PLoS ONE: Curcumin fremkalder celledød i kræft i spiserøret Celler gennem Modulerende Notch Signaling

Abstrakt

Baggrund

Curcumin hæmmer væksten af ​​esophageal cancer cellelinjer; imidlertid er virkningsmekanismen ikke godt forstået. Det bliver stadig mere tydeligt, at afvigende aktivering af Notch signalering er blevet forbundet med udviklingen af ​​kræft i spiserøret. Her har vi konstateret, at curcumin hæmmer esophageal kræft vækst via en mekanisme medieret gennem Notch signalvejen.

Metodologi /vigtigste resultater

I denne undersøgelse viser vi, at curcumin behandling resulterede i en dosis og tidsafhængig inhibering af proliferation og kolonidannelse i esophageal cancer cellelinjer. Endvidere curcumin behandling apoptose gennem caspase 3-aktivering, bekræftet ved en stigning i forholdet mellem Bax til Bcl2. Cell cyklus analyse viste, at curcumin behandling induceret celledød og ned regulerede cyclin D1 niveauet. Curcumin behandling resulterede også i reduceret antal og størrelse af esophagospheres. Endvidere curcumin behandling førte til reduceret Notch-1-aktivering, ekspression af Jagged-1 og dets nedstrømsmål Hes-1. Denne reduktion i Notch-1-aktivering blev bestemt til at være på grund af nedregulering af kritiske komponenter af y-sekretase komplekse proteiner, såsom Presenilin 1 og Nicastrin. Kombinationen af ​​en kendt γ-sekretase hæmmer DAPT og curcumin yderligere nedsat proliferation og apoptose i esophageal cancerceller. Endelig curcumin behandling nedregulere de udtryk for Notch-1 specifikke microRNAer miR-21 og miR-34a, og opreguleret tumor suppressor Lad-7a miRNA.

Konklusion /Betydning

Curcumin er et potent hæmmer af esophageal kræft vækst, der er rettet mod Notch-1 aktiverende y-sekretase komplekse proteiner. Disse data tyder på, at Notch signalering hæmning er en ny virkningsmekanisme for curcumin ved terapeutisk intervention i esophageal kræft

Henvisning:. Subramaniam D, Ponnurangam S, Ramamoorthy P, Standing D, Battafarano RJ, Anant S, et al . (2012) Curcumin fremkalder celledød i kræft i spiserøret celler gennem Modulerende Notch signalering. PLoS ONE 7 (2): e30590. doi: 10,1371 /journal.pone.0030590

Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget 31. oktober, 2011; Accepteret: December 19, 2011; Publiceret: 17 feb 2012

Copyright: © 2012 Subramaniam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af NIH tilskud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i spiserøret er den ottende mest almindelige hændelse kræft i verden og sjette i dødeligheden af ​​kræft [1]. I USA, 4-10 i 100.000 personer bukke under for sygdommen om året, og den samlede forekomst af sygdommen er størst i mænd over 50 år [2]. The American Cancer Society (ACS) anslås, at i 2011, ville 16,980 amerikanere (13.450 mænd og 3.530 kvinder) blive diagnosticeret med kræft i spiserøret. ACS skønnede også, at flertallet af disse personer [14, 710 amerikanere (11,910 mænd og 2.800 kvinder)] ville dø af kræft i spiserøret i 2011 [3]. Esophageal adenocarcinom, den største form for kræft i spiserøret i USA, er den mest hastigt stigende kræft i den vestlige verden. Det er generelt diagnosticeret på et sent tidspunkt, og har en dårlig prognose, med en overlevelse på mindre end 10% 5-årig periode. Selv om den nuværende behandling omfatter kemoterapi, stråleterapi, og om muligt esophagogastric resektion, mange patienter med esophageal adenocarcinom erfaring sygdomsprogression trods en sådan behandling, hvilket antyder, at sådanne tumorer er resistente over for standardbehandling.

