PLoS ONE: Derricin og Derricidin Inhibit Wnt /β-Catenin Signaling og Undertryk Colon Cancer Cell Growth I Vitro

Abstrakt

Overaktivering af Wnt /β-catenin vej hos voksent væv har været impliceret i mange sygdomme, såsom colorektal cancer. Finde kemiske stoffer, der kan forebygge dette fænomen er en spirende problem. Senest er flere naturlige forbindelser blevet beskrevet som Wnt /β-catenin-inhibitorer og kan være lovende midler til bekæmpelse af carcinogenese. Her beskriver vi to naturlige stoffer, derricin og derricidin, der tilhører den chalcon underklasse, der viser potent transkriptionel inhibering af Wnt /β-catenin pathway. Begge chalkone er i stand til at påvirke cellen fordeling af β-catenin, og hæmme Wnt-specifikke reporter aktivitet i HCT116 celler og i

Xenopus

embryoner. Derricin og derricidin også stærkt hæmmet kanonisk Wnt aktivitet

in vitro

, og reddede den Wnt-induceret dobbelt akse fænotype i

Xenopus

embryoner. Som følge af Wnt /β-catenin-inhibering, derricin og derricidin behandlinger reducerer cellernes levedygtighed og føre til standsning af cellecyklus i kolorektale cancercellelinjer. Tilsammen vores resultater støtter stærkt disse chalkone som nye negative modulatorer af Wnt /β-catenin vej og tyktarmskræft cellevækst

in vitro

Henvisning:. Fonseca BF, Predes D, Cerqueira DM, Reis AH, Amado NG, Cayres MCL, et al. (2015) Derricin og Derricidin Inhibit Wnt /β-Catenin Signaling og Undertryk Colon Cancer Cell Growth

In Vitro

. PLoS ONE 10 (3): e0120919. doi: 10,1371 /journal.pone.0120919

Academic Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA

Modtaget: Juni 25, 2014, Accepteret: 9. februar 2015; Udgivet: 16 Mar 2015

Copyright: © 2015 Fonseca et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af brasilianske finansieringsorganer Conselho Nacional de Desenvolvimento científico e Tecnologico, Fundação de Amparo en Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro, og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel overlegen .

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Wnt /β-catenin signalering er den vigtigste årsag til mange forskellige neoplasier, og har. et tæt samarbejde med kolorektal cancer (CRC). Ca. 80% af alle CRCs har mutationer i Wnt komponenter, hvilket resulterer i overaktivering af vejen i kolon celler. De mest almindelige mutationer resulterer i APC tab af funktion, som er negative regulatorer af denne signalvej; og forstærkning af funktion mutationer i β-catenin, det vigtigste effektor proteinet ifølge denne signalering [1,2,3,4]. Disse mutationer forårsager ukontrolleret overekspression af flere onkogener og cellecyklus-gener, især i celler afledt fra de intestinale krypter [5].

CRC er en ondartet sygdom med høj forekomst, og den tredje mest almindeligt diagnosticeret cancer i verden [6]. Det er vanskeligt at behandle; kirurgi og adjuvans lægemidler anvendes almindeligvis, men helbrede kun en lille procentdel af tumorer [7]. CRC er stærkt forbundet med genetiske sygdomme, som er et resultat af mutationer i vigtige cellecyklus og apoptose regulatoriske gener, såsom KRAS, TP53 og BRAF [8]. Derudover kan CRC også være resultat af humane ernæringsmæssige mønstre. Det er blevet vist, at et højt forbrug af plantebeskyttelsesmidler oprindelse fødevarer er relateret til en reduktion af CRC forekomst, på grund af de store mængder af naturlige antitumorforbindelser såsom flavonoider og andre polyphenoler [7,9]. Salg

Flavonoider er polyphenolforbindelserne fundet i mange planter og har en bred vifte af biologiske virkninger. Fordi flavonoider er en stor del af den menneskelige kost, er de blevet intensivt undersøgt med hensyn til deres gavnlige virkninger i mange humane sygdomme, såsom cancer. De har anti-proliferative, anti-invasive og pro-apoptotiske virkninger [10,11,12]. Mange flavonoider beskrevet som Wnt hæmmere har interessante effekter på CRC kontrol og også bidrage til at forebygge denne sygdom [13,14,15,16,17]. De flavonoider EGCG og quercetin er blevet rapporteret som lovende anti-cancer medicin [18,19]. Blandt effekterne af disse flavonoider er regulering af signalveje, der er tæt forbundet med kræft, såsom Wnt /β-catenin signalering, selv om ingen af ​​dem er lykkedes som et effektivt lægemiddel til behandling af cancer.

