PLoS ONE: plakoglobin Reducerer in vitro vækst, migration og invasion af kræft i æggestokkene celler, der udtrykker N-Cadherin og Mutant p53

Abstrakte

Afvigende udtryk for cadheriner og catenins spiller afgørende roller i æggestokkene udvikling kræft og progression. Plakoglobin (PG, γ-catenin) er en paralog af β-catenin med dobbelt klæbende og signalanlæg funktioner. Mens β-catenin er kendt onkogen funktion, PG fungerer generelt som en tumor /metastase lyddæmper. Vi har for nylig viste, at PG interageret med p53, og at dens vækst /metastaser hæmmende funktion kan medieres af denne interaktion. Meget lidt er kendt om den rolle, PG i kræft i æggestokkene. Her undersøgte vi

in vitro

tumor /metastase suppressor virkninger af PG i æggestokkene kræft cellelinjer med mutant p53 udtryk og forskellige cadherin profiler. Vi viste, at N-cadherin ekspression og E-cadherin og PG deficiente ES-2 celler var stærkt vandrende og invasiv, hvorimod OV-90 celler, som udtrykker E-cadherin, PG og meget lidt /ingen N-cadherin ikke var. Exogen udtryk for PG eller E-cadherin eller N-cadherin knockdown i ES-2-celler (ES-2-E-cad, ES-2-PG og ES-2-SHN-cad) betydeligt reduceret deres migration og invasion. Også, PG ekspression eller N-cadherin knockdown faldt betydeligt ES-2 celler vækst. Endvidere PG interageret med begge cadheriner og med vildtype og mutant p53 i normale ovarie og ES-2-PG-cellelinier, henholdsvis

Henvisning:. Alaee M, Danesh G, Pasdar M (2016) plakoglobin Reducerer

in vitro

vækst, migration og invasion af kræft i æggestokkene celler, der udtrykker N-Cadherin og Mutant p53. PLoS ONE 11 (5): e0154323. doi: 10,1371 /journal.pone.0154323

Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institut, KINA

Modtaget: 9. december 2015; Accepteret: April 12, 2016; Udgivet: Maj 4, 2016

Copyright: © 2016 Alaee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af den canadiske Breast Cancer Foundation, Prairies /NWT (MP, drift); Alberta Cancer Foundation (MA, kandidat fællesskab); Kvinder Børns Health Research Institute (GD, Sommer studentship)

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft i æggestokkene (OVCA), den femte mest udbredte. kræft hos kvinder er den hyppigste årsag til alle kvindelige reproduktive kræftdødsfald på verdensplan, med et samlet fem års overlevelse på ~ 45% [1]. Den største form for OVCA er epitelial ovariecancer (EOC), som tegner sig for ~ 80% af alle æggestokkene neoplasmer [2]. EOCs klassificeres i type I og type II [3]. Type I tumorer er genetisk stabile, langsomt voksende, og har relativt god klinisk resultat. Men de fleste af OVCA er type II. Over 90% af disse tumorer havnen p53 mutationer, er genetisk ustabile, meget aggressiv og har dårlig klinisk resultat [4-6].

TP53

mutationer menes at være en tidlig begivenhed under udviklingen af ​​type II tumorer og bidrage til både metastatisk progression og kemoresistens [7-12]. p53 er en transkriptionsfaktor og tumor suppressor der spiller væsentlige roller i regulering af celleproliferation, overlevelse, ældning, apoptose og metabolisme [13]. Som reaktion på stress, p53 aktiverer DNA beskadigelse respons, cellecyklusstandsning og celledød [14,15]. Forskellige posttranslationelle modifikationer og protein-protein interaktioner regulerer p53 stabilitet og funktioner [16]. Vi har identificeret plakoglobin (PG, γ-catenin) som en ny interagerende partner for både vildtype (WT) og mutant p53 (mp53) [17,18].

plakoglobin er et medlem af familien af ​​Armadillo proteiner og en paralog af β-catenin [19,20]. I modsætning, β-catenin, hvilket kun associerer med adherensovergange og besidder velkendte onkogene funktioner, PG er en tumor /metastase suppressor protein og deltager i dannelsen af ​​både adherensovergange og desmosomer [19,21]. PG kan give vækst /metastase inhibitoriske virkninger via dets interaktioner med cadheriner og induktion af kontaktinhibering af vækst [19]. Desuden kan det interagere med et antal intracellulære partnere, herunder transkriptionsfaktorer [17-19,22-27]. Vi har vist, at PG interagerer med p53 og dets tumor /metastase suppressorfunktion kan, i det mindste delvis, være medieret af denne interaktion [17,18].

