PLoS ONE: lav koncentration af Quercetin modvirker de cytotoksiske virkninger af antineoplastisk Narkotika i kræft i æggestokkene

Abstrakt

Målsætning

rolle Quercetin i æggestokkene kræftbehandling er stadig kontroversiel, og mekanismen er ukendt. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge de terapeutiske virkninger af Quercetin i kombination med cisplatin og andre antineoplastiske lægemidler i æggestokkene kræftceller både

in vitro

in vivo

, sammen med den molekylære virkningsmekanisme.

Metoder

Quercetin behandling ved forskellige koncentrationer blev undersøgt i kombination med cisplatin, taxol, pirarubicin og 5-Fu i human epitelial kræft i æggestokkene C13 * og SKOV3 celler. CCK8 assay og Annexin V assay var for cellelevedygtighed og apoptose-analyse, immunofluorescens assay DCFDA farvning og realtime PCR blev anvendt til reaktive oxygenarter (ROS) -induceret påvisning skade og endogen antioxidant enzymer ekspression. Athymiske BALB /c-nu nøgne mus blev injiceret med C13 * celler for at opnå en xenograft model for

in vivo

undersøgelser. Immunhistokemisk analyse blev udført for at evaluere ROS-induceret beskadigelse og SOD1 aktivitet af xenotransplantattumorer.

Resultater Salg

I modsætning til den pro-apoptotiske effekt af høj koncentration (40 pM-100 uM) af quercetin lave koncentrationer (5 uM-30 uM) af Quercetin resulterede i varierende grader af dæmpning af cytotoksicitet af cisplatin behandling, når det kombineres med cisplatin. Der blev observeret lignende anti-apoptotiske virkninger, når Quercetin blev kombineret med andre antineoplastiske midler: Taxol, pirarubicin og 5-fluorouracil (5-FU). Lave koncentrationer af Quercetin blev observeret at undertrykke ROS-induceret skade, reducere intracellulære ROS niveau og øge ekspressionen af ​​endogene antioxidant enzymer, hvilket tyder på en ROS-medieret mekanisme formildende antineoplastiske lægemidler. I xenogene model, Quercetin førte til en betydelig reduktion af den terapeutiske effekt af cisplatin sammen med styrke endogene antioxidant enzym udtryk og reducere ROS-induceret skade xenograft tumorvæv.

Konklusion

Tilsammen disse data antyder, at quercetin ved lave koncentrationer dæmpe de terapeutiske virkninger af cisplatin og andre antineoplastiske lægemidler i ovariecancerceller ved at reducere ROS skader. Quercetin tilskud under ovariecancer behandling, kan de skade terapeutisk respons

Henvisning:. Li N, Sun C, Zhou B, Xing H, Ma D, Chen G, et al. (2014) lav koncentration af Quercetin antagoniserer de cytotoksiske virkninger af antineoplastisk Lægemidler i æggestokkene. PLoS ONE 9 (7): e100314. doi: 10,1371 /journal.pone.0100314

Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Center for Bioteknologi, Indien

Modtaget: 11. december 2013; Accepteret: 26 maj 2014; Udgivet: 7 juli 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Basic Research Program Kina (973 Program, 2009CB521808); National Nature og Science Foundation of China (81230038, 81272859, 81025011, 81090414, 81000979, 81101962); Nature og Science Foundation i Hubei-provinsen (2011CBD542); Grundforskning Midler til Central Universiteter (HUST: 2012TS058). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den hyppigste invasive malignitet af kvindelige kønsorganer i USA, med en anslået 22,240 diagnosticerede tilfælde om året. Ca. 14.030 kvinder dør hvert år af kræft i æggestokkene, der repræsenterer den mest almindelige dødsårsag blandt kvinder med gynækologiske maligniteter [1]. Platin- lægemidler, såsom cisplatin og carboplatin, er first-line kemoterapeutiske midler til behandling af ovariecancer. Selv om de fleste patienter vise kemosensitivitet når der begynder terapi, har erhvervet lægemiddelresistens blevet en stor hindring i kræftbehandling. De faktorer, som kan forstærke eller undertrykker anticancervirkning af antineoplastiske lægemidler forekommer at være vigtige i behandlingen af ​​ovariecancer.