Her vi undersøgte effekten af ​​to lidet kendte flavonoider, derricin og derricidin, som blev udvundet fra

Lonchocarpus sericeus

[20]. Derricin og derricidin er i stand til at reducere CRC vækst

in vitro

, ved at styre cellecyklusprogression. Desuden derricin og derricidin stærkt hæmmede Wnt8-induceret dobbelt akse i

Xenopus

embryoner, som i høj grad indikerer, at disse flavonoider er modulatorer af Wnt /β-catenin vej.

Materialer og metoder

Cellelinjer, kemikalier og reagenser

Alle cellekulturreagenser blev erhvervet fra Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Dimethylsulfoxid (DMSO) og anti-β-catenin blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Sekundære antistoffer blev købt hos Life Technologies (CA, USA). Anvendte cellelinjer var HEK293T, L-celle, L-Wnt3a, HCT116, DLD-1 og IEC-18 (ATCC) og RKO-pBAR /

Renilla

[21]. De chalkone derricin og derricidin anvendt i denne undersøgelse blev udtrukket og renses ved Nascimento og Mors (1972) [20].

Wnt-luciferasereporter Analyser

RKO-pBAR /

Renilla

celler blev dyrket på plader med 96 brønde, med 1,0 x 10

4 celler /brønd i DMEM-High Glucose med 10% føtalt bovint serum (Gibco). Efter konfluens blev cellerne behandlet med derricin (10, 20 eller 50 uM) eller derricidin (10, 20 eller 50 uM) i nærvær af Wnt3a konditioneret medium [22], i yderligere 24 timer. L-celle konditionerede medium blev anvendt som negativ kontrol. DMSO blev også tilsat som vehikelkontrollen. Efter 24 timers behandling, Firefly og

Renilla

luciferaseaktiviteter blev påvist ifølge fabrikantens protokol (Dual Luciferase Reporter Assay System, Promega).

HEK293T og HCT116 blev dyrket på plader med 96 brønde med 1,0 x 10

4 celler /brønd i DMEM-F12 med 10% føtalt bovint serum (Gibco). Efter 70% sammenløb blev nået, blev hver brønd transficeret med 50 ng TOP-Flash eller FOP-Flash-plasmider, 5 ng TK

Renilla

-luciferase, med eller uden β-catenin [23]. Transfektionen anvendte reagens var Lipofectamin (Invitrogen). 15h efter transfektion blev celler behandlet med chalconer i nærvær af Wnt3a konditioneret medium, i 24 timer, ved anvendelse af 10, 20 eller 30 uM derricin eller 10, 20 eller 30 uM derricidin. Den næste dag, Firefly og

Renilla

luciferaseaktiviteter blev påvist ifølge fabrikantens protokol (Dual Luciferase Reporter Assay System, Promega).

Embryo manipulationer.

Frog eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der ydes af Animal Care og brug Etik Udvalg (Comissão de Etica ingen Uso de Animais-CEUA) i Federal University of Rio de Janeiro og blev godkendt af dette udvalg under tilladelse nummer 152/13. Voksne frøer (Nasco Inc., WI, USA) blev stimuleret med humant choriongonadotropin (Sigma, St. Louis, MO, USA).

Xenopus

fostre blev opnået ved

in vitro

befrugtning og iscenesat efter Nieuwkoop og Farber [24]. Alle eksperimenter blev udført ved 22 ° C. For syntetisk xWnt8 mRNA blev plasmidet lineariseret med NotI og transkriberet med SP6-RNA-polymerase under anvendelse af mMessage mMachine kittet (Applied Biosystems). Fire-celle-embryoer blev injiceret i den ventrale randzone for at inducere sekundær akse formation. Desuden blev fire-celle-embryoer co-injiceret med 10 pg /embryo af xWnt8 mRNA plus 0,4 pmol /embryo af hver chalcon eller 250 pg af Wnt /β-catenin luciferasereporterplasmid (S01234-Luc) og 50 pg TK –

Renilla

at udføre embryo luciferaseassays. Efter injektion blev embryoner opretholdt i 0,1 x Barth (8,89 mM NaCl, 0,1 mM KCI, 0,24 mM NaHCO

3; 0,08 mM MgSO

4.7H

2O, 1 mM Hepes, 0,03 mM Ca (NO

3)

2,4H

2O; 0,04 mM CaCl

2,2H

2O; pH 7,7), indtil trin 27 når de fænotyper blev analyseret, eller indtil gastrula-stadiet (st 10), når luciferaseaktivitet blev påvist ifølge fabrikantens protokol (Dual luciferase Reporter assay System, Promega).