En række undersøgelser har antydet, at tabet af cadherin- cateninkomplekset og aktivering af β-catenin onkogen funktion spiller afgørende roller i lokal invasion af ovarietumorceller og efterfølgende metastase [28-31]. Endvidere har tabet af heterozygositet af PG-genet (JUP) blevet rapporteret i sporadiske OVCAs [32]. Men meget lidt er kendt om den rolle, PG i OVCAs. I denne undersøgelse har vi vurderet de potentielle tumor /metastase suppressor funktioner af PG i OVCAs, ved anvendelse af de normale ovariecellelinie IOSE-364 og OVCA cellelinier OV-90 (PG og E-cadherin positive, mp53 udtrykkende), ES-2 ( PG og E-cadherin negative, N-cadherin positive og mp53 udtrykkende), ES-2-PG (ES-2 transfektanter udtrykker PG), ES-2-E-cad (ES-2 transfektanter udtrykker E-cadherin) og ES- 2-SHN-cad (ES-2 celler, i hvilke N-cadherin er blevet slået ned). Vi undersøgte PG niveauer, lokalisering og interaktioner med E- og N-cadherin og p53 og vurderede vækst, vandrende og invasive egenskaber af forskellige cellelinjer. Resultaterne viste, at PG interageret med både cadheriner og p53. Exogen ekspression af E-cadherin eller PG eller knockdown af N-cadherin signifikant reducerede migration og invasion af ES-2-celler. Desuden PG udtryk og N-cadherin knockdown, men ikke E-cadherinekspression reducerede væksten ES-2-celler betydeligt.

Materialer og metoder

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

IOSE -364 (herefter IOSE) blev dyrket i en 1: 1 M199 og M105 MCDB medier plus 5% FBS og 1% PSK (Penicillin, streptomycin, kanamycin). OV90 celler blev opretholdt i de samme M199 og MCDB M105 medier plus 15% FBS og 1% PSK. ES-2 celler blev dyrket i McCoys 5a medier afsluttet med 10% FBS og 1% PSK. ES-2-E-cad og ES-2-PG-celler blev dyrket i ES-2-medier indeholdende 400 ug /ml (udvælgelse) eller 200 ug /ml (vedligeholdelse) G418. ES-2-shNcad transfektion myrer blev dyrket i ES-2 medier med 1 pg /ml (udvalg) eller 0,5 mg /ml (vedligeholdelse) puromycin.

transfektion

plasmider koder E-cadherin og PG er blevet beskrevet [33, 34]. Kulturer af ES-2-celler i 60 mm eller 100 mm skåle blev transficeret ved 50-75% konfluens med 10-25μg af DNA ved anvendelse calciumphosphat. Tyve timer efter transfektion blev cellerne skyllet med PBS og fik lov til at komme sig i 24 timer i komplet vækstmedium. For at vælge stabile transfektanter, 72 timer efter transfektion medier indeholdende 400 ug /ml G418 (ES-2- PG og ES-2- E-cad transfektanter) blev tilsat til celler og resistente kolonier udvalgt til 3-4 uger. Resistente kloner blev opretholdt i 200 ug /ml G418 og screenet for PG og E-cadherin ekspression ved immunfluorescens og immunoblotting assays.

