveret apoptose i disse celler. Resultaterne antydede, at BCFMT hæmmer spredning af flere typer af cancerceller, herunder lægemiddelresistens celler ved at undertrykke mikrotubulusdynamik og indikerede, at forbindelsen kan have kemoterapeutiske potentiale

Henvisning:. Rai A, Surolia A, Panda D (2012) en Antitubulin Agent BCFMT inhiberer proliferation af cancerceller og fremkalder celledød ved at hæmme mikrotubulusdynamik. PLoS ONE 7 (8): e44311. doi: 10,1371 /journal.pone.0044311

Redaktør: Miklos S. Kellermayer, Semmelweis University, Ungarn

Modtaget: April 27, 2012; Accepteret: August 1, 2012; Udgivet: August 31, 2012

Copyright: © Rai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. D.P. understøttes af en DAE-SRC fællesskab, Institut for Atomic energi. SOM. understøttes af en J. C. Bose fællesskab, Indiens regering. A.R. er en slankepille (Rådet for Videnskabelig Industrial Research) fyr. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Medforfatter Avadhesha Surolia er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Udviklingen af ​​resistens over for de eksisterende anticancer narkotika og tumormetastaser er blandt de største hindringer i cancerkemoterapi [1], [2]. Cellebaserede cytotoksicitetsassays har vist sig at være en attraktiv screeningsmetode til at opdage anticancermidler. Flere af de klinisk effektive anticancermidler blev først identificeret ved high throughput screening [3] – [6]. For eksempel blev taxol først opdaget gennem en high throughput cellebaseret screeningsassay [6].

Mikrotubuli er strukturelle komponenter af den mitotiske spindel og de dynamiske mikrotubuli spiller en vigtig rolle i flere cellulære processer, herunder intracellulær transport, celle migration og celledeling [7]. Flere af de mitotiske inhibitorer er kendt for at inhibere mikrotubulussamling [8] – [12] og inhibering af mikrotubulus-samling dynamik har vist sig at være virkningsmekanismen for adskillige klinisk succesrige anticancer lægemidler, herunder vinblastin, vincristin, estramustin og paclitaxel [11 ], [12]. Ud over deres kliniske anvendelser i forskellige typer af sygdomme, herunder cancer, svampe- og parasitiske sygdomme [13], mikrotubuli-inhibitorer er også meget nyttig for forståelsen af ​​rollen af ​​mikrotubuli i de cellulære processer [14], [15]. Mikrotubulus inhibitorer generelt blokerer progression af cellecyklus i mitose og en forlænget mitotisk-arrest udløser forskellige apoptotiske veje [12], [16], [17].

rhodanin afledte forbindelser erhverver opmærksomhed i kemoterapi på grund af tilstedeværelsen af heterocykliske ring (2-thioxothiazolidin-4-on) i moderselskabet stilladser [18]. Udskiftninger på den heterocykliske ring giver en glimrende mulighed for at formulere nye derivater med bred vifte af biologiske aktiviteter [18]. Biologiske aktiviteter af Rhodanine afledte forbindelser er blevet undersøgt i forskellige undersøgelser [18], og disse midler udstillet antibakterielle [19], [20], malaria [21], antiviral [22] og anticancer potentiale [23]. I det foreliggende arbejde, vi havde til formål at finde en ny kemisk enhed med antiproliferative og antimitotiske aktiviteter fra en stor delmængde (et bibliotek af 156 forbindelser) af Rhodanine afledte stilladser med en idé, at stoffet kan have anticancer potentiale.