MTT-assayet.

3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) blev anvendt til analyse mitokondrielle aktivitet i levedygtige celler. Celler blev udpladet ved en koncentration på 1,0 x 10

4 celler /brønd i 96-brønds vævskulturplader i DMEM F-12-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og dyrket i 24 timer før behandling med chalconer (10, 20, 30, 50 eller 100 uM) for 0, 24, 48 eller 72 timer. MTT blev tilsat til hver brønd ved en slutkoncentration på 150 mg /ml i 4 timer før cellehøst. Formazan reaktionsprodukt blev opløst med DMSO og kvantificeret spektrofotometrisk ved 570 nm (Modulus II mikroplade multimode reader).

Immunfarvning.

HCT116-celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd, vasket med PBS, og permeabiliseret med 0,1% Triton X-100. Prøver blev derefter blokeret i 1 time med 5% bovint serumalbumin. En kanin-anti-β-catenin (1: 200) primært antistof blev inkuberet natten over. Specifikke sekundære antistoffer konjugeret med Cy3 fluorochrom (1: 5000) blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Efter PBS vasker, DAPI farvning (4,6-diamidino-2-phenylindol) (cellesignalering) blev udført i 5 min, og derefter blev objektglassene monteret med FluorSave (Calbiochem) og observeret i et Nikon TE 2000 S omvendt mikroskop (Melville , NY, USA). Billeder blev taget med et CoolSNAP-Pro (Media Kybernetik, Bethesda, MD, USA) digital kamera, med en zoom på 100x og 600x.

Cell proliferation assay

For celleproliferationsassay, 5 blev 0 x10

4 celler udsået på den foregående dag og behandles med 30 pM eller 50 pM derricin eller derricidin i 24 timer. Click-iT edu (Life Sciences) assay blev udført ifølge producentens protokol. DMSO blev anvendt som et middel til at solubilisere flavonoider og sattes til kontrolkulturer betingelser ved 0,5%.

Cellecyklusanalyse.

Cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse af flowcytometri. Celler blev skyllet kort med calcium og PBS og fritliggende med trypsin ved stuetemperatur. Efter centrifugering 1 × 10

6 celler blev suspenderet i 0,5 ml iskold Vindeløv opløsning [25] indeholdende 0,1% Triton X-100, 0,1% citratpuffer, 0,1 mg /ml RNase og 50 ug /ml propidiumiodid ( Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Efter 15 minutter blev cellerne analyseret for DNA-indhold ved hjælp af et FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Levende celler blev analyseret efter DNA-indhold. Celler viser fragmenterede DNA og mulige dubletter blev udelukket fra analysen. Cellerne med diploid DNA-indhold (2n, G0-G1 fasen), syntese DNA ( 2n men 4n, S fase), og det bliver gentaget DNA (4n, G2 /M fase) blev erhvervet og analyseret ved hjælp CellQuest og WinMDI 2.9 software, henholdsvis.

Statistisk analyse.

Hvert forsøg blev udført mindst tre gange. Luciferase, cellecyklus og MTT-assays blev udført tre gange. Cellefarvning kvantificering blev udført ved at tælle antallet af DAPI og antallet af ikke-nukleare og nukleare β-catenin farvede celler i tilfældigt valgte mikroskopfelter, og derefter andelen af ​​ikke-nukleare og nukleare celler af de totale celler blev beregnet. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af uparret Students t-test. I MTT-assays, brugte vi to-vejs ANOVA efter en Bonferroni post-test (GraphPad Prism-version 5.00, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). I

Xenopus

Wnt /β-catenin reporter assay vi brugte en-vejs ANOVA efter en Kruskal-Wallis (GraphPad Prism-version 6.00, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Statistisk signifikans sat til * P 0,05, ** P 0,01, og *** P 0,001