Fordi konventionelle behandlinger , herunder kirurgisk resektion, kemoterapi og strålebehandling er ofte utilstrækkelige i behandling af denne sygdom, nye behandlingsmuligheder er kritisk behov. Trods fremkomsten af ​​nye målrettede midler og anvendelsen af ​​forskellige terapeutiske kombinationer, ingen behandlingsmuligheder er tilgængelige, der er helbredende hos patienter med fremskreden cancer. Størrelsen af ​​dette problem bemyndiger behov for nye terapeutiske midler, specielt anvendelsen af ​​midler til chemoprevention. Dette er mest attraktive for esophageal adenocarcinom da en præ-malign tilstand -Barrett øsofagus er en velkendt læsion.

Curcumin, en phyto-polyphenolisk pigment afledt af gurkemeje (

Curcuma longa

), har vist sig at have flere anticancer effekter, herunder inhibering af proliferation, induktion af apoptose, inhibering af angiogenese, og inhibering af DNA-topoisomerase II [4]. Curcumin inducerer også apoptose-uafhængig død såsom autophagy i esophageal cancerceller [5]. Nylige undersøgelser har vist, at curcumin fremmer apoptose, øger kemosensitivitet, og hæmmer NF-KB i esophageal adenocarcinom [6] [7].

Notch signalering spiller en afgørende rolle i udviklingen og homeostase af væv ved at regulere celle- fate beslutninger, proliferation, differentiering og apoptose. Notch signalvejen er impliceret i stamcelle selvfornyelse, celle-skæbne beslutsomhed, proliferation, differentiering og apoptose [8]. Notch signalering opreguleres i esophageal kræft og er blevet foreslået som et terapeutisk mål for esophageal cancere [9] [10]. Notch signalering initieres, når et hak ligand interagerer med et hak transmembrant receptor på en tilstødende celler [11] [12]. Denne proces normalt initierer γ-sekretase medieret proteolytisk frigivelse af Notch intracellulære domæne (NiCd), som igen, translokerer ind i kernen af ​​cellerne [13]. NiCd i kernen interagerer med C-promotor-bindende faktor-1 (CBF1) transkriptionel cofaktor og transaktiverer målet gener, såsom dem i den behårede og forstærker af split (HES) og Hes relateret til YRPW motiv (Hey) familier [ ,,,0],12] [14]. Nylige undersøgelser har påvist en sammenhæng mellem curcumin, Notch og NF-KB. Notch-1-signalering pathway er blevet vist direkte at blive aktiveret af NF-KB i orale cancerceller [15]. Endvidere curcumin-medieret inhibering af Notch-1-aktivering førte også til nedregulering af NF-KB og dens målgener, herunder Bcl-2, cyclin D1, vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), og matrixmetalloproteinase -9 (MMP-9 ) i orale pladecellecarcinom celler [4].

MikroRNA’er (miRNA) er korte ikke-kodende RNA’er, som binder til 3′-utranslaterede region (UTR) af sammenhørende messenger RNA’er (mRNA’er) gennem fuldstændig komplementær eller ufuldkommen baseparring undertrykke oversættelsen eller mindske stabiliteten af ​​de bundne mRNA’er [16]. Nogle miRNA er rapporteret som oncomirs der kunne fungere som enten onkogener eller tumor undertrykkere [17]. For eksempel MIR-21 formindsker tumorsuppressor Pdcd4 ekspression og fremmer invasion, intravasation og metastase i colorektal cancer [18]. Opregulering af MIR-21 er stærkt forbundet med både en høj Ki-67 proliferative indeks og tilstedeværelsen af ​​levermetastaser [19]. MIR-21 også reguleret PTEN-afhængige vej og påvirkede cellevækst, migrering og invasion af hepatocellulært carcinom [20]. Vi har for nylig demonstreret miRNA som biomarkører for Barretts øsofagus progression. MIR-21 er opreguleret 12.57-fold i esophageal cancer [21]. Et andet vigtigt miRNA er MIR-34, som har vist sig at deltage i reguleringen af ​​p53 og Notch veje i overensstemmelse med tumorsuppressoraktivitet [22]. En nylig undersøgelse viste, at der er en cross-talk mellem miRNA og Notch signalveje i tumor udvikling og progression [23]. Desuden Notch signalering og dets regler er kritisk vigtige på niveau med post-transkriptionel og /eller translationel regulering af gener ved miRNA i glioblastom [24]. På den anden side, så lad-7a nedsætter celledeling og migrering af glioblastom og reducerer tumorstørrelse i xenograftmodel [25].