N-cadherin knockdown

Humant N-cadherin lentiviral shRNA plasmid [35 ] blev anvendt til at transficere Phoenix-ampho celler under anvendelse calciumphosphat. Lentivirale partikler indsamlet ved 48 og 72 timer efter transfektion blev kombineret og filtreret ved anvendelse af et 0,45 um med lav proteinbinding filter. Lentivirale partikler blev anvendt til at transducere ES-2 celler i nærvær af 8 ug /ml polyberene (Santa Cruz, Canada). Puromycin-resistente stabile cellelinier, der udtrykker N-cadherin shRNAs (ES-2-SHN-cad) blev isoleret og N-cadherin niveau vurderet ved immunoblot og immunofluorescens.

immunoblotanalyse

Konfluente 100 mm dyrkningsplader blev skyllet med koldt PBS og solubalized i SDS-prøvebuffer (10 mM Tris-HCI pH 6,8, 2% (vægt /volumen) SDS, 50 mM dithiothreitol, 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 1 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4). Ens mængder af totale celleproteiner blev adskilt ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (BioRad, Canada). Membranerne blev inkuberet i specifikke primære antistoffer natten over ved 4 °

C efterfulgt af passende sekundære antistoffer ved stuetemperatur (tabel 1). Membraner blev scannet ved hjælp af en Odyssey CLX infrarød billeddannelse system.

Immunofluorescens

Konfluente cellekulturer blev fastsat på dækglas og skylles med koldt PBS indeholdende 1 mM hver af NaF, Na

3VO

4 og CaCl

2. Celler blev fikseret med 3,7% formaldehyd i 20 minutter og ekstraheret med CSK puffer (50 mM NaCl, 300 mM sucrose, 10 mM PIPES pH 6,8, 3 mM MgCb

2, 0,5% Triton X-100, 1,2 mM PMSF og 1 mg /ml DNase og RNase; [17]) i 10 minutter. Dækglas blev blokeret med 4,0% gedeserum og 50 mM NH

4CL

4 i PBS indeholdende 0,2% BSA i 1 time. Dækglas blev derefter inkuberet i de specifikke primære antistoffer i 1 time efterfulgt af sekundære antistoffer i 30 minutter ved koncentrationer angivet i tabel 1. Kerner blev modfarvet med DAPI (1: 2000). Dækglas blev monteret i Elvanol indeholdende 0,2% (vægt /volumen) paraphenylendiamin (PPD) og ses med en 63x objektiv linse et Zeiss konfokalt mikroskop.

Immunopræcipitation

Kulturer blev dyrket til konfluens i 100 mm skåle og skylles med koldt PBS indeholdende 1 mM NaF, Na

3VO

4 og CaCl

2. Celler blev ekstraheret i 1 ml lysepuffer (50 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0.7μg /ml pepstatin, 1 mM Na

3VO

4, 1 mM NaF, og protease inhibitor cocktail) i 20 minutter på en rocker ved 4 ° C. Celler blev skrabet og centrifugeret ved 48000xg i 10 minutter. Supernatanter blev forarbejdet for immunopræcipitation med p53 og PG-antistoffer (tabel 1) og 40 pi protein G agarose (Thermo Fisher Scientific, Canada) perler natten over på en rocker-rotator ved 4 ° C. Prøverne blev derefter centrifugeret ved 14000xg i 2 min, blev perlerne fjernet, og supernatanterne forarbejdet til en anden immunopræcipitation i 3 timer. Perler fra de to immunopræcipitationer blev kombineret og vasket tre gange med lysisbuffer. Immune komplekser blev solubiliseret i 60 pi SDS-prøvebuffer, adskilt ved SDS-PAGE og forarbejdet til immunoblot som beskrevet ovenfor.

Vækst, migration og invasion assay

Til in vitro vækst-assay, 3×10

4-celler fra ES-2, ES-2-E-cad, ES-2-PG og ES-2-SHN-cad-celler blev udpladet i en 24-brønds plade. 1, 3, 5 og 7 dage efter udpladning kulturer blev trypsiniseret, og cellerne blev talt. Hvert tidspunkt repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg.

I cellemigration assays, 2 × 10

5-celler blev resuspenderet i 0,5 ml serumfrit medium og udpladet i det øvre kammer af transwell inserts (3 um pore, 6.5mm diameter BD Biosciences, CA, USA). Normalt medium indeholdende 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer og kulturer blev inkuberet i 16 timer ved 37 ° C. Insertioner blev derefter overført til nye retter og skylles med PBS for at fjerne ikke-vedhæftede celler. Inserter blev fikseret med 3,7% formaldehyd (i PBS) i 2 minutter, permeabiliseret med 100% methanol i 20 minutter og farvet med Giemsa farve i 15 minutter ved stuetemperatur. Efter farvning blev membranerne betragtes under et omvendt mikroskop ved anvendelse af en 20 x objektiv linse og fotograferet.