Resultater

Derricin og derricidin hæmme udbredelsen af ​​CRC’er cellelinjer

Mange naturlige forbindelser, herunder flavonoider, kan påvirke celleproliferation og apoptose og er således vigtige kandidater til kræft kontrol. Vi udførte en lille produktion Wnt specifik reporter assay til at screene naturlige forbindelser udvundet fra forskellige brasilianske planter (data ikke vist). Blandt inhibitorer, fandt vi en detekterbar Wnt /β-catenin inhibering aktivitet vises af chalconer derricin og derricidin (fig. 1). Her har vi brugt to CRC cellelinjer, HCT116 og DLD-1, og undersøgt, om derricin og derricidin kunne påvirke væksten kolon celler. Vi undersøgte også den chalconer virkning i IEC-18, et ikke-transformeret cellelinie afledt fra rotte tarmen epitel. Først behandlede vi disse celler ved forskellige koncentrationer (10-100 uM) af disse chalconer til forskellige behandlingsperioder (0-72 h), og analyseret cellelevedygtighed, gennem MTT assay. I HCT116, observerede vi en signifikant fald i cellelevedygtighed ved 100 uM af derricin i de første 24 timers behandling. Efter 48 timers behandling, 20 uM derricin kunnet reducere MTT absorbans (Fig. 2A). Derricidin havde lignende effekt på HCT116 og også reduceret cellelevedygtighed i en koncentrations- og tidsafhængig måde (Fig. 2B). Desuden behandling med derricin og derricidin faldt antallet af HCT116 celler, opnå ca. 58% og 65% reduktion af DAPI-farvede kerner med 50 uM derricin og derricidin henholdsvis (fig. 2C). I DLD-1, kunne derricin reducere cellernes levedygtighed ved 100 uM koncentration med en mildere effekt på 18 timer og en intens reduktion efter 48 timers behandling (Fig. 2D). Derricidin, på den anden side, havde en stærkere virkning i DLD-1, som 50 uM dette chalcon var tilstrækkelig til falde kraftigt cellernes levedygtighed efter 18 timers behandling (fig. 2e). Disse chalconer var også i stand til at formindske antallet af DLD-1-celler i kultur, opnå ca. 50% og 70% af reduktion med 50 uM derricin og derricidin henholdsvis (fig. 2F). Når vi analyserede effekten af ​​derricin og derricidin i celle levedygtighed IEC-18 celler, kunne vi konstatere, at begge flavonoider falde MTT absorbans, der starter ved 18 timer af behandlingen på 100 pM. Interessant nok blev der ikke effekter i cellelevedygtighed detekteret ved lavere koncentrationer (Fig. 2G, H). Endvidere 50 uM derricin og derricidin behandling resulterede i en maksimal reduktion på 32% og 38% af IEC-18 celleantal (fig. 2i).

(A, B, D, E, G, H) Grafer viser MTT absorbans niveauer i HCT116, DLD-1 og IEC-18 cellelinjer, efter behandling på op til 72 timer med 10-100 uM derricin eller derricidin. (A) I HCT116 celler, er det observeret signifikant reduktion i cellelevedygtighed efter 100 uM derricin i 24 timer og 20 uM derricin i 48 timer (B) Efter derricidin behandling, reduktion af cellelevedygtighed forekom ved 100 uM derricidin efter 24 h og ved 30 uM efter 72 timer. (D) I DLD-1 celler, observeres det en mildere virkning ved 100 uM efter 18h behandling. Ellers en intens reduktion af MTT absorbans opdaget efter 48h behandling med 100 pM af derricin. (E) Derricidin behandling reducerer DLD-1 cellelevedygtighed efter 18h behandling med 50 pM af flavonoid og ved 20 pM efter 72 timer. (G) i IEC-18 celler, er reduktionen af ​​levedygtighed observeret med 100 uM af derricin, begyndende ved 18 timer af behandlingen. (H) En lignende profil er observeret efter derricidin behandling. (C, F, I) DAPI-farvede kerner blev talt efter 24 h behandling med derricin og derricidin. (C) 30 og 50 uM af derricin reduceres med ca. 30% og 58% af antallet af HCT116 kerner, henholdsvis; mens derricidin reduceret ca. 39% og 65%, hhv. (F) DLD-1 kerner blev reduceret ca. 44% og 50% efter derricin behandling på 30 og 50 pM koncentrationer hhv. Derricidin behandling formindsket omkring 50% og 70%, hhv. (I) IEC-18 kerner blev også nedsat, med værdier på 25% og 32% af reduktion med 30 og 50 uM af derricin henholdsvis og 40% og 38% med 30 og 50 uM af derricidin hhv. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001