vi fandt, at tre forbindelser nemlig (E) -5 – ((5- (2-methyl-5-nitrophenyl) furan-2-yl) methylen) -2-thioxothiazolidin-4-on (MNFMT), (E) -5 – (3,5-dichlor-4-hydroxybenzyliden) -3-phenyl-2-thioxothiazolidin-4-on (DHBPT) og (Z) -5 – ((5- (4-brom-3-chlorphenyl) furan-2 yl) methylen) -2-thioxothiazolidin-4-on (BCFMT) inhiberede proliferationen af ​​HeLa og MCF-7-celler i kultur. Blandt disse forbindelser blev BCFMT sig at forøge den mitotiske cellepopulation HeLa og MCF-7-celler mere potent end de to andre forbindelser. BCFMT hæmmede samling af renset tubulin

in vitro

i dyrkede celler, mens MNFMT og DHBPT ikke viste nogen signifikant virkning på tubulin forsamling. Vi opnåede flere linjer af beviser tyder på, at BCFMT udøver sin antiproliferative og antimitotiske aktiviteter ved at dæmpe dynamisk ustabilitet af individuelle mikrotubuli i dyrkede celler gennem bindende på vinblastin websted i tubulin. Desuden BCFMT kraftigt inhiberede proliferationen af ​​lægemiddelresistente nemlig cisplatin resistente humane ovariecarcinom A2780-cis- og multiresistent muse brysttumor EMT6 /AR1-celler og stærkt metastatiske MDA-MB-231-celler antyder, at det kan have kemoterapeutisk potentiale.

Materialer og metoder

Materialer

sulforhodamin B, bovint serumalbumin, muse-anti-α-tubulin IgG, muse-anti-β-actin-IgG, FITC-konjugeret anti-kanin IgG blev opnået fra Sigma, St. Louis, MO, USA. Alexa Fluor 568 ged anti-mus IgG blev indkøbt fra Molecular Probes, Invitrogen, CA, USA. Muse anti-cyclin B1, kanin anti-p-histon H3 (Ser 10), muse-anti-p53 IgG, mus-anti-p21 IgG-antistoffer og apoptose påvisning Kit (Annexin V-propidiumiodid) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, CA, USA. Muse-anti-BubR1 IgG blev opnået fra BD Biosciences, CA, USA. Kanin-anti-MAD2 IgG blev indkøbt fra Bethyl laboratorier, Montgomery, USA. Muse-anti-Hec1 IgG blev indkøbt fra Abcam, Cambridge, MA, USA. Kalvefosterserum blev opnået fra Biowest, Nuaille, Frankrig. Alle andre reagenser var af analytisk kvalitet og fås fra Sigma, MO, USA og Himedia, Mumbai, Indien. Alle testede forbindelser blev opnået fra Chembridge Corporation, San Diego, CA, USA.

Cell Culture

Humant cervical carcinoma (HeLa), human brystadenocarcinom (MCF-7) og metastatisk brystadenocarcinom ( MDA-MB-231) celler blev opnået fra celle repository af Nationalt Center for Cell Science, (NCC’erne) Pune, Indien. NCC’erne præget cellerne ved mt-rDNA sekvens for at bekræfte arten. Disse cellelinjer blev fundet at være fri for mycoplasma. Cisplatin-resistente humane ovarie carcinomaceller (A2780-cis) celler og multiresistente muse-brysttumor (EMT6 /AR1) -celler blev indkøbt fra Sigma, St. Louis, MO, USA. Cellelinie autentificering blev gjort ved kort tandemgentagelse profilering og isoenzym analyse af leverandøren og blev også rapporteret negativ for tilstedeværelsen af ​​mycoplasma. Salg

HeLa og MCF-7-celler blev dyrket i Eagles Minimal Essential Medium (MEM). MDA-MB-231 celler blev dyrket i Leibovitz L-15 Medium. A2780-cis-celler blev holdt i RPMI-1640-medier indeholdende 1 uM cisplatin. EMT6 /AR1 celler blev dyrket i MEM-medium indeholdende 1 ug /ml doxorubicin. Medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2,2 g /l natriumbicarbonat og 1% antibiotisk-antimykotisk opløsning indeholdende streptomycin, amphotericin B og penicillin. Celler blev dyrket og holdt ved 37 ° C inkubator i fugtig atmosfære af 5% CO

2 og 95% luft.