I Matrigel invasion assays blev celler sultet i serum-frit medium i 24 timer før assayet. For hver cellelinie, 5 × 10

4-celler i 0,2 ml serumfrit medium blev udpladet i det øverste rum i Matrigelcoatede invasion kamre (8 um pore PETE membran, BD Biosciences). Fibroblast konditionerede medier (0,8 ml) blev tilsat til de nederste kamre og pladerne blev inkuberet natten over ved 37 ° C. Efter 16 timer blev membraner udvundet og forarbejdet som beskrevet for migration assay. Monteret membraner blev set under et 20x objektiv linse et omvendt mikroskop og fotograferede.

De migrerede /invaderede celler blev talt i 5 tilfældige felter for hver membran ved hjælp ImageJ Cell Counter program. Numre for hver cellelinje blev beregnet og normaliseret til svarer til en normal cellelinje eller parentale utransficerede celler og histogrammer konstrueret. Histogrammer repræsenterer gennemsnittet af mindst 3 uafhængige assays for hver cellelinie.

Statistisk analyse

Værdier er præsenteret som middelværdi ± SD. Statistiske forskelle mellem grupper blev vurderet ved Students t-test.

P

-værdi. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Protein udtryk for epitel og mesenchymale markører og p53 i forskellige OVCA cellelinjer

Protein ekspression af E-cadherin, N-cadherin, plakoglobin, cytokeratiner, vimentin og p53 i IOSE, ES-2 og OV-90-celler blev påvist under anvendelse immunoblotanalyse (figur 1). IOSE celler havde meget lidt, om nogen, E-cadherin og udtrykte N-cadherin og PG. Disse celler udtrykte også cytokeratiner, vimentin og p53. Disse observationer var i overensstemmelse med tidligere resultater indikerer, at normale OSE celler viste både epitel og mesenkymale markører [36]. I modsætning hertil OV-90-celler, som udtrykker mp53 [37] havde ingen påviselig N-cadherin, lave niveauer af vimentin og høje niveauer af epiteliale markører, herunder E-cadherin, PG og cytokeratiner. ES-2-celler, som også udtrykker mp53 [38, 39], viste en mere mesenchymal fænotype, manglede E-cadherin og PG og udtrykte N-cadherin, vimentin og meget lave niveauer af cytokeratiner.

totale cellelysater fra IOSE-364, blev ES-2 og OV-90-celler behandlet til immunoblotanalyse under anvendelse af N-cadherin, E-cadherin, plakoglobin, vimentin, cytokeratiner og p53 antistoffer. Lige belastninger blev bekræftet ved at behandle de samme lysater med actin antistoffer.

Niveauer og lokalisering af E-cadherin, N-cadherin og plakoglobin i normale og karcinom æggestokkene cellelinjer

Subcellulær fordeling og potentiel co-lokalisering af E- /N-cadherin med PG blev undersøgt ved dobbelt immunofluorescens-farvning (figur 2). I IOSE celler, i overensstemmelse med de immunblotresultaterne, E-cadherin niveauer var upåviselige hvorimod N-cadherin og PG blev udtrykt i høje niveauer og blev co-uddelt på membranen (fig 2, IOSE). I OV-90-celler, høje niveauer af E-cadherin og PG var til stede og blev colocalized på membranen. Vi har detekteret også næppe distribueret små pletter af N-cadherin positive celler i OV-90 kulturer. I disse plastre, N-cadherin colocalized med PG (fig 2, OV-90). I ES-2-celler, var der ingen påviselig E-cadherin eller PG, hvorimod de udtrykte høje niveauer af N-cadherin, som blev fordelt i hele cytoplasmaet (fig 2, ES-2). Overensstemmelse med fraværet af PG og klæbende vejkryds, ES-2 celler udviste betydeligt mindre celle-til-celle-kontakt og deres morfologi var tydeligt forskellig end IOSE og OV-90-celler.