I denne artikel har vi fastslået effekten af ​​curcumin på esophageal kræftceller og mekanisme medieret gennem Notch signalvej.

Materialer og metoder

celler og reagenser

TE-7, TE-10 er mennesker og ESO-1 er mus esophageal adenocarcinom kræft celler, der var venligst stillet til rådighed af Dr. Richard J. Battafarano, University of Maryland og dyrket i RPMI 1640 indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og 1% antibiotisk-anti-mykotiske opløsning (Mediatech Inc., Manassas, VA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Curcumin blev købt fra LKT Laboratories, St. Paul, MN. N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycin t-butylester (DAPT) blev indkøbt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

spredning og apoptoseassays

for at vurdere proliferation, celler blev podet på plader med 96 brønde og vokser natten over. Derefter blev cellerne behandlet med stigende doser af curcumin i 10% FBS indeholdende RPMI 1640. Analyse af celleproliferation blev udført ved enzymatisk assay som beskrevet [26]. For apoptose blev caspase 3/7 aktivitet målt ved anvendelse af Apo-one Homogen caspase-3/7 Assay kit (Promega, Madison, WI).

Kolonidannelse assay

Kort fortalt 6 brønd Skålene blev podet med 500 levedygtige celler og lodes vokse i 24 timer. Cellerne blev derefter inkuberet i nærvær eller fravær af 30 uM curcumin i 24 timer. Curcumin holdige medium blev derefter fjernet, og cellerne blev vasket i PBS og inkuberet i yderligere 10 d i komplet medium. Hver behandling blev udført tre gange. De opnåede kolonier blev vasket med PBS og fikseret i 10% formalin i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter vasket med PBS efterfulgt af farvning med krystalviolet. Kolonierne blev talt og sammenlignet med ubehandlede celler.

Cell cyklus analyser

Celler blev behandlet med 30 pM af curcumin til 12 og 24 timer, derefter blev cellerne trypsiniseret og suspenderet i phosphatbufret saltvand ( PBS). Single-cellesuspensioner blev fikseret under anvendelse af 70% ethanol i 2 timer, og efterfølgende permeabiliseret med PBS indeholdende 1 mg /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich), 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) og 2 ug DNase-frit RNase (Sigma-Aldrich) ved stuetemperatur. Flowcytometri blev gjort med en FACSCalibur analysator (Becton Dickinson, Mountain, View, CA), opfange 10.000 begivenheder for hver prøve. Resultaterne blev analyseret med ModFit LT ™ software (Verity Software House, Topsham, ME).

Real Time Reverse-transskription polymerasekædereaktion Analyse

Total RNA isoleret fra TE-7 celler ved hjælp TRIZOL reagens blev revers transkriberet med Superscript II revers transkriptase i nærvær af tilfældige hexanukleotid-primere (alle fra Invitrogen, Carlsbad, CA). Komplementære DNA’er blev derefter anvendt for Real Time PCR under anvendelse Jumpstart Taq-DNA-polymerase (Sigma-Aldrich) og SYBR Green nucleinsyrefarve (Molecular Probes, Eugene, OR). Crossing tærskelværdier for de enkelte gener blev normaliseret til p-Actin. Ændringer i mRNA-ekspression blev udtrykt som gange ændring i forhold til kontrol. Primere anvendt i denne undersøgelse var som følger: β-Actin: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 ‘og 5′-ATCATTCTCCTCCTCAGCG-3′; Cyclin D1: 5’-AATGACCCCGCACGATTTC-3 ‘og 5′-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3′; Notch-1: 5’-CACTGTGGGCGGGTCC-3 ‘og 5′-GTTGTATTGGTTCGGCACCAT-3′; HES-1 5’-AGGCGGACATTCTGGAAATG-3 ‘og 5′-CGGTACTTCCCCAGCACACTT-3’; Presenilin-1 5 ‘ATCATGCTCTTTGTCC-3’ og 5’TCTTCTGTGAATGGG-3 ‘; Nicastrin 5’-CAGATTGGCTGCCAGT-3 ‘og 5′-CTCCAGCAGAACCAT-3’.