Screening for antiproliferative aktivitet af rhodanin række forbindelser

Den antiproliferative potentiale af 156 Rhodanine afledte forbindelser mod HeLa-celler blev bestemt ved sulforhodamin B-assay [24], [25]. HeLa-celler (1 x 10

5 celler /ml) blev podet i 96-brønds celledyrkningsplader. Lagre af forbindelser blev fremstillet i DMSO. Efter 24 timers podning blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende enten vehikel (0,1% DMSO) eller 2 pM af hver af de Rhodanine forbindelser. Efter 24 timers inkubation med forskellige forbindelser, blev celler fikseret med 10% TCA og bearbejdet til sulforhodamin B-assay [24], [25].

For at bestemme halvmaksimal inhiberende koncentration (IC

50) af MNFMT, DHBPT og BCFMT, 1 x 10

5 celler /ml HeLa og MCF-7-celler blev podet i 96-brønds celledyrkningsplader. Forskellige koncentrationer af forbindelser blev fortyndet i medier og tilsat i brøndene efter 24 timer af cellepodning. HeLa og MCF-7-celler blev dyrket i fravær og nærvær af forbindelser i 24 timer og 48 timer henholdsvis. Inhibering af celleproliferation i nærvær af forbindelser blev bestemt ved anvendelse af standard sulforhodamin B-assay. Data, var i gennemsnit tre uafhængige forsøg.

lysspredning Experiment

Virkningerne af MNFMT, DHBPT eller BCFMT på samlingen af ​​renset tubulin blev overvåget af lysspredning ved 400 nm. Tubulin blev oprenset som tidligere beskrevet [26], [27]. Tubulin (10 uM) i PEM-puffer (25 mM PIPES pH 6,8, 3 mM MgCb

2, 1 mM EGTA) og 1 M glutamat blev inkuberet uden og med forskellige koncentrationer af MNFMT, DHBPT eller BCFMT på is i 10 min. Derefter blev 1 mM GTP tilsat til reaktionsblandingerne og de assembly kinetik blev overvåget ved 37 ° C under anvendelse af en FP-6500 spektrofluorometer JASCO, Tokyo, Japan.

Electron Microscopy

tubulin (10 uM) blev polymeriseret uden eller med 25 og 50 uM BCFMT ved 37 ° C i 15 minutter som beskrevet ovenfor. Prøverne blev fikseret med 0,5% glutaraldehyd, overført til carbon-Formvar overtrukne gitre (Electron Microscopy Sciences, USA) og negativt farvet med 2% uranylacetat. Prøver blev visualiseret under elektronmikroskop (Tecnai G

212, FEI, Eindhoven, Holland).

Effekter af BCFMT på GTPase aktivitet af mikrotubuli in vitro

tubulin (25 uM) i 4 M glycerol, 5 mM MgC

2 og 1 mM GTP blev polymeriseret ved 37 ° C i 30 minutter. Mikrotubuli frø blev dannet ved forskydning polymererne gennem en 23 gauge nål af en 5 ml sprøjte. Tubulin (15 uM) i PEM-puffer og 1 mM GTP blev polymeriseret ved tilsætning af 20% (v /v) mikrotubulus frø ved 37 ° C i 10 min. Efter 10 minutter af polymerisation blev forskellige koncentrationer af BCFMT tilsat til reaktionsblandingerne og yderligere polymeriseres i 30 min. Hydrolysereaktionen blev standset ved tilsætning af 10% (v /v) af 7. M perchlorsyre, og mængden af ​​uorganisk phosphat frigivet blev bestemt ved malakitgrønt assay [28].

Måling af dissociationskonstanten af ​​den bindende af BCFMT til tubulin Brug tryptophanfluorescens af tubulin

tubulin (2 uM) i 25 mM PIPES buffer pH 6,8 blev inkuberet uden og med forskellige koncentrationer af BCFMT ved 25 ° C i 20 minutter. Fluorescensintensiteten blev overvåget ved spændende reaktionsblandingen ved 295 nm, og emissionsspektret blev registreret i området fra 310 nm til 370 nm. En fluorescens celle 0,3 cm lysvej blev anvendt, og fluorescensintensiteterne blev korrigeret for indre filter effekt ved hjælp af formlen

fluorescensdata blev monteret i den følgende ligning, Hvor, bf er ændringen i fluorescensintensiteten af ​​tubulin i nærvær af BCFMT, bf

max er den maksimale ændring i fluorescens-intensiteten af ​​tubulin, når det er mættet med BCFMT og C er koncentrationen af ​​BCFMT. Dissocieringskonstanten (K

d) for BCFMT binding til tubulin blev estimeret ved hjælp af Graph Pad Prism 5 software (Graph Pad Software, CA, USA).