Vores første analyser viste, at derricin og derricidin var i stand til at mindske cellernes levedygtighed, hvilket tyder på, at begge flavonoider påvirker kræft cellevækst . For at teste, om derricin og derricidin kunne inhibere proliferation af CRCs cellelinier, udførte vi Edu-inkorporering assay. Vi bemærkede, at begge chalconer kunne reducere antallet af prolifererende celler, ved 30 og 50 um, i alle cellelinjer (fig. 3 A-O ‘). Efter kvantificering, var det muligt at observere at 30 uM af begge chalconer inhiberer ca. 40% af celleproliferation i HCT116 og ca. 50% i DLD-1 (fig. 3 P, Q). Interessant, 30 uM af begge flavonoider kunne inhibere kun omkring 20% ​​af celleproliferation i IEC-18, der indikerer en forskel i regulering af celledeling af tumorale og ikke-tumor cellelinier (fig. 3R).

Edu inkorporering i kolon celler efter behandling med 30 og 50 uM af derricin og derricidin for 24 timer. (A, A ‘, B, B’, C, C ‘) I kontrolforsøg betingelser, observeres det et betydeligt antal Edu-positive celler. (D, D ‘, E, E’, F, F ‘, G, G’, H, H ‘, I, I’) Efter behandling med derricin, det er konstateret et lavere antal Edu-positive celler. (J, J ‘, K, K’, L, L ‘, M, M’, N, N ‘, O, O’) Derricidin behandling reducerer også Edu-positive celler. (P, Q, R) Kvantificering af Edu-positive celler i HCT116, DLD-1 og IEC-18. Scale bar 50 um, ** p 0,01, *** p. 0,001

Vi næste spurgte, om disse effekter kunne relateres til cellecyklusstop. For at gøre dette, vi behandlede HCT116, DLD-1 og IEC-18 celler med hver flavonoid for 96 timer og kvantificeres procentdelen af ​​celler i forskellige cellecyklus faser (fig. 4). DMSO-behandlede HCT116-celler var hovedsagelig ved G1 /G0 cellecyklussen fase (fig. 4A, i M1-regionen). Derricin behandling inducerede betydelig forstyrrelse i disse diploide celler, som faldt celletal i G1 /G0 fase til 67,6% og 54%, når de behandles med 30 og 50 uM af dette flavonoid, (fig. 4A, i M1-regionen). Derricin påvirket cellecyklussen på en dosis-afhængig måde, i betragtning af at 30 uM stop for cellecyklus i S-fasen og 50 uM stop for cellecyklus i G2 /M-fasen (fig. 4A, D). Derricidin blev også evalueret for dets evne til at styre cellecyklussen. Behandling med 30 uM og 50 uM derricidin reducerede procentdelen af ​​diploide celler til 53,8% og 35,5%, henholdsvis og inducerede betydelig cellecyklusstandsning i G2 /M-fasen i begge koncentrationer (fig. 4E). Hyppigheden af ​​DLD-1 celler indeholdende duplikeres DNA-indhold var ca. 50% i kontrolceller og steg til 30,3% og 59,3% af cellerne efter behandling med 30 pM og 50 uM derricidin. På den anden side, levende DLD-1 adenocarcinomaceller akkumuleret på G0 /G1-fasen af ​​cellecyklussen efter 30 uM og 50 uM derricin (fig. 4B, i M1-regionen). 31,6% af cellerne var i G0 /G1-fasen i ubehandlede eller DMSO-behandlede betingelser. Dette nummer opnår 66,9% og 65,7% af cellerne i 30 pM og 50 uM af henholdsvis derricin. Disse resultater indikerer også en ikke-afhængige dosisrespons af derricin behandling (fig. 4F). Lignende effekter blev observeret, når vi behandlet disse cellelinje med derricidin ved begge koncentrationer (fig. 4B, i M1 region, 4G). Interessant, IEC-18 præsenteret en svag cellecyklus fasemodulation i begge derricin og derricidin behandlinger, bortset fra en mildere virkning ved 50 uM derricin (fig. 4C, H, I). Tilsammen viser disse data en anti-proliferative effekt af derricin og derricidin, der fungerede ved at arrestere cellecyklus i HCT116 og DLD-1 tumorcellelinier.

