PLoS ONE: Kvantitative Tilsyneladende diffusionskoefficient Målinger opnået ved 3-Tesla MR er korreleret med Biomarkører for blærekræft proliferative aktivitet

Abstrakt

Formål

For at undersøge sammenhængen mellem tilsyneladende diffusionskoefficient (ADC) værdier og cellecyklus og proliferative biomarkører (p53, p21, Ki67,) med henblik på at etablere sin potentielle rolle som en ikke-invasiv biomarkør til forudsigelse af cellecyklus, proliferativ aktivitet og biologiske aggressivitet i blærekræft.

Materialer og metoder

Patienter med blærekræft, som gennemgik 3,0 Tesla DW-MRI af blæren før TUR-B eller radikal cystektomi var berettiget til denne prospektive IRB-godkendt studie. Histologisk prøve blev immunhistokemisk farvet for følgende markører: p53, p21 og Ki67. To bord-certificeret uropathologists revideret prøverne blindet til DW-MRI resultater. Histologisk kvalitet og T-scenen blev klassificeret ifølge WHO 2004 og TNM klassifikationen 2009, hhv. Nonparametric univariate og multivariate statistik, herunder sammenhæng, logistisk regression og ROC-analyse blev anvendt.

Resultater

Muskel invasiv blærekræft blev histologisk bekræftet i 10 ud af 41 patienter. Alle undersøgte væv biomarkører var signifikant korreleret med ADC-værdier (p 0,05, henholdsvis). Baseret på multivariat analyse, p53 og ADC er både uafhængige prognostiske faktorer for muskel invasiv for blærekræft ( /= T2). (P = 0,013 og p = 0,018).

Konklusion

ADC værdier er associeret med cellecyklus og proliferative biomarkører og gør derved afspejler invasive og proliferativ potentiale i blærekræft. ADC og p53 er både uafhængige prognostiske faktorer for muskel invasiv i blærekræft

Henvisning:. Sevcenco S, Haitel A, Ponhold L, Susani M, Fajkovic H, Shariat SF, et al. (2014) Kvantitative Tilsyneladende diffusionskoefficient Målinger opnået ved 3-Tesla MR er korreleret med biomarkører for blærekræft proliferativ aktivitet. PLoS ONE 9 (9): e106866. doi: 10,1371 /journal.pone.0106866

Redaktør: Peter C. Black, University of British Columbia, Canada

Modtaget: 23. maj 2014; Accepteret: August 8, 2014; Udgivet: 9 September, 2014

Copyright: © 2014 Sevcenco et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at for godkendte årsager, nogle adgangsbegrænsninger anvendelse på de data, der ligger til grund for resultaterne. Efter politik Medical University of Vienna, Data er tilgængelige fra Institut for Biomedicinsk Imaging og Image-vejledt biopsi (kontakt Dr. Pascal Baltzer på + 43-1-40400-48180 eller via e-mail: [email protected] .at) for forskere, der angiver grunden (dvs. sekundær dataanalyse) for adgang til fortrolige data

Funding:. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Blærekræft er en ondartet sygdom, der forårsager betydelig sygelighed og dødelighed. For optimeret kliniske behandling af patienter med blærekræft, en præcis forudsigelse af de enkelte kræftformer er behov biologiske adfærd. standard prognostiske faktorer såsom patologisk iscenesættelse og sortering, er imidlertid begrænset i denne henseende [1].

Derfor molekylære biomarkører taget fra vævsprøve er blevet stadig mere undersøgt for at overvinde disse begrænsninger og til præcist at forudsige tumor klasse og trin [2]. Tidligere undersøgelser baseret på cellecyklus og tumor proliferationsmarkører (p53, p21, Ki67) har vist en prognostisk rolle vedrørende patient resultat med muskel- og ikke-muskel blærecancer [1], [2]. Computertomografi og magnetisk resonans imaging (MRI) regelmæssigt bruges til lokal iscenesættelse af blærekræft [3]. En af de nyere udviklinger i MRI er brugen af ​​Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging (DW-MRI). Denne teknik måler vand diffusion ved indsættelse af bevægelse sondering gradienter i en hurtig T2-vægtet Echo Planar Imaging sekvens. En vand diffusion afhængig tab af signal forårsaget af spin-de-udfasning kan kvantificeres ved hjælp af det tilsyneladende Diffusion Coefficient (ADC). Nylige undersøgelser har vist en lovende potentiale DW-MRI til påvisning, sortering og iscenesættelse i blærekræft [4] – [6]. Mikrostrukturelle ændringer i blære kræft målt ved ADC værdier korrelerer med den histopatologiske kvalitet og scene [7], [8].

