PLoS ONE: MicroRNA-199B-5p Forringer Cancer Stamceller gennem Negative Regulering af HES1 i Medulloblastoma

Abstrakt

Baggrund

Gennem negativ regulering af genekspression, microRNA (miRNA) kan fungere i kræftformer som oncosuppressors, og de kan vise ændret udtryk i forskellige tumortyper. Her har vi undersøgt medulloblastom tumorer (MBS), som stammer fra en tidlig forringelse af udviklingsprocesser i lillehjernen, hvor Notch signalering er involveret i mange celle-skæbne-bestemmende etaper. MBs forekomme bimodalt, med toppen incidens set mellem 3-4 år og 8-9 år, selv om det også kan forekomme hos voksne. Notch regulerer en delmængde af de MB celler, som har stamcelle-lignende egenskaber og kan fremme tumorvækst. På grundlag af denne dokumentation, vi hypotese, at miRNA rettet mod Notch vej kan reguleres disse fænomener, og kan anvendes i anti-behandlinger mod kræft.

Metode /vigtigste resultater

I en screening af MB cellelinier blev miRNA mIR-199B-5p ses at være en regulator af Notch-vejen gennem sin målretning af transkriptionsfaktoren HES1. Nedregulering af HES1 udtryk ved miR-199B-5p negativt regulerer spredning sats og forankringsuafhængig vækst MB celler. MIR-199B-5p overekspression blokerer ekspression af flere cancer stamceller-celle gener, svækker engraftment potentiale MB celler i lillehjernen af ​​athymiske /nøgne mus, og af særlig interesse, formindsker MB stamcelle-lignende (CD133 +) subpopulation af celler. I vores analyse af 61 patienter med MB, ekspressionen af ​​MIR-199B-5p i de ikke-metastatiske tilfælde var signifikant højere end i de metastatiske tilfælde (P = 0,001). Korrelation med overlevelse for disse patienter med høje niveauer af miR-199B udtryk viste en positiv tendens til bedre samlet overlevelse end for de lave udtrykker patienterne. Disse data viser nedregulering af miR-199B-5p i metastatiske MBs tyder på en potentiel lyddæmpning mekanisme gennem epigenetiske eller genetiske ændringer. Efter induktion af de-methylering ved anvendelse af 5-aza-deoxycytidin, lavere MIR-199B-5p-ekspression blev set i et panel af MB cellelinier, støttet en epigenetisk mekanisme for regulering. Desuden to cellelinjer (Med8a og UW228) viste signifikant opregulering af miR-199B-5p efter behandling. Infektion med MB-celler i en induceret xenograft model i mus cerebellum og anvendelse af et adenovirus der bærer MIR-199B-5p indikerer en klinisk fordel gennem denne negative indflydelse MIR-199B-5p på tumorvækst og på den delmængde af MB stem- celle-lignende celler, hvilket giver yderligere bevis på konceptet.

konklusioner /betydning

på trods af fremskridt i vores forståelse af patogenesen af ​​MB, en tredjedel af disse patienter stadig uhelbredelige og nuværende behandlinger kan betydeligt skader langsigtede overlevende. Her viser vi, at miR-199B-5p udtryk korrelerer med metastaser spredning, identificere en ny molekylær markør for en dårlig risikoklasse hos patienter med MB. Vi viser desuden, at i en xenograft model, kan MB tumorbyrde reduceres, hvilket indikerer brugen af ​​miR199b-5p som adjuvans terapi efter kirurgi, i kombination med strålebehandling og kemoterapi, til forbedring af anti-cancer MB terapier og patient kvalitet liv. Hidtil er dette er den første rapport, at ekspression af et miRNA kan nedbryder de tumor stamceller, hvilket indikerer en interessant terapeutisk fremgangsmåde til målretning af disse celler i hjernetumorer

Henvisning:. Garzia L, Andolfo I, Cusanelli E, Marino N, Petrosino G, De Martino D, et al. (2009) MicroRNA-199B-5p forringer Cancer Stamceller gennem Negative Regulering af HES1 i medulloblastom. PLoS ONE 4 (3): e4998. doi: 10,1371 /journal.pone.0004998

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: November 28, 2008; Accepteret: 23 Februar 2009; Udgivet: Marts 24, 2009