miRNA-analyse

I alt miRNA blev isoleret ved hjælp af Mirvana ™ miRNA isolation kit (Ambion Inc., Grand Island, NY) . Total miRNA isoleret fra TE-7-celler blev udsat for omvendt transkription med Superscript ™ II RNase H-revers transkriptase og tilfældige hexanukleotid-primere (Invitrogen). CDNA blev efterfølgende brugt til at udføre real-time PCR ved SYBR kemi (SYBR® Green I, Molecular Probes) for pri-

Lad-7a

udskrift ved hjælp af specifikke primere og Jumpstart Taq DNA-polymerase (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO). Overfarten tærskelværdi vurderet af Real time PCR blev noteret for

pri-lad-7a

miRNA og normaliseret med

U6

pri-miRNA. Ændringerne i PRI-miRNA blev udtrykt som gange ændring i forhold til kontrol med ± SEM værdi. Anvendte primere er:

PRI-U6

: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ‘og 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’,

PRI-let-7a

: 5′-GAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTAGAA-3 ‘, 5’-AAAGCTAGGAGGCTGTACA-3 ‘. Pri-MIR-34 en 5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3 ‘og 5’GGCAGTATACTTGCTGATTGCTT-3′, PRI-MIR-21:. 5’-GCTTATCAGACTGATGTTGACTG-3 ‘og 5′-CAGCCCATCGACTGGTG-3’

Western blot-analyse

Cellelysater blev underkastet polyacrylamidgelelektroforese og blottet på Immobilon-P polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Bedford, MA). Notch-1, caspase 3, blev Bcl2 og Bax antistoffer købt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Cyclin D1, Notch-1, Jagged-1, Hes-1 og Actin antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA). Presenilin 1, 2, blev Nicastrin, APH1 og PEN2 antistoffer fra genscript Inc (Piscataway, NJ) og specifikke proteiner detekteres af forøget kemiluminescens-systemet (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Sfæroide assay

i dannelsen af ​​sfæroider, celler blev dyrket i RPMI 1640 (Mediatech) suppleret med 20 ng /ml bFGF (Invitrogen) 10 ml pr 500 ml af 50X B27 supplement (Invitrogen) EGF 20 ng /ml (Invitrogen) og antibiotika og antimykotika løsning. Celler blev podet ved lave densiteter (5000 celler /ml) i 6 brønd svagtklæbende plader. Cellerne blev behandlet med stigende koncentrationer af curcumin (0-50 uM). Efter 7 dage sfæroiderne blev fotograferet.

Immunfluorescensfarvning

Cellerne blev forgyldt på natten på cover-sedler på seks brønde. Efter behandling med 30 pM af curcumin i 24 timer blev cellerne derefter fikseret med paraformaldehyd i 15 minutter, skyllet med PBS og inkuberet med 2% bovint serumalbumin i PBS i 30 min. Cellerne blev derefter inkuberet natten over med anti-Notch-1, anti-Jagged-1, anti-Hes-1, anti-Presenilin 1 og anti-Nicastrin antistof hhv. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med Cy-3-konjugeret sekundært antistof i 30 minutter og vasket med PBS. Cell billeder blev observeret under et fluorescensmikroskop.

Statistisk analyse

Alle værdier er angivet som middelværdi ± SEM. Dataene blev analyseret ved anvendelse af en uparret 2-halede t-test.

P

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Curcumin hæmmer kræft i spiserøret cellevækst

Vi bestemmes effekten af ​​curcumin på esophageal cancercelleproliferation i en række forskellige dyrkede cellelinier (TE-7, TE-10 og ESO 1). Curcumin undertrykte signifikant spredning af kræft i spiserøret cellelinjer TE-7, TE-10 og Eso-1 i dosis og tidsafhængig måde. Denne anti-spredning effekt på tumorceller blev set inden for en 24 timers periode, der fortsatte med at stige betydeligt i løbet af den næste 72 timer (figur 1A). For at bestemme den langsigtede virkning af curcumin behandling blev celler behandlet med 30 pM curcumin i 24 timer, hvorefter cellerne fik lov til at vokse i normal medier. Curcumin behandling undertrykt kolonidannelse i alle esophageal cancer cellelinjer (figur 1b), hvilket antyder, at curcumin effekt på tumorcellerne var irreversibel. Cyclin D1 er et cellecyklus regulerende protein, der regulerer G1 til S-faseovergangen af ​​cellecyklussen og fungerer som en cofaktor for adskillige transkriptionsfaktorer i talrige cellelinier. Denne cyclin danner et kompleks med og fungerer som regulatorisk underenhed af CDK4 eller CDK6, hvis aktivitet er påkrævet for G1 /S transition. Cyclin D1 overekspression har været knyttet til udviklingen og progressionen af ​​kræft [27]. Curcumin behandling inhiberede cyclin D1-mRNA og proteinekspression antyder, at det hæmmer cancercelleproliferation. På den anden side blev ekspression af p21-protein forøget (figur 1C og D).