Quercetin (3,3 ‘, 4’, 5,7-pentahydroxyflavone, Quer) tilhører en klasse af flavonoid forbindelser, og er i forskellige grøntsager, frugter, frø, nødder, te og rødvin [2]. Det er den største flavonoid i menneskets kost, med en anslået daglig indtagelse af 25 mg i USA [3]. Som en gennemprøvet antioxidant, er Quercetin anbefales at tage oralt for forebyggelse og sundhedsfremme kræftbehandling [4]. I de senere år har flere undersøgelser bemærket, at Quercetin kan virke som en potentiel anticancerlægemiddel ved at øge toksiciteten af ​​cisplatin behandling i hepatoma HA22T /VGH og æggestokkræft A2780 celler [5] – [7]. Alligevel er der undersøgelser rapporteret, at i modsætning til høje koncentrationer af flavonoid faldt celleoverlevelse og levedygtighed, lave koncentrationer forøget total antioxidant kapacitet af cancerceller og forhindre celledød på grund af cytotoksiske lægemidler såsom cisplatin og 5-FU i lungekræft A549 og kolorektale cancer HCT116 celler [8], [9]. Rolle Quercetin i ovariecancer behandling er kontroversiel, og virkningsmekanismen er fortsat ukendt.

Cisplatin og andre anti-neoplastiske midler føre til stigninger i intracellulære reaktive oxygenarter (ROS), som kan bidrage til deres terapeutiske virkning . Antioxidant, såsom C-vitamin kosttilskud kan svække anti-neoplastisk aktivitet af lægemidler, som øger ROS [10]. Quercetin er kendt for at reducere intracellulære ROS-niveauer i forskellige celletyper ved at fremme den intracellulære ROS-fjernende system, som indbefatter modulering afgiftende enzymer, såsom superoxiddismutase 1 (SOD1) og katalase (CAT). Det fik os til at sætte spørgsmålstegn ved, at uanset om Quercetin også kunne ophæve de cytotoksiske virkninger af antineoplastiske lægemidler, der øgede ROS. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge effekten af ​​Quercetin i kombination med cisplatin og andre antineoplastiske lægemidler i ovariecancerceller både

in vitro

in vivo

, sammen med den molekylære mekanisme handling.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i national Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg af Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi (Permit nummer: S 292). blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelser dyr

Kemikalier og reagenser

Quercetin ( 99% ren)., cis-diamminplatin (II) dichlorid (Cisplatin), Taxol (Paclitaxel) var købt hos Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), opløst i DMSO, alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C. Pirarubicin (Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Kina) og 5-fluorouracil (5-FU) (Shanghai Xudong Haipu Pharmaceutical Co Ltd., Kina) blev opløst i normalt saltvand.

Cell kultur

den humane epitelial ovariecancer cellelinie C13 * [11] er Cisplatin-resistent klon af ov2008 cellelinie, som var afledt fra et humant ovariecarcinom. Denne C13 * cellelinje var en gave fra Prof. Rakesh ved Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, Canada [3]. SKOV3 ovariecancer cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Ovariecancerceller blev dyrket i RPMI 1640-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO

2.

Cellelevedygtighed

Cellelevedygtighed blev målt med CCK8 assay (celletælling kit-8, Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan). Celler blev fremstillet i 96-brønds celledyrkningsplader plader ved en celletæthed på 5 × 10

3 celler /brønd og behandlet med Quercetin /antineoplastiske lægemidler (cisplatin, taxol, pirarubicin og 5-FU) eller vehikel (DMSO med den samme fortynding sats som lægemidlerne) ved 37 ° C i 48 timer. Cellemonolaget blev vasket tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1,2 mM CaCl

2 og 0,7 mM MgCl

2, derefter en 1:10 fortyndet CCK8 opløsning i RPMI 1640 blev tilsat til cellerne og inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. Resultaterne blev målt ved en mikropladelæser ved 450 nm og udtrykt i procent af kontrolværdier (opnået for celler behandlet med vehikel).