Effekt af BCFMT på BODIPY FL-vinblastin Binding til tubulin

tubulin (2 uM) i 25 mM PIPES buffer pH 6,8 blev inkuberet uden og med 10, 25 og 50 uM BCFMT i 20 minutter ved 25 ° C. BODIPY FL-vinblastin (2 uM) blev tilsat i reaktionsblandingerne og inkuberes ved 25 ° C i yderligere 20 minutter i mørke. Tubulin-BODIPY FL-vinblastin kompleks blev anslået ved 490 nm, og emissionsspektret blev taget i området 500-550 nm [29]. Spektret af BODIPY FL-vinblastin i fravær af tubulin blev også overvåget.

immunfluorescensmikroskopi

MCF-7 eller HeLa-celler blev podet ved en densitet på 5 x 10

4-celler /ml på polylysin-coated glas dækglas i 24-brønds celledyrkningsplade. Efter 24 timers podning blev forskellige koncentrationer af BCFMT tilsat i brøndene. Kontrolceller blev behandlet med vehikel (0,1% DMSO). Efter 24 eller 48 h inkubation med BCFMT blev immunfarvning udført under anvendelse antistof mod α-tubulin, p53, p21, BubR1, cyclin B1, β-actin (1 ° 1:300, 2 ° 1:300 Alexa-568 mærket), phosphohistone-H3 (Ser 10) (1 ° 1:300, 2 ° 1:300 FITC-mærket), Hec 1 (1 ° 1:800, 2 ° 1:800 alexa-568 mærket) og MAD2 (1 ° 1:500 , 2 ° 1:500 FITC-mærket) som tidligere beskrevet [29] – [32]. DNA blev farvet med Hoechst 33258 (1 ug /ml). Billeder blev taget med Eclipse TE 2000U mikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) ved 40 × forstørrelse og behandles med Image-Pro Plus software (Media Kybernetik, Silver Spring, MD).

Målinger af mikrotubulusdynamik i MCF- 7 celler

Transfektion af EGFP-α tubulin konstruere i MCF-7-celler blev udført ved anvendelse af lipofectamin-2000 [29]. De kinetiske parametre for den dynamiske ustabilitet af mikrotubuli blev bestemt som beskrevet tidligere [8], [31] – [34].

Western blot analyse

MCF-7-celler blev inkuberet i fravær og nærvær af 20 og 40 uM af BCFMT i 36 timer. Virkningen på den polymeriserede mængde af mikrotubuli i cellerne blev bestemt ved western blotting under anvendelse af monoklonalt antistof til α-tubulin som tidligere [31] beskrevne. Intensitet af proteinbånd blev beregnet ved hjælp af billede J softwareversion 1.43u.

Virkninger af BCFMT på Kinetik af frigivelsen af ​​Nocodazole-induceret Mitotisk Block i MCF-7 celler

MCF-7 celler blev blokeret i M-fasen af ​​cellecyklussen efter 24 timers behandling med 1 uM nocodazol. For at fjerne nocodazol blev cellerne cytospinned og vaskes forsigtigt tre gange med frisk medium. Efter nocodazol fjernelse blev celler inkuberet i fravær og nærvær af 40 uM BCFMT ved 37 ° C. Celler blev fikseret ved 0, 1, 2 og 4 h inkubation med BCFMT ved 37 ° C inkubator. Fikserede celler blev farvet med Hoechst 33258 og de mitotiske celler blev scoret (n = 3; i hvert sæt 1000 celler blev talt). Salg

Annexin V /PI Staining

MCF-7-celler (5 × 10

4 celler /ml) blev podet på polylysin-coatet dækglas i en 24-brønds celledyrkningsplade. Efter 24 timers podning blev celler inkuberet uden og med forskellige koncentrationer af BCFMT i 48 timer. Cellerne blev opsamlet ved cytospinning ved 2400 rpm ved 30 ° C i 10 minutter. Annexin V /PI farvning blev udført som beskrevet tidligere [30].