Udover disse kliniske prognostiske faktorer, en nylig undersøgelse har vist en omvendt korrelation mellem ADC værdi og proliferativ aktivitet som målt ved Ki67 [9]. Derfor kan ADC beskrives som en potentiel biomarkør afspejler invasive og proliferativ potentiale i blærekræft.

For således at følge denne vej for forskning, er formålet med denne undersøgelse var at undersøge korrelationen mellem ADC værdier med cellecyklus og proliferative biomarkører (p53, p21, Ki67) og til at etablere sin potentielle rolle som en invasiv biomarkør til forudsigelse af cellecyklus, proliferativ aktivitet og biologiske aggressivitet i blærekræft.

Materialer og Metoder

Patienter

Patienter med mistanke om blærekræft, der undergik 3,0 Tesla DW-MRI af blæren før TUR-B, og i tilfælde af muskel invasiv blærekræft, efterfølgende radikal cystektomi var berettiget til denne prospektive undersøgelse, der blev godkendt af den etiske gennemgang bestyrelsen for medicinske universitet i Wien (registreringsnummer 1749/2012). Kun patienter med histopatologisk bevist blærekræft blev inkluderet i vores analyse. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke til brug af anonymiserede data, herunder medicinske billeder med henblik på denne undersøgelse.

MR-protokol

Undersøgelsen blev udført ved hjælp af en hele kroppen MRI-system ved en feltstyrke på 3-Tesla (TIM Trio, Siemens, Erlangen, Tyskland). Dedikerede producents indfaset-array-receiver spoler blev brugt til erhvervelse billede. Den billeddannende protokol omfattede en Echo-Planar-Imaging baseret Diffusion Weighted Imaging (DWI) sekvens (TR 7500 ms, TE

eff 84 ms, 3 b-værdier: 50, 400, 1000 s /mm

2, parallel billeddannelse under anvendelse GRAPPA faktor 2, modtager båndbredde 1736 Hz, ekko afstand 0,92 ms, rumlig opløsning 1.8 * 1.5 * 5 mm, erhvervelse 6 min.) Pixel-wise monoeksponentiel regression af målte signal intensitetsværdier ved forskellige b-værdier blev anvendt til at beregne tilsyneladende diffusionskoefficient kort

Histologi og Immunhistokemi

de histologiske prøver taget fra TUR-B, og i tilfælde af muskel invasiv blærekræft blev radikal cystektomi immunhistokemisk farvet for følgende markører:. p53, p21, og Ki67. To bord-certificeret uropathologists revideret de farvede skiver blindet til DW-MRI resultater. Endvidere blev histologisk kvalitet og T-stadie klassificeret ifølge WHO 2004 og TNM klassifikationen 2009, hhv.

For immunhistokemiske farvninger på serielle snit fra paraffinindlejrede tumorblokke BenchMark ULTRA IHC /ISH farvningsmodulet (Ventana /Roche) med følgende antistoffer: p53 (NeoMarkers, RM-9105-S, 1:50 til 32 min, forbehandling ULTRA CC1-52 min), p21 (Oncogene, OP64, 1:100 for 32 min, forbehandling ULTRA CC1- 36 min), og Ki67 (Novocastra, NCL-Ki67 1:20 i 1 time 12 min, forbehandling ULTRA CC1-76 min). 500 kerner blev talt i et hotspot og procentdelen af ​​positive kerner pr området blev vurderet inden hver prøve. p53 immunoreaktivitet blev anset ændret, når prøver viste mindst ≥10% nukleare reaktivitet [10]. p21 immunoreaktivitet blev anset ændret, når prøver havde ≤10% farvning [11]. Ki67 farvning blev anset for at være ændret, når prøver havde . 20% reaktivitet [12] [13], [14]