Annexin V /PI-farvning

Celler blev trypsinbehandlet og vasket med serumholdigt medium. Prøverne (5 × 10

5 celler) blev centrifugeret i 5 min ved 400 x g og supernatanten blev kasseret. Cellerne blev derefter farvet under anvendelse af en Annexin V-FICT /PI apoptose kit (Keygen Biotech, Nanjing) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Antallet af apoptotiske celler blev detekteret og analyseret under anvendelse af flowcytometri.

Måling af ROS

ROS blev påvist under anvendelse reaktive oxygenforbindelser Assay Kit (Beyotime, Kina) ifølge producentens instruktioner. Efter den molekylære probe 5- (and-6) -chlormethyl-2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) diffunderer ind i celler og sekvestreres intracellulært af de-esterificering, den efterfølgende reaktion med peroxider genererer fluorescerende 5-chlormethyl- 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein (DCF). Kort fortalt, efter behandling, celler blev opsamlet ved centrifugering, resuspenderet i PBS indeholdende 10 pmol /L DCFH-DA, inkuberet i 20 minutter ved 37 ° C, vasket med PBS til fjernelse af overskydende farvestof, og derefter inkuberet med RPMI-medium ved 37 ° C i 10 minutter, blev fluorescensresultater opnået under anvendelse af FL-1 kanal af en Becton Dickinson FACSCalibur, og analyseret under anvendelse af CellQuest software. Procentdelen af ​​celler, som viser øget farvestofoptagelse blev anvendt til at afspejle en stigning i ROS-niveauer.

immunofluorescensbestemmelse

Kort fortalt blev C13 * celler podet i 24-brønds celledyrkningsplader plader indeholdende en steril glas objektglas ved en cellulær densitet på 2 x 10

4 celler /brønd. Efter behandling med forskellige lægemidler i 48 timer blev celler vasket tre gange med iskold PBS og fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter blokering med 1% fedtfri mælk i 2 timer, blev gede-anti-8-OHdG og muse anti-γH2AX antistoffer (Millipore) tilsat til objektglassene hhv. Efter 4 timers inkubation blev objektglassene vasket 3 gange med 0,5% PBS-Tween 20 (PBST) og fluorescein CY3-konjugeret sekundært muse-anti-gede-antistof og FITC-konjugeret ged anti-mus sekundært antistof (Sigma-Aldrich) tilsat ved en fortynding af 1:100. Cellerne blev inkuberet i 45 minutter ved 37 ° C. Endelig blev cellerne vasket som beskrevet ovenfor og undersøgt med fluorescensmikroskopi (Olympus, Tokyo, Japan). Fem tilfældige høj effekt felt billeder blev taget af hver gruppe, blev Billede J software, der bruges til at beregne antallet af meget positive farvede celler.

Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

C13 * celler blev podet i 6-brønds celledyrkningsplader plader ved en densitet på 5 x 10

5 celler /brønd og behandlet med Quercetin og cisplatin i 48 timer. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Kina). Komplementært DNA blev syntetiseret i overensstemmelse med producentens protokol (Toyobo, Japan). Real-time PCR-amplifikation blev udført på en ABI PRISM 7500 cyklusapparat med SYBR reagens (Toyobo, Japan). De termiske cykelforhold blev fastsat som angivet i vejledningen, der fulgte med variator, med en annealing temperatur på 60 ° C. Oligonukleotider anvendt til amplifikation af superoxiddismutase 1 (SOD1), endonuklease G (ENDOG), cytochrom c (cyto-c), glutathionperoxidase (GPX), blev catalase (CAT) og frakobling protein 2 (UCP2) (tabel S1) konstrueret ved hjælp af primer 5,0 og syntetiseret af Invitrogen. Kvantitativ normalisering af cDNA blev udført ved anvendelse af housekeeping-genet glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) som en intern kontrol for at bestemme ensartetheden af ​​skabelonen RNA til alle prøver. For hver prøve blev ekspressionen af ​​genet af interesse afledt af forholdet mellem deres udtryk til GAPDH udtryk ved hjælp af følgende formel:. Relative udtryk = 2- (ACt prøve-ACt kontrol), ACt = Ct gen-Ct GAPDH