Resultater

Effekter af rhodaninderivater om spredning af HeLa og MCF-7 celler

Vi undersøgte antiproliferative potentiale af 156 Rhodanine forbindelser under anvendelse af HeLa-celler. Blandt 156 forbindelser, tre stoffer, nemlig MNFMT, DHBPT og BCFMT (. Figur 1A), viste sig at inhibere HeLa celleproliferation 30% ved 2 uM. MNFMT, DHBPT og BCFMT blev udvalgt til yderligere undersøgelser. MNFMT, DHBPT og BCFMT hæmmede spredning af HeLa (fig. 1B) og MCF-7 (fig. 1C) celler med en halv maksimal hæmmende koncentration (IC

50) af 16,8 ± 1, 7,3 ± 0,4, 7,2 ± 1,8 uM, og 12,2 ± 0,3, 4,9 ± 0,3 og 10,0 ± 0,5 pM, henholdsvis.

(A) strukturer af MNFMT, DHBPT og BCFMT. (B i hvert sæt 1000 celler blev talt) hhv. Resultaterne sammen antydede, at BCFMT blokeret cellerne i mitose stærkere end de to andre midler; derfor, vi nærmere den antimitotiske aktivitet BCFMT.

BCFMT Øget Mitoseindekset af MCF-7 og HeLa celler

I mitotiske celler histon H3 bliver phosphoryleret i serin 10 [36 ] og det anvendes som en markør for mitotiske celler. BCFMT behandling øget antallet af phosphohistone-H3 positive celler (figur S1 i underbyggende oplysninger). For eksempel blev 2 ± 0,5%, 7 ± 1%, og 11,5 ± 1,5% celler fundet at være phosphohistone-H3 positive i fravær og nærvær af 20 og 40 uM BCFMT hhv. Endvidere BCFMT-behandling forøgede metafase /anafase-forhold i MCF-7-celler. I de bærerbehandlede MCF-7-celler blev metafase /anafase forholdet bestemt til at være 2,7 ± 1,2, mens i nærvær af 20, 30 og 40 uM BCFMT blev metafase /anafase-forhold bestemt til at være 5 ± 1, 10 ± 2 (p 0,001) og 15 ± 1 (p 0,001) (n = 3; i hvert sæt 1000 celler blev talt) hhv. Den øgede Mitoseindekset og metafase /anafase-forhold foreslået, at BCFMT inhiberede cellecyklusprogression af MCF-7 celler ved mitose. BCFMT fandt også at undertrykke mitotiske progression af HeLa-celler, som bestemt ved mitoseindeks, phosphohistone-H3 farvning og metafase /anafase-forhold (figur S2 i Støtte Information).

Endvidere BCFMT behandling viste sig at forsinke kinetik for frigivelse af nocodazole- induceret mitotisk blok i MCF-7 celler. For eksempel blev 60% af cellerne fundet i mitose ved nocodazol udvaskning, mens 30%, 15% og 5% celler var i den mitotiske fase efter 1, 2 og 4 timer frigivelse af nocodazol blok. I nærvær af 40 uM BCFMT, 46%, 38% og 30% celler fandtes at være i det mitotiske fase efter 1, kan 2 og 4 timer af blok frigivelse antyder, at BCFMT undertrykke mitotisk progression.

BCFMT hæmmet in vitro tubulinpolymerisations

Siden BCFMT inhiberede cellecyklusprogression i M-fasen af ​​cellecyklussen; Vi undersøgte, om BCFMT kunne forstyrre mikrotubulussamling