(A) Curcumin inhiberer proliferation af esophageal cancerceller. Celler blev inkuberet med stigende doser af curcumin (0-50 uM) i op til 72 timer og analyseret for celleproliferation. Curcumin behandling resulterede i en signifikant dosis- og tidsafhængig formindskelse i celleproliferation i alle tre celler sammenlignet med ubehandlede kontroller. (B) Curcumin inhiberer kolonidannelse. Esophageal cancer celler blev inkuberet med 30 pM af curcumin i 24 timer og fik lov at vokse til kolonier i 10 dage. Inkubation med curcumin hæmmer kolonidannelse. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) cyclin D1 er et cellecyklus regulerende protein, og som er involveret i cellecyklusstandsningen. RNA fra TE-7 inkuberes med 30 pM curcumin blev udsat for Real Time PCR for cyklin D1 mRNA-ekspression. Curcumin behandling inhiberer signifikant cyclin D1-mRNA-ekspression (* p 0,05). (D) Lysater fra TE-7 inkuberes med 30 pM curcumin blev analyseret ved Western blotting for cyclin D1 ekspressionsniveauer under anvendelse af muse-anti-cyclin D1-antistof. Curcumin behandling hæmmer cyclin D1 proteinekspression.

Curcumin inducerer celledød ved apoptose

I betragtning af de virkninger af curcumin på undertrykkelse af spredning og kolonidannelse, vi næste afgøres, om curcumin påvirker cellecyklus progression. Behandling med curcumin signifikant celledød TE-7-celler inden for 12 timer og kontinuerligt øges op til 24 timer (figur 2A). Sådanne lignende stigninger i celledød, er blevet observeret i andre celletyper [28]. Curcumin er kendt for at inducere apoptose i forskellige cancerceller. De caspaser er en familie af proteiner, der er kendt for udførelsen af ​​apoptose. Caspase-3 og caspase-7 er centrale effektormolekyler vides at inducere apoptose i forskellige cancerceller ved at amplificere signalet fra initiator-caspaser, såsom caspase-8 eller caspase-10. Øget aktivering af effektor caspase-3 og caspase-7 blev observeret inden for 24 timer i TE-7 cellelinie behandlet med curcumin tyder induktion af apoptose (figur 2B). Western blot-analyser af TE-7 cellelysater viste en signifikant fald i procaspase-3 i curcumin behandlet tumorceller (figur 2C). Yderligere bekræftelse af, at cellerne undergår apoptose blev opnået ved Western blot-analyser for anti-apoptotisk Bcl2 og BclxL og pro-apoptotiske Bax proteiner. Curcumin behandling inhiberede ekspressionen af ​​Bcl2 og BclxL og øget Bax proteinniveauer. Disse data antyder, at curcumin er en potent inducer af apoptose i esophageal cancerceller (fig 2D).

(A) Cellecyklusanalyse af curcumin behandlede celler. TE-7-celler blev behandlet med 30 pM af curcumin i 12 og 24 timer, undersøgt ved flowcytometri efter propidiumiodidfarvning for DNA-indhold. Curcumin behandling fører til øget antallet af døde celler. Grafer er repræsentative for data indsamlet fra tre eksperimenter. (B) Curcumin inducerer caspase-3, en apoptose mediator. TE-7-celler inkuberet med 30 pM af curcumin blev analyseret for apoptose ved caspase-3 og-7-aktivering. Curcumin behandling øget antallet af celler, som undergår apoptose sammenlignet med ubehandlede kontroller (* p 0,05). (C) Lysater fra TE-7 celler inkuberet med 30 pM af curcumin blev analyseret ved Western blotting for caspase-3-protein niveauer ved hjælp af kanin-anti-caspase-3-antistof. Curcumin behandling resulterede i nedsat procaspase-3. (D) Lysater fra TE-7 celler inkuberet med 30 pM af curcumin blev analyseret ved Western blotting for Bcl2, BclxL, og Bax proteiner. Curcumin reducerer ekspressionen af ​​anti-apoptotiske proteiner Bcl2 og BclxL, mens forøget ekspression af pro-apoptotiske proteiner i behandlede celler i forhold til ubehandlede celler.