In vivo

xenografundersøgelser

in vivo

evaluering af Quercetin blev udført ved hjælp af en xenograftmodel af humane C13 * celler. Athymiske BALB /c-nu nøgne mus (4-6 uger gamle, fremstillet af Beijing HFK bioscience selskab, Beijing, Kina) blev anbragt i en SPF-værelse inden dyret faciliteter på Laboratory Animal Center University of Tongji Medical College . Dyrene fik lov at akklimatisere til deres nye omgivelser i en uge før anvendelse. C13 * celler (2 x 10

6) blev resuspenderet i PBS-medium med Matrigel basalmembranmatrix (BD Biosciences, Bedford, MA) ved et 1:01 forhold (samlet volumen 100 pi), derefter blev subkutant injiceret i flankerne af nøgne mus (dag 0). Fra den 10. dag af injektion blev musene vilkårligt inddelt i 4 behandlingsgrupper (n = 8 for hver gruppe) og injiceret intraperitonealt (ip) med normalt saltvand (NS), Quercetin (20 mg /kg legemsvægt, daglig), cisplatin ( 4 mg /kg legemsvægt, hver fjerde dag), og kombineret Quercetin og cisplatin behandling (under anvendelse af de ovennævnte doseringer) i 21 på hinanden følgende dage. Kropsvægt og tumormassen blev målt hver 5 dage. Tumorvolumen blev bestemt ved anvendelse af en skydelære og beregnet i overensstemmelse med formlen (bredde

2 x længde) /2. Mus blev aflivet ved cervikal dislokation under anæstesi efter tre ugers behandling (dag 30).

Immunohistokemisk analyse

Immunohistokemiske undersøgelser blev udført på de xenotransplantattumorer efter de blev fjernet fra nøgne mus. Tumorerne blev fikseret i 40 mg /ml paraformaldehyd, paraffinindlejret og skåret i 4 um serielle snit. Derefter blev endogene peroxidaser standset og blev snittene vasket grundigt med phosphatbufret saltvand (PBS) tre gange. Snittene blev blokeret med 2% gedeserum og kaninserum henholdsvis i PBS ved 37 ° C temperatur i 45 min, derefter inkuberet med muse-anti-SOD1 antistof (1:500 fortynding, Abcam) og gede-anti-8-OHdG antistof (1 :800 fortynding, Millipore) natten over ved 4 ° C. Bagefter blev sektionerne inkuberet med gede anti mus og muse-anti-gede-peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer separat og avidin-biotin kompleks efterfulgt af diaminobenzidin (Vector ABC, Burlingame, CA, USA). Nedsænket i 2% ammoniakvand blev hæmatoxylin anvendes til kontrafarvning. Sektioner blev inkuberet med kanin og ged IgG serum henholdsvis som negative kontroller.

Positiv 8-OHdG farvning var hovedsageligt i kerner, mens positivt udtryk for SOD1 var primært en cytoplasma mønster både i tumorceller snarere end i de stromale celler . På grund af intensiteten af ​​8-OHdG og SOD1 farvning inden for hver sektion var mest homogen, immunoreaktiviteten i prøverne var semi-kvantitativt vurderes efter følgende kriterier: stærk positiv (scoret som 3), stærk farvning intensitet ( 90% af cancerceller); moderat positive (scoret som 2), moderat farvning intensitet ( 50-89% af positive celler); svagt positive (scoret som en), svag farvning intensitet ( 10-49% af positive celler); fraværende (scoret som 0), ingen farvning intensitet og ingen positiv eller kun nogle få positive celler [12], [13]. Farvningsintensiteten og andelen af ​​hver sektion farvedes blev beregnet under anvendelse fem tilfældige højstyrkefelt billeder af hver gruppe af to uafhængige undersøgere.

Statistical Analysis

Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistiske analyser blev udført ved anvendelse SPSS19.0. Forskelle mellem to grupper blev sammenlignet ved hjælp af Students

t

test. De statistiske forskelle mellem mere end to grupper blev bestemt ved envejs ANOVA efterfulgt af post hoc parvise sammenligninger.