in vitro

i dyrkede celler. BCFMT inhiberede samlingen af ​​oprenset tubulin i en koncentrationsafhængig måde (fig. 2A). For eksempel i nærvær af 25, 50 og 100 uM BCFMT, blev omfanget af tubulinpolymerisation inhiberet af 27 ± 3%, 38 ± 4,5% og 64 ± 3%, hhv. Den indledende stigning af lysspredning intensiteten af ​​mikrotubulussamling reaktion blev bestemt til at være 0,97 ± 0,03, 0,54 ± 0,07 og 0,28 ± 0,06 (au /sek) i fravær og tilstedeværelse af 50 og 100 uM BCFMT henholdsvis indikerer at BCFMT stærkt reduceret den oprindelige sats af tubulin forsamling. Elektronmikrografier af kontrollen viste typiske mikrotubuli polymerer (fig. 2B). I nærvær af 25 uM BCFMT, blev fundet færre mikrotubuli pr Observationsfeltet end kontrollen. Det inducerede også sammenlægning af tubulindimerer. I nærvær af 50 uM BCFMT, mikrotubulusdannelse var stærkt hæmmet og kun tubulin aggregater blev fundet (Fig. 2B). Under lignende forhold, DHBPT og MNFMT havde ingen signifikant virkning på mikrotubuli forsamling. For eksempel, 50 uM DHBPT havde ingen påviselig virkning på lysspredning af mikrotubulus-samling og 50 uM MNFMT faldt lysspredningen signal mikrotubulussamling kun med 10%.

(A) tubulin (10 uM) blev polymeriseret i fravær (▪) og tilstedeværelsen af ​​10 (◊), 25 (▴), 50 (x), 75 (○) og 100 (□) iM BCFMT. (B) Elektronmikrografier af tubulin polymerer i fravær og tilstedeværelse af 25 og 50 uM BCFMT. Skalaen bar er 2000 nm. (C) BCFMT undertrykt GTPase aktivitet af mikrotubuli. Virkninger af vinblastin på GTPase aktivitet af mikrotubuli under tilsvarende forsøgsbetingelser, er vist i det indsatte. Data, var i gennemsnit tre uafhængige forsøg. Barer repræsenterer ± SD.

Desuden vi bestemt effekten af ​​BCFMT på GTPase aktivitet af mikrotubuli. BCFMT faldt frigivelsen af ​​uorganisk phosphat i en koncentrationsafhængig måde. For eksempel 20, 30 og 50 uM BCFMT reduceret mængden af ​​uorganisk phosphat frigivet af 17%, 25% og 32%, henholdsvis (fig. 2C). Under lignende forsøgsbetingelser, 1, 2, 4 og 10 uM vinblastin reduceret mængden af ​​uorganisk phosphat frigivet af 12%, 20%, 25% og 35%, hvilket angiver, at BCFMT inhiberer GTPase aktivitet af mikrotubuli som vinblastin (fig. 2C indsat).

Karakterisering af bindingen af ​​BCFMT til tubulin

den iboende tryptophanfluorescens af tubulin har været meget anvendt til at bestemme bindingskonstanten af ​​en ligand til tubulin [37]. BCFMT reducerede iboende tryptophan fluorescensintensitet af tubulin i en koncentrationsafhængig måde (fig. 3A). For eksempel i nærvær af 10 uM BCFMT tryptophanfluorescens af tubulin blev reduceret med 21 ± 2,5%. Montering af fluorescens ændringer i en bindende isoterm kun givet K

d på 8,3 ± 1,8 uM (fig. 3B).

(A) Virkningerne af BCFMT på tryptophanfluorescens spektre af tubulin er vist. Spectra blev overvåget i fravær (♦) og tilstedeværelse af 0,25 (▪), 0,5 (▴), 1 (×), 2 (-), 5 (○), 7 (l) og 10 (•) iM BCFMT. (B) Ændringen i fluorescensintensitet af tubulin (bf) blev plottet mod koncentrationen af ​​BCFMT. Dissociationskonstanten (K

d) for BCFMT binding til tubulin blev anslået under anvendelse af en ligning beskrevet i fremgangsmåderne. Dataene var gennemsnittet af fire uafhængige forsøg. (C) Reduktion i fluorescensintensiteten af ​​tubulin- BODIPY FL-vinblastin kompleks i fravær (♦) og tilstedeværelsen af ​​10 (▪), 25 (▴) og 50 (•) iM BCFMT. (D) tubulin (2 uM) i 25 mM PIPES-buffer (pH 6,8) blev inkuberet uden og med forskellige koncentrationer (5, 10, 15, 20, 25 uM) af BCFMT ved 25 ° C i 20 minutter. Tre sådanne forskellige sæt var forberedt. Efter 20 minutters inkubation, i ét sæt 2 uM (♦), i det andet sæt 4 uM (▴) og i det tredje sæt 6 uM (▪) BODIPY FL-vinblastin blev tilsat. Fluorescens af tubulin-BODIPY FL-vinblastin kompleks blev målt og den inhibitoriske koncentration (Ki) blev beregnet ud fra den modificerede Dixon plot.