Curcumin hæmmer esophagosphere dannelse

I betragtning af at curcumin hæmmer colonosphere dannelse i colon cancerceller og påvirker Notch signalvej proteiner. Derefter bestemte vi effekten af ​​curcumin på esophageal cancer cell klumpformet formation. Curcumin behandling inhiberede signifikant esophagosphere dannelse på en dosisafhængig måde i begge TE-7 og TE-10-celler (figur 3A). Sfæroiderne størrelse, blev numre talt. Curcumin behandling reducerede både primær og sekundær klumpformet dannelse (figur 3B og C).

(A) TE-7 og TE-celler blev dyrket i lave adhærente plader og behandlet med stigende koncentrationer af curcumin (0-50 uM) og udført for sfæroiden assay. Efter en uge blev sfæroiderne fotograferet. (B) Sfæroide blev talt og udført bar diagram. Curcumin behandling hæmmede markant esophageal kræft celler sfæroider (* p 0,05). (C) De primære sfæroider blev opsamlet og separeret i enkeltceller og genudpladet. Curcumin behandling signifikant inhiberede esophageal cancer cells sekundære sfæroider (* p 0,05).

Curcumin hæmmer Notch aktivering ved nedregulering af γ-sekretasekomplekset

Notch-1 er en cellemembran forbundet protein. Ligand-engagementet forårsager det intracellulære domæne af det transmembrane receptor Notch (NiCd) at blive spaltet fra membranen gennem virkningen af ​​γ-sekretasekomplekset. NiCd translokerer til kernen, hvor det associerer med en familie af DNA-bindende proteiner til at aktivere transskription af Notch målgener, såsom behårede og enhancer-of-split 1 (

Hes1

) [29]. Vi bestemt effekten af ​​curcumin på Notch-1, dets ligand takkede-1 og Hes-1 i TE-7 celler. Curcumin behandling signifikant nedreguleret Notch-1 og dens ligand Jagged-1 og nedstrøms målproteiner Hes-1 både mRNA og protein niveauer (figur 4A og B). Protein niveauer blev bekræftet ved immun-fluorescens farvning, hvor signifikant lavere niveauer af nukleare Notch-1 og cytoplasmatisk Jagged-1 blev observeret i de curcumin behandlede celler (figur 4C).

(A) realtid revers transkription -PCR-analyse af totalt RNA fra TE-7-celler efter 30 uM curcumin behandling i 24 timer viste reduktion i ekspressionen af ​​Notch-1, dets ligand Jagged-1 og dets målgenprodukter Hes-1-mRNA (* p 0,05). (B) lysater fra curcumin behandling forårsagede signifikant reduktion i ekspressionen af ​​spaltede Notch-1, dens ligand Jagged-1 og dets målgen Hes-1 proteinniveauer i TE-7-celler. (C) TE-7-celler behandlet med 30 pM af curcumin i 24 timer blev underkastet immuno-fluorescerende farvning ved anvendelse af anti-Notch-1, anti-Jagged-1 og anti-Hes-1 antistoffer. Curcumin behandling resulterede i lavere niveauer af Notch-1-protein i kernen og reduceret Jagged-1 og Hes-1-ekspression i TE-7-celler.