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Quercetin ved lave koncentrationer fremmer overlevelsen af ​​æggestokkene kræft C13 * celler behandlet med cisplatin

platinbaseret kemoterapi er den vigtigste terapi i behandlingen af ​​ovariecancer. For at bestemme den potentielle rolle Quercetin kan spille i cisplatin-resistens i ovariecancer, blev C13 * celler udsat for forskellige koncentrationer af Quercetin, Cisplatin, eller en kombination af de to. IC50 for cisplatin-behandlede C13 * celler var ca. 80 pM (IC50 = 78,8 uM, 95% CI: 72,9-85,1 pM) (figur S1A). Når C13 * celler blev behandlet med 80 pM cisplatin i kombination med stigende doser af Quercetin, fandt vi, at cytotoksiciteten af ​​cisplatin blev reduceret, når man kombinerer med lave koncentrationer af Quercetin (5 uM til 30 uM), mens relativ høj koncentration af Quercetin (100 uM) øgede cisplatin cytotoksicitet (fig. 1A). For at bestemme den antagonistiske virkning eller sensibilisering af kombinationen narkotika, beregnede vi kombinationen (CI) for de lægemidler baseret på Chou og Talalay sætning [14]. Resultaterne viste, at lave koncentrationer af Quercetin antagoniserede de cytotoksiske virkninger af cisplatin i C13 * celler, medens høje koncentrationer af Quercetin have en additiv virkning med cisplatin (tabel S2). Vi har også udført kombinationseksperimenter med en række forskellige cisplatin koncentrationer plus fast koncentrationer af Quercetin (20 uM), som viste, at lave koncentrationer af Quercetin steg C13 * celle resistens over for cisplatin i varierende grader (figur S2). Fase-kontrast C13 * celler behandlet med vehikelkontrol, Cisplatin, eller kombinationer af Quercetin (20 uM, 80 uM) med cisplatin (80 uM) er vist i fig. 1B.

(A), blev Cellelevedygtighed af grupper udsættes for forskellige koncentrationer af quercetin alene, eller kombineret med 80 pM cisplatin i 48 timer målt med CCK8 assay og udtrykt som procent af kontrolværdier. *

P

= 0,039, #

P

= 0,009,

P

= 0,027,%

P

= 0,010, ANOVA test fulgt op med post hoc parvise sammenligninger. (B), Phase kontrast billeder af C13-* celler behandlet med køretøj kontrol (DMSO med den samme fortynding sats som narkotika), Cisplatin, eller en kombination af Quercetin (20 uM, 80 uM) med cisplatin (80 uM). (C, D), Cell apoptose af forskellige behandlingsgrupper blev detekteret og analyseret under anvendelse af flowcytometri. Eksperimenter blev udført tre gange (n = 3 pr eksperiment). Gruppe af Cisplatin kombineret med quercetin behandling VS. gruppe af cisplatin behandling, **

P

= 0,033, ***

P

= 0,043, ANOVA test efterfulgt af post hoc parvise sammenligninger.

For yderligere kvantificere de apoptotiske virkninger af Quercetin og cisplatin-behandling blev C13 * celler farvet med Annexin-V FITC og PI, og efterfølgende analyseret ved flowcytometri for celle apoptose. Indlysende fald i antallet af apoptotiske celler blev påvist for celler behandlet med cisplatin og 20 uM Quercetin end med cisplatin alene (fig. 1C, 1D). Proportioner af Annexin V-farvede celler var højere i Cisplatin-behandlede celler end de celler behandlet med yderligere 20 uM Quercetin.

For at generalisere vores konklusioner, vi udført CCK8 analyser i SKOV3, et almindeligt anvendt ovariecancer cellelinie. Resultaterne viste, at lave koncentrationer af Quercetin reducerede de cytotoksiske virkninger af cisplatin i SKOV3 celler (Figur S3).