Dataanalyse

Imaging data blev analyseret på en dedikeret arbejdsstation (Siemens Leonardo WFC, München, Tyskland) af to uafhængige radiologer oplevet i DW-MRI og blærekræft billeddannelse. Faste dele af de undersøgte læsioner blev omhyggeligt identificeret på DWI billeder og ADC-værdier blev målt ved at anbringe en lille (5-15 pixel) region af interesse (ROI) på ADC kort undgå postkirurgiske ændringer, nekrose eller cystisk tumor dele. Desuden blev en ROI placeret i den upåvirkede blærevæggen. De gennemsnitlige ADC værdier blev bemærket for yderligere analyse. Læsion størrelse blev målt ved hjælp af elektroniske calipre på MRI billedet.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført efter afprøvning af den normale fordeling af data ved hjælp af Kolmogorov-Smirnoff test. ADC måling reproducerbarhed blev behandlet ved at beregne variationskoefficienten og intraclass korrelationskoefficient. Multiple parametrisk Spearman korrelation analyser af midlede ADC værdier for både læsere med immunhistokemisk vurderede prognostiske faktorer og klinisk-patologiske træk blev udført, og resultaterne visualiseret som en farvekodet korrelation matrix. P-værdier 0,05 blev betragtet som signifikante i denne sonderende korrelationsanalyse. Brug klinisk sædvanlige afskæringsværdier for dichotomization af immunhistokemisk målte biomarkører blev Mann-Whitney-U test udført for at bevise gruppeforskelle. For multivariat identifikation af uafhængige prædiktorer for clinicopathologic prognostiske faktorer, binær logistisk regression med fremad funktion valg baseret på sandsynligheden nøgletal (indrejse og fjerne grænserne for 0,05 og 0,1, henholdsvis) blev udført. Nagelkerkes R-kvadreret og Hosmer og Lemeshow test blev beregnet for at demonstrere gyldigheden af ​​regressionsmodeller. Forudsagte sandsynligheder blev gemt som en variabel og arealet under ROC-kurven (AUC) for hver model blev beregnet under anvendelse ROC-analyse.

Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af softwareprogrammer R-statistik (version 3.0.3 ” Varm hvalp “, R fundament), MedCalc 13 (MedCalc, Mariakerke, Belgien) og SPSS 22 (IBM).

Resultater

Fyrre-én patienter (gennemsnitsalder 68y, rækkevidde 41- 89 år, 9 kvindelige, 31 mænd) blev inkluderet. Af disse syvogtredive patienter gennemgik MR før TUR-B. Fire patienter blev undersøgt ved MRI én til 27 dage efter TUR-B forud for cystektomi. Alle fire patienter viste omfangsrigt residual sygdom på MRI. Der var 20 Ta, 11 T1 og 10 T2 urothelial karcinom. Elleve patienter med stadie T1 fik BCG terapi for et år, og ingen patient gennemgik stråling eller neoadjuverende kemoterapi. Median læsion størrelse var 13 mm (IQR 19 mm) med en afstand af 4-80 mm. Median tid mellem TUR-B og MR var to dage, der spænder mellem 28 dage før til 27 dage efter TUR-B

Den mediane blærecancer læsion ADC værdi var 1,032 (IQR 0,449) * 10

. – 3 mm

2 /S. Variationskoefficienten mellem begge læsere var 7,7%, er intraclass korrelationskoefficient var 0,97. Medianen ADC værdi upåvirket blære væg (1,338, IQR 0,384 * 10

-3 mm

2 /s) var signifikant højere end ADC værdien af ​​blærecancer (P = 0,000018). Vi identificerede signifikante korrelationer (P 0,05) mellem klinisk-patologiske faktorer, prognostiske immunhistokemiske markører og ADC værdier, der opnås fra DW-MRI. Med hensyn til klinisk-patologiske faktorer, blev ADC værdier omvendt korreleret med tumorstørrelse (P = 0,000277), fase (P = 0,000002), lymphovascular invasion (P = 0,004) og bedømmelse (P = 6 * 10

-10) . Vedrørende molekylære biomarkører, blev en svag positiv korrelation iagttaget mellem ADC og p21 (P = 0,038) og en moderat negativ korrelation var til stede mellem ADC og p53 (0,024) og Ki67 (P = 0,007) ekspression. Nærmere oplysninger om korrelationskoefficienter er givet i en sammenhæng matrix (figur 1)

Blanke rum indikerer en ikke er væsentlige korrelation defineret af en P-værdi på .. 0,01

Anvendelse klinisk cut -off værdier for immunhistokemisk afledte prognostiske faktorer, Mann-Whitney-U-test identificeret betydelige ADC gruppe forskelle mellem p53 og Ki67 (tabel 1).