Derefter bestemte vi den mekanisme, hvormed curcumin påvirker hak- 1 aktivering. γ-sekretase er en multi-proteinkompleks indeholdende et intra-membran spaltende protease. Komplekset har en voksende liste af proteiner substrater, herunder Notch receptorer. De fire komponenter af γ-sekretasekomplekset, Presenilin 1, er Nicastrin, PEN2, og Aph1 alle menes at være essentiel for aktivitet [13] [30] [31]. Det katalytiske domæne bopæl inden Presenilin, mens Nicastrin er blevet foreslået at være kritiske for substratgenkendelse [32]. Curcumin behandling resulterede i nedregulering i ekspressionen af ​​y-sekretase komplekse proteiner, Presenilin 1 og 2, Nicastrin, APH1 og PEN2 (figur 5A, B og C). Disse data antyder, at curcumin medieret nedregulering af Notch-signalvejen sker dels gennem hæmning af γ-sekretasekomplekset.

(A) realtid revers transkription-PCR-analyse af totalt RNA fra TE- 7-celler efter 30 uM curcumin behandling i 24 timer viste reduktion i ekspressionen af ​​Presenilin 1 og Nicastrin mRNA (* p 0,05). (B) lysater fra curcumin behandling forårsagede signifikant reduktion i ekspressionen af ​​y-sekretase komplekse proteiner presenilin 1 og 2, Nicastrin, APH1 og PEN2 proteinniveauer i TE-7-celler. (C) TE-7-celler behandlet med 30 pM af curcumin i 24 timer blev underkastet immuno-fluorescerende farvning ved anvendelse af anti-Presenilin 1 og anti-Nicastrin antistoffer. Curcumin behandling resulterede i lavere niveauer af Presenilin 1 og Nicastrin udtryk i TE-7cells.

Kombination af curcumin og en γ-sekretasekomplekset inhibitor DAPT yderligere påvirker kræft i spiserøret vækst

Behandling med kombination af curcumin og en γ-sekretasekomplekset inhibitor (GSI) DAPT yderligere inhiberer Notch-1 målproteiner Hes-1 og cyclin D1-ekspression (figur 6A). Vi udførte kombination af curcumin med en γ-sekretasekomplekset inhibitor DAPT på proliferation og apoptose. Kombination af curcumin og DAPT behandlingen yderligere inhiberer proliferation og inducerer apoptose i TE-7-celler (figur 6B og C). Lignende resultater blev observeret i TE-10-celler (data ikke vist).

(A) TE celler behandlet med DAPT (50 uM) og curcumin (30 uM) alene og i kombination i 24 timer. Lysater blev analyseret ved western blotting. HES-1 og cyclin D1-proteinerne blev yderligere reduceret med kombinationen af ​​de to forbindelser. (B) TE celler behandlet med DAPT (50 uM) og curcumin (30 uM) alene og i kombination i 48 timer. Celleproliferation blev inhiberet signifikant efter behandling med kombinationen af ​​DAPT og curcumin sammenlignet med hver curcumin alene er ved hexosaminidase enzymassay (*

P

0,05). (C) Apoptose blev signifikant induceret efter behandling med kombinationen af ​​DAPT og curcumin sammenlignet med hver curcumin alene er ved Apo-one Homogen caspase-3/7 Assay kit (*

P

0,05).

Curcumin hæmmer OncomiR miRNA og øger tumor suppressor miRNA i esophageal kræftceller

Curcumin ændrer microRNA ekspression i colon [33] bugspytkirtlen [34], bryst [35], blære [36] og lunge [37] kræftceller. Vi har for nylig påvist, at miRNA som biomarkører for Barretts øsofagus progression og MIR-21 opreguleres 12,57 fold i esophageal cancer [21]. Derefter bestemte vi effekten af ​​curcumin på OncomiR miRNA og tumor suppressor miRNA esophageal cancerceller. Curcumin behandling væsentligt ned reguleret miR-21 og miR-34a udtryk mens opregulering lad-7a miRNA udtryk (figur 7A og B).

(A) realtid revers transkription-PCR-analyse af total miRNA fra TE- 7-celler efter 30 uM curcumin behandling i 24 timer. Curcumin behandling signifikant hæmmer oncomiR miRNA udtryk i TE-7 celler (*

P

0,05). (B) Curcumin behandling betydeligt opreguleret tumorsuppressor Lad-7a miRNA udtryk i TE-7 celler.