(A, D, E) I HCT116, ubehandlet celler viste omkring 75% af celler i G1 /G0 fase mens 30 og 50 uM derricin reduceret denne andel til 67,6% og 54%, henholdsvis, hvilket resulterer i standsning af cellecyklus i S og G2 /M-faser, henholdsvis. Derricidin reduceret denne andel til 53,8% og 35,5%, henholdsvis og inducerede også standsning af cellecyklus i G2 /M-fasen. (B, F, G) På den anden side, DLD-1 celler akkumuleret i G0 /G1-fasen af ​​cellecyklussen efter 30 uM og 50 uM derricin eller derricidin. (C, H, I) Derricin og derricidin behandling havde mildere effekter i cellecyklusprogression af IEC-18 celler, bortset fra en lidt arrestere på G2 /M med 50 uM derricin. Søjlediagrammer repræsenterer procentdelen af ​​celler ifølge behandling og væsentlige data blev repræsenteret i figuren. Sorte bjælker: G0 /G1 fasen; Hvide søjler: S-fase; og grå bjælker:. G2 /M faser

Derricin og derricidin så potente inhibitorer af Wnt /β-catenin signalering

Deregulering i kanonisk Wnt signalering er nært beslægtet med kolon kræftceller [ ,,,0],1,3]. For eksempel HCT116 celler har en mutation i et CTNNB1 gen, som koder β-catenin-protein, og således har en høj aktivitet af Wnt /β-catenin pathway [2]. Vi spurgte, om de levedygtighed celle og cellecyklus-anholdelse effekter af derricin og derricidin i HCT116 celler skyldtes modulation af Wnt /β-catenin signalering. Vi analyserede først den cellulære fordeling af β-catenin. I ubehandlede eller DMSO-behandlede celler, blev β-catenin protein fundet i kerner af næsten 50% af cellerne (fig. 5A, B, C, J). Men når vi behandlede celler med derricin, kun 25% af celler viste, nuklear farvning med β-catenin (fig. 5D, E, F, J). I tilfælde af derricidin, 26% af celler viste nukleare β-catenin, hvilket også var en signifikant reduktion i nuklear farvning (Fig. 5G, H, I, J). Fordi disse resultater støtter en mulig Wnt /β-catenin-inhibering, vi rettet Wnt-vejen aktiveringstilstanden mere direkte, ved at udføre Wnt /β-catenin specifikke reporter assays på HCT116 transficeret med TOPFlash plasmid. Konsekvent med tidligere data, derricin og derricidin specifikt hæmmede Wnt reporter aktivitet (fig. 5K). Disse resultater viser, at derricin og derricidin var i stand til at inhibere Wnt /β-catenin pathway i HCT116 tumorcellelinie.

(AI) β-catenin immunfarvning af HCT116-celler behandlet med 30 pM af hver chalcon i 24 h. (A-C) Under kontrolbetingelser, størstedelen af ​​celler viser β-catenin farvning af nucleus. (D-F) Efter behandling med derricin, er denne farvning tabt, og de fleste celler udviser β-catenin i cytoplasmaet og membranen. (G-I) Derricidin behandling reducerer også nuklear farvning af β-catenin. (J) Kvantificering af immunfarvning viste, at begge chalconer reducere nukleare β-catenin. (K) Wnt /β-catenin specifik reporter assay af TOPFlash /

Renilla

transficeret HCT116 celler. Begge chalconer reducere Wnt reporter aktivitet efter 30 og 50 pM behandling i 24 timer. Målestok:. 50 uM, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

Vores forsøg med HCT116 kraftigt, at derricin og derricidin er potente hæmmere af kanonisk Wnt signalering . For at løse denne effekt mere specifikt, vi udførte klassiske eksperimenter til at analysere Wnt pathway regulering, dvs. luciferase reporter-gen-analyser i RKO-pBAR /