Copyright: © 2009 Garzia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af FP6-EET pipeline LSH-CT-2006 til 037.260 (MZ), FP7-Tumic HEALTH-F2-2008-201662 (MZ), Associazione contro la lotta al neuroblastom Italiana “Progetto Pensiero” (AI, MZ), AIRC tilskud 2007 (MZ), Progetto AIRC Tumori Pediatrici 2008 (MZ). Associazione Open neuroblastom (AI), en Scuola Europea di Medicina Molecolare (SEMM-CEINGE) Fellowship (EF), og AIRC-FIRC stipendier (LG, NM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er enkelt-strengede RNA af -22 nukleotider i længden, og de udgør en ny klasse af gen regulatorer [1]. Hos dyr, miRNA har regulerende virkninger gennem deres binding til ufuldkomne supplerende lokaliteter inden for de 3′-utranslaterede regioner (3’UTRs) af deres mRNA-mål. Ændret udtryk for mange miRNA ses i flere tumortyper: f.eks B-celle lymfekræft (grupperet miR-17) [2], [3], maligne lymfomer (miR-15a, miR-16-1, målretning BCL2) [4], glioblastom tumorer (miR-21up-forordning) [5] , colorektal neoplasi (mIR-143, mIR-145 nedreguleret) [6], lungecancer (mIR-29) [7], og brystcancer (mIR-10b) [8], med adskillige flere tumortyper under analyse.

Her har vi fokuseret på de mest almindelige af maligne hjernetumorer, medulloblastomer (MBS). MBs præg af at stamme fra stamceller og fra granula neuron forstadier i den eksterne granula lag af cerebellum [9], eller alternativt fra multipotente prækursorer i den ventrikulære zone af lillehjernen [10] – [12]. Fra et klinisk synspunkt, nuværende multimodale behandlinger omfatter radikal kirurgisk resektion efterfulgt af strålebehandling og kemoterapi. Selv om disse behandlinger kan forbedre overlevelsesraten, MB forbliver uhelbredelig i omkring en tredjedel af disse patienter. Den vigtigste dødsårsag er tilbagefald i forbindelse med tumor formidling, på hvilket tidspunkt nuværende behandlingsmuligheder har ringe effekt [13]. Disse behandlinger er også giftige og kan føre til langsigtede handicap [14] – [16]. Der er derfor et stort behov for hidtil ukendte, effektive, med lav toksicitet terapier for børn med medulloblastom.

MB-celler kan også indeholde funktionelt vigtige undergrupper af celler med stamceller-lignende egenskaber, som er entydigt i stand til at udbrede tumorvækst [17], [18]. Nyere undersøgelser har vist, at både progenitorer og stamceller kan reagere på Sonic-Hedgehog (Shh) pathway og kan tjene som celler oprindelsesbetegnelser for MBs [19].

Notch-aktivitet er blevet vist at regulere granula-celle stamfædre hvorfra MBs opstå, med Notch2 gen kopiantal steget i 15% af MBs [12], [20]. Vedvarende ekspression af

bHLH HES1

, den vigtigste Notch-responsive gen, forhindrer både migration af neurale progenitorceller ud af den ventrikulære zone og ekspression af neuronale markører [21]. Mus mangler

Hes1

vise tidlig neurogenese, set som opregulering af neurale bHLH transkriptionsfaktorer, hvilket resulterer i større neural-rør fejl [22]; stamceller, der stammer fra disse mus har nedsat selvfornyende potentiale, med en vilje til en neuronal afstamning [23].

Betydeligt, udtryk for HES1 i MB er blevet forbundet med dårligere klinisk resultat [24]. Notatet har et samspil med Shh i granuleret celle forløber udvikling blevet postuleret [25], som har krydstale med andre veje, f.eks den Polycomb gruppen genet

BMI-1

[26].

Vores tilgang startede med en søgning efter miRNA (miRNA register) med target gener involveret i hak vej, og vi identificeret miR199b-5p som værende rettet HES1, at Notch effektor. Vi viser, at miR-199B-5p udtryk går tabt i metastatiske patienter og postulere en mekanisme for regulering efter epigenetisk inaktivering via methylering processer, der forekommer under carcinogenese, identificere en ny molekylær markør for en dårlig risikoklasse hos patienter med MB. MiR199b-5p udtryk specifikt forringer kræft-stamcelle (CD133 +) befolkning, hvilket resulterer

in vivo

i nedskrivninger på MB tumor udvikling i lillehjernen xenograft musemodel, hvilket giver proof of concept. Som microRNA har vist for nylig at være nyttige værktøjer til at lukke munden på kræft, kan de være i stand til at udfylde dette hul gennem deres kontrol af flere målgener. Vi leverer her for anvendelsen af ​​miRNA i klinikken, med vores anti-tumor terapi målretning af cancer stamceller ved miR-199B-5p.