IOSE-364, ES-2 og OV-90-celler blev dyrket på dækglas og behandlet til dobbelt immunfluorescensfarvning. E-cadherin (E-cad, rød) eller N-cadherin (N-cad, rød) og plakoglobin (PG, grøn) antistoffer blev anvendt ved koncentrationer angivet i tabel 1. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Bar, 25 um.

Fraværet af E-cadherin og PG udtryk og tilstedeværelsen af ​​N-cadherin bidrage til de vandrende og invasive egenskaber af ES-2 celler

Tidligere, vi har vist, at ekspressionen af ​​PG i PG-deficiente carcinomaceller som mangler E-cadherin og hurtig N-cadherin nedsætter deres

in vitro

vækst, migration og invasion [33, 34]. For at undersøge, om PG havde lignende virkninger i OVCA celler, vi først undersøgt migrationen og invasion egenskaber IOSE, OV-90 og ES-2 celler. Så vi eksogent udtrykte E-cadherin eller PG eller slået ned N-cadherin i disse celler og vurderet ændringer i deres vækst, migration og invasion. Som afbildet i figur 3A viste OV-90-celler signifikant lavere migration og invasion forhold til IOSE celler (8,4% og 0,4%, henholdsvis). I modsætning ES-2 celler var signifikant mere vandrende og invasive sammenligne at IOSE celler (138% og 196,4%, henholdsvis).

(A) Migration (Venstre) og invasion (Højre) i IOSE-364, OV -90, ES-2 celler. Kulturer blev forarbejdet til in vitro migration og invasion-assays som beskrevet i Materialer og Metoder. Antallet af migrerede /invaderede celler blev normaliseret til de af de IOSE-364 celler. (B) Ekspression af E-cadherin, N-cadherin og plakoglobin i ES-2 transfektanter udtrykker E-cadherin (ES-2-E-cad) eller plakoglobin (ES-2-PG) eller N-cadherin shRNAs (ES-2 -shN-cad). Stabile transfektanter blev bearbejdet til immunoblotting under anvendelse E-cadherin, plakoglobin og N-cadherin antistoffer. For at bekræfte lige belastninger, blev de samme cellelysater forarbejdet med aktin antistoffer. (C) Subcellulær distribution og co-lokalisering af E-cadherin, N-cadherin og plakoglobin i ES-2 E-cad, ES-2-PG og ES-2-SHN-cad transfektanter. Stabile transfektanter blev fastsat på dækglas og behandlet til dobbelt immunofluorescens med E-cadherin (E-cad, rød) eller N-cadherin (N-cad, rød) og plakoglobin (PG, grøn) antistoffer. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Bar, 25 um.

Eksogen udtryk for E-cadherin og PG og stabil knockdown af N-cadherin i ES-2 transfektanter blev bekræftet ved hjælp af immunoblot (Fig 3B) og immunofluorescens analyser (fig 3C). I ES-2-E-cad-celler (Fig 3B og 3C, ES-2-ECAD), blev E-cadherin udtrykkes og hovedsagelig lokaliseret på membranen selv om det også blev påvist i cytoplasmaet i transfektanterne. Interessant PG ekspression i ES-2-PG-celler (Fig 3B og 3C, ES2-PG) førte til opregulering af endogen E-cadherin. I disse celler det eksogent udtrykte PG colocalized med både N-cadherin og E-cadherin (fig 3B og 3C, ES2-PG). N-cadherin knockdown reducerede niveauerne af endogene N-cadherin ( 90%). Farvning af disse kulturer med N-cadherin-antistoffer påvist lejlighedsvis celler, der var knap farves (fig 3B og 3C, ES2-SHN-cad).

Vurdering af migration og invasion af ES-2-transfektanter viste en signifikant reduktion i både migration og invasion af ES-2-ECAD og ES-2-PG celler i forhold til parentale ES-2-celler (fig 4A, 4B og 4D). E-cadherin-ekspression i ES-2-celler reducerede migration og invasion af disse celler med 39% og 42%, hhv. PG ekspression i ES-2-celler faldt migration og invasion ved 58% og 44%, hhv. Virkningen af ​​N-cadherin knockdown om migration var svarende til den i PG ekspression, dvs. en reduktion på 65%, mens invasionen af ​​ES-2-SHN-cad-celler var signifikant mindre end for ES-2-E-cad og ES -2-PG-celler (68% reduktion) (fig 4a, 4b og 4D).