Renilla

celler og HEK293T celler. Disse celler blev behandlet med 10, 20 eller 50 uM derricin i nærvær af Wnt3a konditioneret medium. Derricin nedsatte Wnt reporter-aktivitet i en koncentrationsafhængig måde i begge cellelinier (fig. 6A, C). Derricidin behandling var også i stand til at mindske Wnt reporter aktivitet, selv om den højeste inhibering kun blev opnået, når celler blev behandlet med 50 pM (Fig. 6B, D). Vi observerede en lille reduktion i Wnt reporter aktivitet efter behandling med 20 pM derricidin. At vide, om derricin og derricidin handle opstrøms eller nedstrøms til effektor protein β-catenin, vi aktiveret Wnt signalering ved transfektion de HEK293T celler med β-catenin og evaluerede chalkone hæmning effekter. Derricin var i stand til at inhibere β-catenin aktivering af Wnt-vejen, mens derricidin ikke var, hvilket antyder, at derricin virker nedstrøms for β-catenin mens derricidin handlinger opstrøms (fig. 6E). Disse data viser, at derricin og derricidin opføre sig som inhibitorer af Wnt /β-catenin-signalvejen, men i forskellige koncentrationer og i forskellige niveauer af denne signalering.

(A, C) Derricin inhiberer Wnt-reporter aktivitet start ved 10 pM i luciferaseassays af RKO-pBAR /

Renilla

og HEK293T. (B, D) Derricidin lidt hæmmer Wnt-reporter aktivitet ved 20 uM i RKO-pBAR /

Renilla

HEK293T. I RKO-pBAR /

Renilla

, er højere hæmning opnås ved 50 uM derricidin (B). (A, B) 10, 20, 50 pM af hver chalcon. (C, D) 10, 20, 30 pM af hver chalcon. (E) HEK293T aktivering af Wnt signalering via transfektion af β-catenin undertrykkes ved derricin behandling, men ikke derricidin. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001

Derricin og derricidin hæmme dobbelt akse dannelse i

Xenopus

embryoner og undertrykke Wnt /β-catenin luciferase reporter aktivitet

in vivo

Wnt-induceret sekundær akse dannelse i

Xenopus

er relateret til overaktivering af Wnt /β-catenin signalering under udviklingen af ​​

Xenopus

embryoner og dermed negative modulatorer af denne vej er i stand til at vende eller reducere dobbelt akse fænotype [26,27]. Som vores data kraftigt indikerede, at disse flavonoider er hæmmere af kanoniske Wnt signalering, besluttede vi at analysere evne derricin og derricidin at påvirke Wnt-induceret dobbelt akse dannelse i

Xenopus

embryoner. Vi co-injicerede embryoner med

x

Wnt8 mRNA og derricin eller derricidin i ventrale blastomeres af 4-celle-stadie

Xenopus

embryoner. Vi observerede, at ca. 73% af fostrene vises en sekundær akse efter

x

Wnt8 injektion (fig. 7B, E, F). Imidlertid co-injektion af

x

Wnt8 med derricin eller derricidin reducerede induktionen af ​​ektopisk akse (fig. 7C, D). Co-injektion med derricin var i stand til at reducere den dobbelte akse med 43%, mens derricidin reduceret det med 41% (fig. 7E, F). Desuden har vi udført luciferase eksperimenter ved at indsprøjte plasmidet S01234-Luc på den ventrale side af

Xenopus

embryoner. Denne

siamois

-reporter er i stand til at reagere på den Wnt signalering aktivering induceret af co-intravenøse af xWnt8 mRNA. Vi injiceret samtidigt 0,4 pmol /embryo af derricin og derricidin at teste, om de kan inhibere reporter aktivering. Som følge heraf begge chalconer reducerede reporteraktivitet signifikant (fig. 7G). Disse data indikerer, at derricin og derricidin også kan hæmme Wnt /β-catenin vej

in vivo

i

Xenopus laevis

embryo model.