Inhibitorer af tubulin samling almindelighed enten binde til vinblastin eller colchicin bindingssteder i tubulin [11], [12]. Derfor har vi undersøgt, om BCFMT binder til tubulin på colchicin websted ved hjælp af colchicin-tubulin fluorescens [38]. BCFMT (10 og 20 uM) ikke hæmme udviklingen af ​​colchicin-tubulin fluorescens indikerer, at det ikke hæmmer bindingen af ​​colchicin til tubulin (Figur S3 i Støtte Information). BODIPY FL-vinblastin er blevet anvendt til at probe bindingsstedet for vinblastin i tubulin [29]. Fluorescensintensiteten af ​​BODIPY FL-vinblastin forøget ved binding til tubulin (fig. 3C). Vinblastin faldt fluorescensen forøgelse af BODIPY FL-vinblastin antyder, at det binder til vinblastin stedet i tubulin. BCFMT faldt også fluorescensen af ​​BODIPY FL-vinblastin-tubulin kompleks på en koncentrationsafhængig måde indikerer, at BCFMT inhiberede bindingen af ​​BODIPY FL-vinblastin til tubulin (fig. 3C). For eksempel 10, 25 og 50 uM BCFMT faldt fluorescensen af ​​BODIPY FL-vinblastin-tubulin kompleks med 40 ± 2,5%, 51 ± 3% og 64 ± 4%, henholdsvis.

Endvidere BODIPY fl- vinblastin viste en signifikant stigning i fluorescenspolarisering værdi, når det var bundet til tubulin (Figur S4 i underbyggende oplysninger). Inkludering af BCFMT i milieu reaktionen faldt polarisationen af ​​BODIPY FL-vinblastin indikerer, at den reducerede binding af BODIPY FL-vinblastin til tubulin. Sammenlignet med kontrol blev 20 ± 3%, 31 ± 4% og 49 ± 2% reduktion i fluorescens polarisering værdier af tubulin-BODIPY FL-vinblastin observeret i nærvær af 10, 25 og 50 uM af BCFMT henholdsvis.

Da BCFMT hæmmede BODIPY FL-vinblastin binding til tubulin, vi undersøgte form for hæmning ved hjælp modificeret Dixon plot [39]. En analyse af den modificerede Dixon plot foreslået, at BCFMT inhiberede bindingen af ​​BODIPY FL-vinblastin til tubulin kompetitivt med en inhiberende koncentration (K

i) på 5,2 ± 1,5 uM (fig. 3D).

A Kort Eksponering af BCFMT depolymeriseret mikrotubuli i MCF-7 celler

for at undersøge effekten af ​​BCFMT på cellulære mikrotubuli, blev MCF-7 celler inkuberet uden og med 40 pM BCFMT i 3 timer. Vehikelbehandlede celler vises typisk netværk af mikrotubuli mens BCFMT (40 uM) behandlede celler viste en signifikant depolymerisering af mikrotubuli (fig. 4A). Mikrotubuli polymerer var ikke synlige i 40 pM BCFMT-behandlede celler; en diffus farvning for opløseligt tubulin blev observeret i de behandlede MCF-7-celler.