Med hensyn til prognostiske faktorer og klinisk-patologiske faktorer, positive korrelationer var der foreligger med hensyn tumorstørrelse for p53 (P = 0,013) og Ki67 (P = 0,018). Stage, lymphovascular invasion (LVI) og sortering blev hver negativt korreleret med p21 (P = 0,001, P = 0,001 og P = 0,0002, henholdsvis) og positivt korreleret med p53 (P = 0,0005, P = 0,001 og P = 0,0002, henholdsvis) og Ki67 (P = 0,001, P = 0,0003 og P = 0,012, henholdsvis; jf figur 1 og tabel 2)

for at identificere uafhængige prædiktive faktorer for klinisk-patologiske variabler, multivariat logistisk regressionsanalyse var. udført. ADC og p53 var både uafhængige prædiktorer for muskel invasion (P 0,05 henholdsvis jf Tabel 3). Både p21 og p53 var uafhængige prædiktorer for lymphovascular invasion; ADC og p21 var uafhængige prædiktorer for tumorklassificering. Vedrørende læsion størrelse, ADC var den eneste uafhængige variable udvalgt af regressionsmodellen (P = 0,019). Detaljerede regressionsresultater er anført i tabel 3. Repræsentative kliniske eksempler er givet i figur 2, figur 3 og figur 4.

ADC værdi blev målt som 0,655 * 10

-3 mm

2 /s . Lavere række viser immunhistokemiske farvninger. Procentdelen af ​​positive celler var 92% (P53), 69% (Ki67) og 1% (P21). Histopatologi viste muskler invasive high-grade blærekræft fase T2a.

ADC værdi blev målt som 1,081 * 10

-3 mm

2 /s. Lavere række viser immunhistokemiske farvninger. Andel af positive celler var 6% (P53), 12% (Ki67) og 71% (P21). Histopatologi udviste non-muskel invasiv lav kvalitet blærekræft stadie Ta.

ADC værdi blev målt som 0,539 * 10

-3 mm

2 /s. Lavere række viser immunhistokemiske farvninger. Procentdelen af ​​positive celler var 0% (P53), 8% (Ki67) og 23% (P21). Histopatologi udviste non-muskel invasive high-grade blærekræft fase T1A.

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse viste signifikante korrelationer mellem ADC-værdier opnået fra DW-MRI og klinisk-patologisk prognostisk kriterier, specielt histologisk kvalitet, tumorstørrelse og muskel invasionsevne. Desuden blev signifikante korrelationer mellem ADC værdier og den prognostiske immunhistokemisk afledte biomarkører p53, p21 og Ki67 identificeret. Trods krydskorrelationer, ADC var en uafhængig prædiktor for blærekræft scenen og lønklasse som identificeret ved multivariat analyse. Aggressiv muskel invasive blære kræft stede med lave ADC værdier og en høj fraktion af Ki67-positive celler. Disse resultater logisk passe til hinanden: en aggressiv neoplasma viser en høj proliferationshastighed som afspejlet ved Ki67 målinger mens resultatet af denne høje proliferationshastighed medfører øget cellularitet, formindske andelen af ​​ekstracellulært til intracellulære rum. ADC målinger afspejler vand diffusion i det ekstracellulære rum og er relativt faldet i stærkt proliferative tumorer [15]. Men grunden ADC værdier er faldet i aggressive cancere, er ikke fuldt forstået, som flere forfattere i flere organer har vist, associationer mellem ADC værdier og cellularitet af tumoren proliferationshastighed, men disse korrelationer er svag til moderat og dermed i god overensstemmelse med vores egne resultater [9], [16] – [18]. Endvidere undersøgte vi p53 og p21: p53 er også forbundet med tumor stadium, patologisk tumorklassificering og lymphovascular invasion. Yderligere undersøgelser har rapporteret, at p53 overekspression er associeret med højkvalitets og højere trin i patienter med blærecancer [19]. Det er også blevet fastslået, at p53 er en uafhængig faktor til forudsigelse af tilbagefald progression og dødelighed i blærekræft [19]. Nyere undersøgelser har vist, at en kombination af cellecyklus regulatorer såsom p53, p21, p27 og cyclin E1 giver overlegen prognostisk information sammenlignet med disse markører analyseres uafhængigt [2]. Sammenhængen mellem ADC, Ki67, p53 og p21 understreger, at ADC værdier er forbundet med visse fænotyper af blærekræft, der viser lavere værdier i muskel invasive og ædelstål tumorer. Grunden til, at vi skulle være interesseret i en anden markør for malignitet er indlysende: mens immunhistokemisk afledte prognostiske markører kræver invasiv væv prøveudtagning og menneskelig interaktion i udvælgelsen af ​​repræsentative slides til analyse, ADC værdier repræsenterer resultatet af en ikke-invasiv, tre-dimensionelle og kvantitativ test. Men baseret på vores foreløbige resultater, ADC-værdier kan også have en trinvis prognostisk værdi og er ikke en erstatning for andre prognostiske markører. Det er blevet foreslået i en nylig, at en kombination af prognostiske markører i blærekræft kan være behov for at give en fuldstændig beskrivelse af den underliggende tumor patologi i denne heterogene sygdom [19].