Resultater

Hsa-miR-199b- 5P tavshed HES1 udtryk via 3’UTR bindende

Vores

i-silico

analyse af miRBase henvender databasen [27] blev rettet mod identifikation af miRNA potentielt rettet mod HES1, en effektor af Notch vej , en grundlæggende mekanisme i reguleringen af ​​MB celleproliferation. MIR-199B-5p og miR-199a-5p var de bedre scoring miRNA, og blev forudsagt at binde 3’UTR menneskelige bHLH HES1. Vi fokuserede på MIR-199B-5p på grund af sin evne til at nedsætte HES1 ekspression under transient overekspression sammenlignet med MIR-199a-5p (Text S1, fig. S1A, B). MIR-199B-5p er tabt i lungetumorer [28], og det er blevet kortlagt til en genomisk region deleteret i blærekræft [29]. MIR-199a * (også kendt som MIR-199a-5p, og med en identisk sekvens til MIR-199B-5p) reduceres også i hepatocellulært carcinom [30] – [32]. Analysen af ​​MIR-199B-5p-ekspression i to MB cellelinier, humant voksent væv og muse lillehjernen, er vist i tekst S1, fig. S1c, D og S2A, B.

For at bestemme om HES1 er et mål for miR-199B-5p, den HES1 3’UTR blev klonet nedstrøms for en luciferasereportergen vektor; præ-MIR-199B-5p blev også klonet i en pattedyrekspressionsvektor (se tekst S1). HEK-293-celler blev derefter transficeret med den relative luciferaseaktivitet viser, at MIR-199B-5p co-transfektion faldt reportergenaktivitet, hvilket således indikerer binding med 3’UTR og destabilisering af produktive translation af luciferase-mRNA (Text S1, fig. S1E ). Som kontroller, HES1 3’UTR muteret i MIR-199B-5p-bindingssted blev ikke påvirket af MIR-199B-5p (Text S1, fig. S1E), og når en 2-O’-methyl oligoribonucleotid (2-OM) komplementær til modne mIR-199B-5p blev cotransficeret, det modvirkes virkningerne af mIR-199B-5p transfektion, genoprette reporteraktivitet (Text S1, fig. S1E). Lignende resultater blev opnået i Daoy MB celler (Text S1, fig. S1F).

For at fastlægge den rolle MIR-199B-5p i MB cellebiologi, blev MIR-199B-5p ekspressionskonstruktion transficeret ind Daoy celler, og flere stabile kloner over-udtrykkende mIR-199B-5p blev udvalgt. Over-ekspression blev bekræftet ved real-time PCR (Text S1, fig. S1G). Tre kloner demonstreret reduceret HES1 proteinniveauer, hvoraf den ene (199bSC1) viste ingen detekterbar HES1. De 199bSC1 og 199bMC1 kloner blev udvalgt til yderligere undersøgelse (Text S1, fig. S1H). Disse virkninger af MIR-199B-5p på HES1 proteinekspression blev ikke begrænset til de stabile kloner eller Daoy celler, som D283MED celler transient transficeret med ekspressionskonstruktionen for MIR-199B-5p viste også reducerede HES1 niveauer (Text S1, Fig. S1B ).

for at styrke disse resultater blev 199bSC1 klon transficeret med 2-OM antisense til miR-199B-5p og anvendt som en negativ kontrol (Tekst S1, fig. S1I). Her blev HES1 niveauer genoprettes, hvilket tyder på 2-OM blok af HES1 undertrykkelse af miR-199B-5p, hvilket giver yderligere bekræftelse på, at miR-199B-5P mål HES1 direkte. Andre potentielle mål for miR-199B-5p blev også undersøgt på denne måde (Tekst S1, fig. S2C, D).