Quercetin svækket terapi virkningerne af forskellige anti-neoplastiske lægemidler i æggestokkene cancerceller

Til undersøge, om Quercetin afbøde anti-cancer virkninger af andre anti-neoplastiske lægemidler, behandlede vi C13 * celler med tre andre antineoplastiske lægemidler, som normalt anvendes i ovariecancer behandling, 5-Fu, Taxol, og pirarubicin. C13 * celler blev behandlet med en serie af stigende doser af Quercetin og fast 5-Fu (5 uM), Taxol (3 uM) og pirarubicin (3 nM) ved omtrentlige koncentrationer af IC50 (figur S1). Svarende til resultaterne opnået med cisplatin, behandling med disse lægemidler i kombination med Quercetin resulteret i mere celle modstand end behandling med antineoplastiske lægemidler alene (fig. 2.) Efter koncentration på 20 uM, viste Quercetin åbenlyse anti-apoptotiske virkninger mod disse tre lægemidler. Quercetin viste en lav koncentration-specifikke beskyttende virkning ovariecancerceller behandlet med 5-FU (fig. 2A), der ligner resultaterne opnået med cisplatin. I kombination med Taxol eller pirarubicin imidlertid Quercetin fastholdt virkning at fremme celler kunne overleve mod anticancerlægemidler selv ved relativt høje koncentrationer (80 uM, 100 uM) (fig. 2B, 2C).

(A~C ) blev Cellelevedygtighed af Quercetin i kombination med 5-FU, taxol og pirarubicin målt med CCK8 assay og udtrykt som procent af kontrolværdier. N = 3 for hvert forsøg. Gruppe af Cisplatin kombineret med quercetin 20 pM behandling VS. Gruppe af cisplatin behandling, *

P

= 0,048, **

P

= 0,040, ***

P

= 0,032, Student t-test.

Quercetin reducerede oxidative skade af ovariecancerceller forårsaget af cisplatin

Vi undersøgte den mekanisme, hvormed Quercetin svækkede de cytotoksiske virkninger af cisplatin. Som tidligere rapporteret [15], mange antineoplastiske lægemidler, herunder cisplatin, føre til stigninger i intracellulær ROS, der bidrager til deres terapeutiske virkning. Vi spørgsmålstegn ved, om Quercetin kan ændre ROS-associerede skade forårsaget af disse stoffer. Udtrykket 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG), en markør for oxidativt DNA stress og de hyppigst opdages og studeret DNA læsion [16], blev anslået ved immunofluorescens assay. Vi målte også niveauet af cytotoksisk samlede skade ved påvisning af γH2AX, en fælles markør for DNA-skader. Resultaterne viste, at fluorescensintensiteterne af både γH2AX og 8-OHdG var meget lavere i behandlingsgruppen på 80 uM Cisplatin kombineret med lav koncentration Quercetin (20 uM) end gruppen af ​​80 uM cisplatin alene. I modsætning til dette, 80 uM Cisplatin med høj koncentration (60 uM, 100 uM) af Quercetin øget intensiteten af ​​fluorescens (fig. 3A, 3B). Tælling af positive celler med Image J software viste, at kombinationsbehandling med Quercetin (20 uM) havde en mere indlysende fald på 8-OHdG end γH2AX, sammenlignet med cisplatin-behandling alene (36,40% og 19,33% henholdsvis) (fig. 3B) . Det viste, at lave koncentrationer af Quercetin reducerede oxidative skade af ovariecancerceller forårsaget af cisplatin.

(A), 8-OHdG og H2AX ekspression i C13 * celler behandlet med Quercetin i kombination med cisplatin blev påvist ved immunfluorescens assay. (B), blev Numbers af stærkt positive farvede celler i fem tilfældige høj effekt felter tælles af Image J og udtrykt som procent af cisplatin gruppe værdier. Gruppe af Cisplatin kombineret med quercetin 20 pM behandling VS. Gruppe af cisplatin behandling, N = 3. *

P

= 0,004, #

P

= 0,001, Student t-test.

Quercetin reducerede ROS niveau ovariecancerceller undergår cisplatin behandling

for at afgøre, om Quercetin reducerede ROS skade ved at nedsætte intracellulær ROS, Reactive Oxygen Species Assay Kit blev anvendt til at detektere intracellulære ROS niveauer af C13-* celler i forskellige behandlingsgrupper. Sammenlignet med celler behandlet med vehikel kontrollen eller cisplatin alene, behandling med yderligere 20 uM Quercetin føre til en reduktion i intracellulære niveauer af ROS (Fig. 4A, 4C). Kvantitativ analyse viste, at Quercetin (20 uM) behandling gav en indlysende reduktion i ROS niveau (middelværdi 70,4) sammenlignet med kontrolgruppen (middelværdi 99.05) (