Vi er ikke den første til at beskrive sammenhænge mellem ADC værdier og klinisk-patologiske træk i blærekræft [6], [8], [9], [20], [21]. Mens vores resultater er i god overensstemmelse med disse tidligere undersøgelser vides der kun lidt om foreningen mellem ADC værdier og prognostiske biomarkører. Så vidt vi ved, kun Kobayashi et al. foretaget en undersøgelse af sammenhænge mellem ADC, Ki67 og klinisk-patologiske træk i blærekræft [9]. Vores resultater gå sammen med denne forudgående undersøgelse, der viser en lignende korrelationskoefficient mellem Ki67 og ADC (-0,47 i vores undersøgelse og -0,57 i undersøgelsen fra Kobayashi et al.). Forfatterne konkluderede, at ADC værdier er en biomarkør for blærekræft aggressivitet [9]. Vores undersøgelse går ud over denne indledende undersøgelse, som vi medtaget yderligere markører af cellecyklus og deres sammenslutninger med både ADC værdier og klinisk-patologiske faktorer. Notatet bortset lymphovascular invasion, ADC værdier uafhængigt prædiktiv for alle vigtige klinisk-patologiske funktioner såsom klasse og trin i blærekræft.

Vi er forpligtet til at nævne begrænsningerne i det nuværende studie. Det første er antallet af patienter, der indgår i denne undersøgelse er temmelig lave. Dette understreger pilotundersøgelsen karakter af vores forskning. Det skal understreges, at de sonderende multivariate modeller, der præsenteres i denne tekst ikke kan anvendes direkte i klinisk praksis, da de ikke er prospektivt valideret under de samme betingelser, hvorunder de underliggende data blev indsamlet. Men de positive korrelationer mellem de enkelte undersøgte faktorer og de beregnede multivariate modeller har hver bevist statistisk signifikans og understrege interessen for yderligere forskning om dette emne. Endvidere har vi ikke undersøge retest pålidelighed data om variabiliteten af ​​ADC målinger, hvis målt ved to forskellige lejligheder i den samme patient. Den lave variation af ADC målinger i forskellige tumorer inden denne undersøgelse tyder stærkt en lav re-test variation. Som vores undersøgelse var tænkt som en eksplorativ analyse for at identificere tværgående sammenhænge mellem ADC værdier og prognostiske biomarkører med klinisk-patologiske funktioner. Standardisering og pålidelighed analyser er derfor uden for rammerne af dette papir. Variationskoefficienten mellem forskellige læsere på de samme billeder var lav.

Selvom vi identificeret korrelationer med klinisk-patologiske og immunhistokemiske prognostiske faktorer, vil den mulige forudsigelse af patientresultater i sygdomsbekæmpelsen og samlet overlevelse være af primær klinisk interesse. Men foreningerne identificeret i vores undersøgelse er meget der tyder på en prognostisk værdi af ADC-værdier for patienternes resultater.

Som konklusion er ADC værdier begge korreleret med ændret proliferativ aktivitet i blærekræft som målt ved immunhistokemiske biomarkører og endvidere korreleret med prognostisk relevant klinisk-patologisk præsentation af blærecancer. Multivariate statistik viste ADC-værdier som en uafhængig prædiktor for BCA sortering, størrelse og muskel invasion. Af de undersøgte immunhistokemiske biomarkører, p21 og p53 var prædiktiv for LVI og p53 bidrog selvstændigt til muskel invasion og tumor klasse forudsigelse. Vores resultater understreger potentielle rolle ADC værdier som en uafhængig og additiv diagnostisk biomarkør til forudsigelse af blærekræft biologiske aggressivitet og skabe grundlag for yderligere undersøgelser validering af anvendeligheden af ​​disse fund for den kliniske beslutningsproces.