Repræsentative billeder af fostre co- injiceret med xWnt8 mRNA plus DMSO (B) eller xWnt8 mRNA plus derricin eller derricidin (C, D). Overhold ufuldstændige dobbelt akse dannelse eller sekundær akse ablation i embryoner injiceret med chalkone. (E-F) Grafer viser procentdele af embryo fænotyper. Bemærk at co-injektion af chalconer med xWnt8 mRNA reduceret andelen af ​​embryoner med dobbelt akse, og øget andelen af ​​normale embryoner med en akse. (G)

Xenopus

embryoner injiceret med S01234 reporter +

Renilla

, xwnt8 (10 pg) med DMSO eller chalkone (0,4 pmol /embryo). Aktiveringen af ​​reporteren blev forhindret ved chalcon-injektion. Pilehoveder: cement kirtel; pil: ufuldstændig dobbelt akse; A-P: anterior-posterior akse

Diskussion

Flavonoid forbrug har længe været forbundet med forebyggelse, kontrol og behandling af forskellige menneskelige kræftformer [28].. Med hensyn til colorektal cancer, har mange flavonoider blevet forbundet med kontrol og forebyggelse af denne sygdom [9,16-18]. Chalconer, for eksempel kan tilbyde fordele som antitumormidler, sammenlignet med andre flavonoider, fordi de har lidt interaktion med DNA og således en lav risiko for mutagenese [29]. I denne undersøgelse viste vi, at to flavonoider (fig. 1), fra chalcon underklasse har potente anti-proliferative virkninger i kolorektal tumorcellelinier, HCT116 og DLD-1. Derricin og derricidin både stærkt hæmmet totale celletal og levedygtighed af disse celler

in vitro

(fig. 2) og også reduceret HCT116 og DLD-1 celledeling i lignende niveauer efter 24 timer (Fig. 3). Vi analyserede også derricin og derricidin effekter i IEC-18, et ikke-transformeret epitelcellelinie. Cellelevedygtighed blev kun forringet ved højere koncentrationer, anderledes af hvad der sker i HCT116 og DLD-1-celler. Desuden 30 pM af begge chalconer havde en lidt bevirke i IEC-18-celleproliferation, mens der blev observeret en reduktion på ca. 50% i HCT116 og DLD-1-celler. Disse resultater antyder en mulig virkning mere begrænset til CRC-celler.

Derricin og derricidin virkninger er relateret til modulation af cellecyklusprogression, hovedsagelig ved at ændre procentdelen af ​​celler i G2 /M og S faser af cellecyklus i HCT116 og G0 /G1 i DLD-1 (fig. 4). Interessant derricin og derricidin cellecyklusstop forekommer i forskellige faser af cellecyklus i hver cellelinie. Disse virkninger kan være relateret til en specifik flavonoid virkning i modulering af forskellige regulerende proteiner, og forskelle i baggrunden af ​​muterede gener i hver cellelinje kan forklare disse forskellige virkninger [30]. Desuden derricin og derricidin havde nogen signifikante virkninger i IEC-18, et ikke-tumorcellelinie. Disse resultater kan korreleres med andre rapporter om vigtige cytotoksiske virkninger af disse flavonoider [31,32]. Andre chalkone besidder apoptotiske og antiproliferative effekter [33,34,35].

Nylige undersøgelser har forbedret forståelse af de virkningsmekanismer af flavonoider. For eksempel mange flavonoider er modulatorer af forskellige signalveje, såsom Wnt /β-catenin, der er ofte forbundet med colorektal tumor progression [1,2,3,5,36]. I denne undersøgelse observerede vi, at antitumorvirkninger af derricin og derricidin kan relateres til Wnt pathway modulation fordi de væsentligt reduceret kernelokalisering af β-catenin og reduceret Wnt-reporter-aktivering i HCT116-celler (fig. 5). For bedre at forstå effekten på Wnt signalering i disse chalkone, vi udførte gen-reporter analyser i RKO-pBAR /

Renilla

HEK293T cellelinjer, som er klassisk bruges til at undersøge denne vej [21,26]. Derricin inhiberede stærkt Wnt signalering ved en koncentration på 10 uM, mens derricidin nået lignende inhibitoriske niveauer kun på 50 uM i begge cellelinier (fig. 6A, C). Også derricin og derricidin inhibere Wnt signalering gennem forskellige mekanismer, da derricin er stand til at modvirke β-catenin Wnt signalering aktivering, mens derricidin er ikke (fig. 6E). Denne forskel i kz-relaterede virkninger af de to chalkone kan være relateret til deres kemiske strukturer og /eller i den måde, at de interagerer med Wnt komponenter eller celle rum, som har dybtgående virkninger på deres styrke og selektivitet.