P

0,001). (Fig 4B, 4D ). Efter aftale med tidligere resultater, udsættelse for cisplatin forårsagede æggestokkene kræft C13 * celler til at akkumulere den intracellulære ROS, med en gennemsnitlig ROS niveau på 123,5. I behandlingsgruppe af cisplatin kombineret med Quercetin, blev denne værdi reduceret til 83,38 (fig 4D.), Endnu lavere end bærerkontrolgruppen (99.05) (

P

0,001). (. Fig 4B)

intracellulære ROS niveauer af C13 * celler af forskellige behandlingsgrupper blev påvist ved reaktive oxygenarter Assay ved anvendelse af flowcytometri. (A, B) De ROS niveauer af C13 * celler behandlet med vehikelkontrol eller 20 uM Quercetin i 24 timer. (C, D) De ROS niveauer af C13 * celler behandlet med 80 uM Cisplatin med eller uden 20 pM Quercetin i 24 timer. N = 3. *

P

0,001, #

P

. 0,001, Student t-test

Quercetin øget ekspression af endogene antioxidant enzymer i kræft i æggestokkene celler

resultaterne ovenfor anførte, at Quercetin kan reducere intracellulære ROS af æggestokkene kræftcelle, så vi søgte at bestemme en virkningsmekanisme. De vigtigste antioxidant komponenter af celler mod ROS er de endogene antioxidant enzymer, herunder superoxiddismutase 1 (SOD1), endonuklease G (ENDOG), cytochrom c (cyto-c), glutathionperoxidase (GPX), katalase (CAT), og afkobling protein 2 (UCP2). Vi målte ekspressionen af ​​endogene antioxidant enzymer ved realtime PCR. Sammenlignet med celler behandlet med vehikel kontrollen eller cisplatin alene, behandling, som kombinerer cisplatin med 20 pM Quercetin føre til forskellige grader af stigning i ekspressionen af ​​SOD1, ENDOG, cyto-c, GPX, CAT og UCP2 (fig. 5A~F).

(A~F) blev Angivelse af antioxidant enzymer C13 * celler påvises ved real-time PCR. N = 3.

Quercetin forfremmet æggestokkene vækst kræft med cisplatin behandling

in vivo

Vi brugte C13 * celler til at generere xenotransplantattumorer i atymiske, nøgne BALB /c -nu mus at bestemme, om Quercetin kunne dæmpe virkningerne af kemoterapi

in vivo

. Som forventet, behandling med cisplatin alene reducerede tumorvækst i sammenligning med vehikelbehandlede mus. Behandling med Quercetin alene lidt undertrykte tumorvækst sammenlignet med normalt saltvand kontrol (tumor volumen 111.75 mm

3 og 120.51 mm

3 henholdsvis) (P = 0,015). Tumorer fra mus behandlet med cisplatin i kombination med Quercetin var ca. 1,8 gange større på dag 30 end dem behandlet med cisplatin alene (

P

0,001;. Figur 6A, 6B). Sammenligning af gennemsnitsvægten af ​​tumorer fjernet fra mus, fandt vi, at tumorer behandlet med en kombination af Quercetin og cisplatin (72,53 ± 7,33 mg) var signifikant tungere end behandlet med cisplatin alene (41,47 ± 6,72 mg),

P

0,001 (. figur 4D). Endvidere er kombinationen af ​​cisplatin og Quercetin behandling viste en cancer fremmende virkning sammenlignet med kontrolgruppen, målt både i tumorstørrelse og i tumorvægt (fig. 6C).