IOSE-364, OV-90, ES-2 og ES-2 transfektanter (ES-2-E-cad, ES-2-PG, ES-2-SHN-cad) blev bearbejdet for migration (A) og invasion B) assays (som beskrevet i Materialer og Metoder. Antallet af migrerede /invaderede celler blev normaliseret til de af de IOSE-364 celler. (C) Gentagne kulturer af ES-2 celler og ES-2-transfektanter (E-cad, PG og SHN-cad) blev udsået på enkelt celle (3×10

4) tæthed. Kulturer blev talt på dag 1, 3, 5 og 7. Hvert tidspunkt er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. (D) Oversigt over ændringer i vækst, migration og invasion af ES-2-transfektanterne. Transfektanter værdier blev normaliseret til ES-2-celler.

s

værdier, * 0,05, ** 0,001.

Vi sammenlignede også væksten af ​​ES-2-celler med de ES-2-E-cad, ES-2-PG og ES-2-SHN-cad transfektanter (fig 4C og 4D). På dag 7, viste ES-2-E-cad celler lignende vækstrate til ES-2-celler, mens ES-2-PG og ES-2-SHN-cad celler viste signifikant lavere vækst end ES-2-celler (21% og 25 % reduktion, henholdsvis (fig 4C og 4D). Men mens ES-2-SHN-cad celler viste nedsat vækst i hele 7 dage, ES-2-PG-kulturer udviste reduceret celleantal efter dag 5, sandsynligvis på grund af induktion kontakt hæmning på kultur sammenflydning (fig 4C).

tilsammen disse resultater antydede, at ekspressionen af ​​E-cadherin eller PG eller knockdown af N-cadherin reduceres effektivt migration og invasion af ES-2 celler. Men kun PG ekspression eller N-cadherin knockdown faldt betydeligt væksten af ​​disse celler.

Interaktion af plakoglobin og p53 i normale og ovariecarcinom cellelinier

Vi har vist, at PG interageret med både WT og mp53 i forskellige carcinoma-cellelinier og de begge forbundet med promotorer af et antal p53-målgener [17, 18, 40] til. PG interaktioner med mp53 udtrykkende carcinomceller førte nedsat vækst, migration og invasion af disse celler. Til dette formål har vi undersøgt, om PG forbundet med p53 i OVCA celler. Totale celleekstrakt af IOSE, ES-2 og ES-2-PG-celler blev forarbejdet til gensidig co-immunpræcipitationseksperimenter (co-IP) og immunoblotting med PG og p53 antistoffer (tabel 1). I IOSE celler PG antistoffer copræcipiterede p53 og PG (figur 5). De gensidige co-IP under anvendelse p53 antistoffer copræcipiterede PG, yderligere validering af samspillet mellem PG og p53 i disse celler. I ES-2 celler, der udtrykker eksogene PG og endogene mp53, PG antistoffer copræcipiteret p53 og PG. I den gensidige samarbejde IP af ES-2-PG celler, p53 antistoffer bragt ned både PG og p53 (figur 5). I modsætning hertil i ES-2 celler uden PG ekspression, p53 antistoffer udfældede p53 (Fig 5). Kontrol immunopræcipiteringer med p53 og PG præimmune antistoffer ikke afsløre hverken protein i de samlede cellelysater (Fig 5B).

Lige store mængder af det samlede celleekstrakter (TCE) fra IOSE-364, ES-2 og ES-2 AB-PG celler blev forarbejdet til gensidig og sekventiel immunpræcipitation (IP) og immunblotting (IB) under anvendelse af p53 og plakoglobin antistoffer (A) eller præimmune antistoffer (B) som beskrevet i Materialer og Metoder. De samme lysater blev behandlet med aktin antistoffer for at bekræfte ens belastninger. PG, plakoglobin; Pi, præ-immune.