(A) Celler blev behandlet uden og med 40 pM BCFMT i 3 timer og mikrotubuli blev farvet under anvendelse af antistof mod α-tubulin (rød) . (B) BCFMT perturbed interfase mikrotubulus organisering af MCF-7-celler. MCF-7-celler blev inkuberet i fravær og nærvær af forskellige koncentrationer af BCFMT i 48 timer. Celler blev fikseret og farvet under anvendelse af antistof mod α-tubulin (rød). (C) BCFMT faldt forholdet polymere /opløselig tubulin i MCF-7 celler bestemt ved Western blot. MCF-7 celler blev behandlet uden (bane 1) eller med 20 pM (bane 4) og 40 pM (bane 5) af BCFMT i 36 timer. 20 nM taxol (bane 2) og 200 nM nocodazol (bane 3) blev også anvendt under lignende forsøgsbetingelser. Polymere og opløselige tubulin fraktioner blev isoleret og lige store mængder proteiner blev påsat SDS-PAGE. Immunoblotting blev udført med α-tubulin antistof. Forsøg blev udført uafhængigt tre gange. Vist er det repræsentative blot. (D) BCFMT depolymeriseret spindel mikrotubuli i MCF-7-celler. DNA farvet i blåt. Scale bar er 10 um.

BCFMT depolymeriseret mikrotubuli af MCF-7 og HeLa Cells

MCF-7 eller HeLa-celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af BCFMT for ét cellecyklus. BCFMT depolymeriseret interfaseceller mikrotubuli i MCF-7 celler på en koncentrationsafhængig måde. For eksempel mikrotubulus-netværket var ikke synligt perturbed i nærvær af 10 uM BCFMT mens 20 uM BCFMT inducerede betydelig depolymerisation af interfasen mikrotubuli og en stærk depolymerisering af mikrotubuli blev observeret i nærvær af 30 uM BCFMT (fig. 4B). Western blot-analyse viste, at forholdet mellem polymere i bærerbehandlede MCF-7-celler, til opløselige tubulin var 2,2 ± 0,3 mens den var 1,2 ± 0,1 og 0,8 ± 0,1 i nærvær af 20 og 40 uM BCFMT henholdsvis antyder, at BCFMT behandling depolymeriserede cellulære mikrotubuli (fig. 4C). Polymeren til opløselig tubulin-forhold i MCF-7-celler blev fundet at være 3,1 ± 0,2 i nærvær af 20 nM taxol og 1,1 ± 0,1 i nærvær af 200 nM nocodazol (fig. 4C). BCFMT-behandling depolymeriseret spindel mikrotubuli i MCF-7-celler og inducerede også dannelsen af ​​monopolare eller multipolære spindler med forskudte kromosomer ved metafaseplade (Fig. 4D). Svarende til dets virkninger på MCF-7 celler, BCFMT depolymeriseres mikrotubuli i HeLa-celler i sin effektive spredning hæmmende koncentration område (Figur S5 i underbyggende oplysninger). Men BCFMT (15 og 30 uM) behandling ikke forstyrrer organiseringen af ​​actin fibre i MCF-7 celler (Figur S6 i underbyggende oplysninger).

BCFMT Undertrykt mikrotubulus genmontering i MCF-7 celler

mikrotubuli blev depolymeriseret ved inkubering MCF-7-celler på is i 1 time og efterfølgende blev de vækstkinetik af interfase mikrotubuli overvåget ved at inkubere cellerne ved 37 ° C. Mikrotubuli af vehikelbehandlede celler voksede hurtigt og opnåede normal interfase netværk inden for 30 min, mens BCFMT (40 uM) behandling kraftigt undertrykt væksten af ​​mikrotubuli (figur S7A i Støtte Information).

Endvidere effekten af BCFMT om de samleprocesser kinetik spindlen i mitotiske MCF-7-celler blev analyseret. Celler blev først blokeret i mitose ved at inkubere dem med 1 pM nocodazol i 20 timer. Celler blev omhyggeligt vasket med frisk medium og yderligere inkuberet på is i 30 minutter uden og med 40 pM BCFMT. Efterfølgende blev cellerne anbragt ved 37 ° C, og genmontering kinetik af spindlen mikrotubuli blev overvåget ved farvning af mikrotubuli med forskellige tidsintervaller. I kontrol celler, polymeriseret spindel mikrotubuli hurtigt og næsten normale spindler blev observeret inden for 30 min forsamlingsfrihed (figur S7B i Støtte Information, hvid pil).