Mus blev injiceret med NS, 20 /kg Quercetin, 4 mg /kg cisplatin, eller Quercetin plus cisplatin, ip. C13 * celle xenotransplantater (2 × 10

6) blev inokuleret i højre flanke af kvindelige athymiske nøgne nu /nu-mus. Tumorvolumener blev bestemt ved en skydelære og beregnet i overensstemmelse med formlen (bredde2 x længde) /2. (A), tumordannelse hos mus af cisplatin behandlingsgruppe og kombineret med quercetin gruppe. (B), Gennemsnitlig relativ tumorvækst som analyseret ved stigningen i tumor volumen for 8 mus per forsøgsgruppe ** Cisplatin plus Quercetin VS. Cisplatin,

P

0,001; * Quercetin VS. Kontrol,

P

= 0,015, ANOVA test efterfulgt af post hoc parvise sammenligninger; (C), Gennemsnitlig tumorvægt i hver gruppe. #Cisplatin Kombineret med quercetin VS. Cisplatin,

P

0,001, ANOVA test efterfulgt af post hoc parvise sammenligninger; (D), Immunohistokemisk analyse af 8-OHdG og SOD1 i xenotransplantattumorer fjernet fra nøgne mus. (E), kvantificering data for de forskelle i udtrykket SOD-1 og 8-OHdG, *: P 0,001, **:. P 0,001, ANOVA test efterfulgt af post hoc parvise sammenligninger

Quercetin forbedret udtryk for endogene antioxidant enzym SOD1 af kræft i æggestokkene celler

in vivo

, og forhindrede ROS-induceret skade

for at bekræfte den beskyttende effekt mod oxidativ skade ved Quercetin in vivo blev immunohistokemiske assays udført i tumorer fjernet fra nøgne mus xenograft model. 8-OHdG, en markør for oxidativ DNA stress, var placeret hovedsagelig i cancer cellekernen. I tumorer behandlet med vehical eller Quercetin alene, viste 8-OHdG farvning svag intensitet med snesevis af 0,4 og 0,6 hhv. I gruppen behandlet med cisplatin alene, næsten alle cancerceller vises ekstremt stærk 8-OHdG farvning med score 2.8. Som forventet udviste mus gruppe behandlet med cisplatin i kombination med Quercetin havde et meget lavere niveau på 8-OHdG farvning (score 1,6) i tumorer end den behandlet med cisplatin alene (fig. 6D-E).

DNA reparation enzymer forhindre ophobning af beskadiget DNA og antioxidanter beskytter celler mod frie radikaler. Vi har registreret SOD1 ekspression, som er en kritisk endogen antioxidant enzym for at tolerere den oxidative stress, for at finde ud af, om Quercetin påvirkes på aktiviteten af ​​endogen antioxidant enzym. Positiv udtryk for SOD1 var primært en cytoplasma mønster i æggestokkene cancerceller snarere end stromale celler. Antioxidant enzym SOD1 var stærkt overudtrykt i tumorer behandlet med Quercetin eller cisplatin plus quercetin (score 2,0 og 2,6) sammenlignet med tumorer behandlet med vehikel eller cisplatin alene (score 1,2 og 0,6 henholdsvis) (fig. 6D-E). Resultaterne viste, at Quercetin forøgede endogene antioxidant enzym SOD1 ekspression af ovariecancerceller

in vivo

, og forhindrede ROS-induceret skade.

Discussion

Som klassisk flavonoidforbindelse , Quercetin anbefales normalt at tage oralt hver dag i almene sundhedspleje og forebyggelse af kræft. Staedler

et al. Hej, fundet, at Quercetin ved koncentrationer på 5 uM og 10 uM kunne øge effekten af ​​100 uM doxorubicin i brystkræftceller in vitro [17], [18], mens andre forskere kom til forskellige konklusioner [8], [9]. Samuel

et al.

[8] rapporterede, at i kolorektal og prostata kræftceller, blev de terapeutiske virkninger af narkotika i kombination med Quercetin påvirket af de effektive doser og p53 status af cellerne (kombinationen af ​​5- Fu med op til 6 uM Quercetin fremmes cologenic overlevelse i p53 nul-celler, mens 50 pM Quercetin handlet modsatte rolle i p53 vildtypeceller). I denne undersøgelse Quercetin ved høje koncentrationer, enten alene eller kombineret med cisplatin viste antineoplastiske virkninger i æggestokkene cancer C13 * celler, mens lav koncentration (5 uM-30 uM) af Quercetin syntes at antagonisere de cytotoksiske virkninger af anti-neoplastiske midler herunder Cisplatin, 5-Fu, Taxol, og pirarubicin. Vi udforskede også den mekanisme af anti-apoptotiske effekt af Quercetin, når det kombineres med cisplatin.