Diskussion

I den aktuelle undersøgelse, for første gang, vi undersøgte

in vitro

tumor /metastase suppressor effekter af PG i EOC cellelinjer med mp53 udtryk og forskellige cadherin profiler. Vi viste, at ES-2 celler, der udtrykker N-cadherin og som mangler E-cadherin og PG var stærkt vandrende og invasiv. I modsætning hertil OV-90 celler, der udtrykker både E-cadherin og PG og meget lidt N-cadherin var ikke vandrende eller invasive. Den exogene ekspression af PG eller E-cadherin eller knockdown af N-cadherin i ES-2-celler betydeligt reduceret deres migration og invasion. Vores data viser, at PG colocalized med både E-cadherin og N-cadherin i adhæsionskomplekser. I overensstemmelse med disse observationer har vi bemærket signifikant reduktion i ES-2-PG og ES-2-SHN-cad vækst i forhold til ES-2 og ES-2-E-cad-celler. Desuden PG interageret med WT p53 i IOSE celler og mp53 i ES-2-PG transfektanterne.

Cadherin skifte fra E- til N-cadherin er et afgørende skridt i epitelial til mesenkymale overgang (EMT) -medieret maligniteter [41, 42]. EMT fører til celle-celle-junction demontering, tab af cellepolaritet og forstærkning af migrerende og invasive egenskaber [30, 43, 44]. Mens E-cadherin er en epitel markør og en kendt tumor suppressor, N-cadherin er en mesenchymal markør og dets ekspression er forbundet med en mere vandrende og invasiv fænotype [44, 45]. Normale æggestokkene overflade epitel (OSE) celler udtrykker en kombination af epitelial og mesenchymale markører. Disse celler har ikke E-cadherin, men udtrykker N-cadherin, catenins, vimentin og cytokeratiner [36, 46-50]. Efter aftale med disse rapporter, IOSE celler udtrykte N-cadherin og vimentin samt catenins herunder PG, og cytokeratiner. Den nøjagtige rolle E- /N-cadherin kontakten i initiering og progression af ovariecarcinomer er ikke særlig klar, da begge cadheriner kan udtrykkes i ovarietumorer af forskellig oprindelse og på forskellige stadier [51, 52]. Men mens nogle få undersøgelser tyder, at E-cadherin opreguleres i OVCA udgydelser [52, 53], det store flertal tyder på, at tab eller reducerede niveauer af E-cadherin bidrage til overgangen fra godartede til borderline æggestokkene læsioner, at dårligt differentieret ovarietumorer, og til lokal invasion og metastase [28, 47, 54-58]. I overensstemmelse med tumor suppressor aktiviteter E-cadherin, nedregulering /mangel på E-cadherinekspression på grund af de høje niveauer af sine transkriptionelle repressorer Snail, Twist og ZEB-2 er blevet forbundet med de vandrende og invasive egenskaber af ES-2 og andre OVCA celler [59-71]. Derudover E-cadherin undertrykker vækst og metastase via inhibering receptortyrosinkinase-signalering og PI3K /Akt pathways [72, 73]. I overensstemmelse med disse undersøgelser, viste vi, at ES-2-E-cad celler havde signifikant lavere migration og invasion (39% og 42%, henholdsvis) sammenlignet med ES-2 celler.

Selvom N-cadherin er udtrykt i normal OSE, er dens udtryk generelt forbundet med øget migration og invasion af OVCA [74-76]. N-cadherin niveauer er blevet vist at være forhøjet i cellelinjer, der udtrykker Sneglen og ZEB-1, såvel som hos patienter med højere FIGO tumorklassificering og metastase [51, 64, 77]. Exogen ekspression af MUC4 i SKOV3-celler førte til nedregulering af E-cadherin, opregulering af N-cadherin og øget motilitet. N-cadherin knockdown i disse celler reduceret MUC4 induceret motilitet, samtidig med nedsat aktivitet af ERK1 /2, AKT og MMP9 [78]. Støtte disse undersøgelser, en selektiv anti-N-cadherin antistof (Exherin, ADH-1) blev for nylig vist at være effektive til stabilisering af sygdomsprogression i to OVCA patienter i et lille klinisk fase I undersøgelse, som vurderede patienter med forskellige solide tumorer [79 ]. Her viste vi, at i forhold til ES-2 celler, den migration og invasion af ES-2-SHN-cad-transfektanter blev reduceret med 65% og 68%, hhv. Endvidere vælte N-cadherin var meget mere effektiv til at reducere migration og invasion end udtrykke E-cadherin i ES-2-celler. Tilsvarende mens E-cadherin-ekspression havde meget ringe virkning (5%) i faldende vækst, PG ekspression eller N-cadherin knockdown betydeligt reduceret ES-2 celler vækst (20%, 25%, henholdsvis).