Diskussion

Kræft i spiserøret er en af ​​de sjette førende årsager til kræft- relaterede dødsfald i den vestlige verden. Samlet forekomsten af ​​sygdommen er størst hos mænd over 50 år [2]. Kræft i spiserøret er generelt diagnosticeret på et sent tidspunkt, og har en dårlig prognose, med en overlevelse på mindre end 10% 5-års. Den betydelige sygelighed, toksicitet og dårlige responsrater på nuværende kemoterapi har ført til søgninger efter mindre giftige alternative behandlingsformer. Vi og andre har vist, at curcumin hæmmer proliferationen og inducerer apoptose i en række forskellige tumorceller, herunder pancreas, bryst, colon, oral, lunge, melanom, myelom, leukæmi, og prostatacarcinom. Tidligere undersøgelser har vist, at curcumin undertrykker spredning og øger apoptose i esophageal cancerceller [5] [6] [38] [39].

De data, der præsenteres i denne artikel viser, at curcumin hæmmer selektivt spredning af esophageal kræftceller, undertrykker dannelsen af ​​esophageal cancer celle kolonier, fremmer cellecyklusstop og apoptose, hæmmer esophagosphere dannelse, nedregulerer hak signalering og dens y-sekretase komplekse proteiner, og også hæmmer OncomiR miRNA udtryk og inducerer tumor suppressor miRNA udtryk. Disse resultater er yderligere præsenteret i det skematiske diagram i figur 8. Vores resultater viser, at curcumin effektivt kan undertrykke celleproliferation i 24 timer. Desuden er de inhiberende virkninger på tumorceller synes at være vedvarende og irreversibel efter 24 timers behandling. Vores data med cyclin D1 er spændende i, at der var en reduktion i sit udtryk på 24 timer. Dette kunne have resulteret i celler, der undergår G0-G1 arrest da proteinet er ansvarlig for progression gennem G0-G1 /S faseovergang [40]. Tilsvarende curcumin-induceret G0 /G1 arrest har også vist sig at forekomme i andre cancer celletyper, herunder colon og gastriske cancere, og i mantlecellelymfom [28] [41]. Faktisk observerede vi en signifikant stigning i døde celler i de esophageal cancerceller selv ved 12 timer efter inkubation med curcumin, som efterfølgende førte til celledød.

Vores undersøgelser viser, at curcumin hæmmer ekspressionen af ​​Jagged-1 og Notch-1-receptoren. Curcumin hæmmer også y-sekretase komplekse proteiner, for derved at inhibere spaltning af Notch-receptoren. Som et resultat heraf bliver Notch intracellulære domæne (NiCd) ikke frigives og derfor ikke translokere til kernen for at aktivere nedstrøms målgener c-myc og cyclin D1. Dette resulterer i inhibering af celleproliferation og af stamceller regenerering, mens samtidig induktion af apoptose.

I den foreliggende undersøgelse har vi også fundet, at curcumin nedregulerer Notch signalering via inhibering af den γ-sekretasekomplekset. Curcumin hæmmer Notch-1 og dens ligand Jagged-1 i esophageal cancerceller. Vi fandt også, at curcumin inhiberede ekspressionen af ​​Notch-1 nedstrømsmål

Hes-1

. For nylig er det blevet rapporteret, at Notch-vejen spiller kritiske roller i processerne i tumorcelleproliferation, apoptose og stamcelle vedligeholdelse og er tæt forbundet med tumorigenese i esophageal cancerceller [42]. Derfor kunne curcumin medieret cellevækstinhiberingen være delvist medieret via inaktivering af Notch-1-aktivitet. Dette blev yderligere bekræftet ved en kombination af en GSI og curcumin, hvilket yderligere inhiberede proliferation og apoptose. Tilsvarende kombinationen af ​​curcumin med et GSI yderligere inhiberede HES-1 og cyclin D1 udtryk. Imidlertid Notch-1 er ikke den eneste vej aktiv i esophageal cancer som mange andre cellulære veje aktiveres [7] [39]. Det ville være interessant at bestemme, om curcumin er lige så potent til inhibering andre signaltransduktionsveje. Desuden ville det være interessant at bestemme, om ektopisk ekspression af Notch nedstrøms target gener, såsom Hes-1 og c-myc i forholdene for Notch knockdown eller redning beskytter mod curcumin-medieret celledød.

Notch signalering er påkrævet for stamcelle selvfornyelse og opretholde stemness [43].