I modsætning cadheriner, meget lidt er kendt om den rolle, PG i OVCA. PG har vist sig at have vækst /metastase inhibitorisk funktion, både

in vitro

in vivo

[19]. Denne funktion af PG kan medieres ved stabilisering /udskille N-cadherin og induktion af kontaktinhibering af vækst og /eller interaktion med forskellige cellulære proteiner, herunder transkriptionsfaktorer [17-19, 27,34,40,80-82]. Her, den exogene ekspression af PG signifikant reduceret migration og invasion af ES-2-celler (58% og 44%). Virkningen af ​​PG på inhibering migration var signifikant højere end den for E-cadherin. Da PG-ekspression er nødvendig for dannelsen af ​​både adherensovergange og desmosomer [19,33], kan dette antyde, at PG reducerede migration via association med N-cadherin og dannelse af knudepunkter samt samspil med transkriptionsfaktorer og regulering af genekspression. Interaktion af PG med flere transkriptionsfaktorer, såsom TCF /LEF, CBP, SOX4 og p53 er tidligere blevet beskrevet [17, 22-26, 81]. Vi har vist, at PG interageret med mp53 i flere karcinom cellelinjer og de begge er forbundet med initiativtagere til en række p53 målgener herunder tumorsuppressorer

SFN

(14-3-3s) og

NME1

og den onkogene genom arrangør

SATB1

. Desuden er disse foreninger var samtidig med reduceret vækst, migration og invasion [17,18]. PG reguleret også ekspressionen af ​​HAI-1 og reduceret migration på en p53-afhængig måde i NSCLC-celler [27]. Her viste vi, at PG interageret med WT p53 i IOSE celler og med mp53 i ES-2-PG-celler. p53 regulerer ekspressionen af ​​EMT markører såsom Twist, Sneglen og Slug [82-86]. Vi har registreret lave niveauer af E-cadherin i ES-2-PG celler efter PG-ekspression. Hvorvidt dette E-cadherin ekspression skyldes nedregulering af E-cadherin transkriptionelle repressorer via PG-p53 interaktion eller stabilisering af E-cadherin-protein via dets interaktion med PG warrants for yderligere undersøgelser.

Sammenfattende er dette den første demonstration af den rolle, PG i OVCA celler. Vores data viser, at eksogen ekspression af PG eller knockdown af N-cadherin var mere effektive end ekspression af E-cadherin i inhibering af væksten, vandrende og invasive egenskaber af ES-2-celler. Disse resultater antyder, at PG ekspression sekvestreret tumor /metastase fremme aktiviteter af N-cadherin. Induktion af E-cadherin ekspression i ES-2 celler, der udtrykker exogent PG, som interagerede med det endogene mp53, rejser muligheden for, at PG også kan være involveret i reguleringen af ​​p53-målgener involveret i migration og invasion. Kollektivt antyder resultaterne, at PG kan virke som en tumor /metastase suppressor i OVCA, som det er blevet vist for andre kræftformer. Den større konsekvenser af vores undersøgelser er potentialet i PG som terapeutisk mål for flertallet af OVCAs med mp53 og N-cadherin udtryk.

Tak

Vi takker den canadiske æggestokkene Tissue Bank på BC Cancer Agency for at give IOSE-364 celler. Vores arbejde er støttet af den canadiske Breast Cancer Foundation Prairies /NWT kapitel (MP) og af Alberta Cancer Foundation Graduate Scholarship (MA). GD blev understøttet af en sommer studentship fra kvinder og børns sundhed Research Institute (WCHRI).