Over-ekspressionen af ​​miR-199B-5p reducerer celledeling og svækker klonogene potentiale MB cellelinier

199bSC1 og 199bMC1 kloner havde reduceret proliferationshastigheder under standard dyrkningsbetingelser, når sammenlignet med kontrollen klonen. Således vi kiggede for potentielle celle-cyklus ændringer i disse kloner. FACS-analyse på 199bSC1 klon viste et fald på 31% i S-fase-fraktioner, og en stigning i celler i G0-G1 på 15%, sammenlignet med den tomme vektor klonen (fig. 1A). Dette antydede, at afgangen fra cellecyklussen har en rolle i den reducerede proliferationshastighed af Daoy celle 199bSC1 klon. I modsætning hertil har den 199bMC1 klon ikke vise væsentlige ændringer i sin celle cyklus. Vi tror, ​​at disse resultater at skyldes en samlet lavere effektivitet af 199bMC1 til reduktion HES1 proteinniveauer. Disse celle-cyklus fænotyper oversat til nedsat proliferation satser

in vitro

, som vurderet af

in vitro

proliferationsassays sammenligner 199bSC1 og 199bMC1 kloner med en tom-vektor-klon og en forbigående transfektant for 2-OM designet mod mIR-199B-5p (fig. 1B). Både 199bMC1 og 1999SC1 kloner udviste markant reduceret opformeringsrater. Transfektion af denne antisense 2-OM inducerede en markant stigning i udbredelsen af ​​den stabile 199bSC1 klon efter aftale med restaurerede ekspressionsniveauer af HES1. Disse resultater på Daoy celleproliferation blev også bekræftet med D283 og ONS76 celler (Text S1, fig. S2F). Virkningerne af miR-199B-specifikke 2-OM blev også bekræftet i vildtype Daoy celler, hvor det potentielt virker på den endogene miR-199B (Tekst S1, fig. S2G).

A) Repræsentant FACS analyse med propidium iod viser et fald i de procentdele af celler i S-fasen og en stigning i G0-G1 til den stabile 199bSC1 klonen. Fraværet af skulder signaler med G0-G1 rød højdepunkt i 199bSC1 og 199bMC1 kloner udelukker apoptotiske processer. B) Proliferationsassays efter 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-5-3-carboxymethoxyphenyl-2-4-sulfophenyl-2H-tetrazolium-salt (MTS), der viser nedsat proliferation satser af den stabile 199bSC1 klonen (røde trekanter) og 199bMC1 klon (grønne krydser), sammenlignet med den stabile klon med tom vektor alene (blå diamant). Denne effekt af miR-199B-5p overekspression blev reduceret med 2-OM transfektion (lyserøde firkanter). De viste data er middelværdier ± SD fra to uafhængige forsøg, der hver udført in triplo. C) Rapresentative mRNA ekspressionen af ​​differentiering (f.eks MASH1, MATH3 og NEUROGENIN 2) og spredning (f.eks c-myc, cyklin D1) markører upon miR-199B-5p overekspression, som afsløret af real-time PCR, sammenligner den stabile 199bSC1 og 199bMC1 kloner med tom vektor-klon. D) Den stabile 199bSC1 klon for miR-199B-5p viser forringet kolonidannelse i blød agar assays. Plottet viser kolonier talt som middelværdier ± SD fra tre uafhængige eksperimenter, hver udført in triplo. E) repræsentant Western blot under anvendelse af anti-c-myc og anti-cyclin D1-antistoffer viser disse to proteiner for at være nedreguleret i stalden 199bSC1 klon; se også densitometrisk analyse i højre panel. F) Som for E, viser GABRA6 og MATH3 proteiner opreguleret efter miR-199B udtryk, hvilket tyder på induktion af differentiering. Anti-laminin-p antistoffer blev anvendt til normaliseret nuklear c-Myc og cyclin D1 proteinekspression. Anti-β-actin-antistoffer blev anvendt til normaliseret cytoplasmatisk GABRA6 og MATH3 proteiner udtryk.

Virkningerne af induktion af miR-199B-5p blev vurderet på molekylære markører for proliferation og differentiering af en real tid tilgang. Som illustreret i fig. 1C, MAP2, som for det meste udtrykt i modne neuroner [33], var opreguleret i de stabile 199bSC1 og 199bMC1 kloner. Tilsvarende har Daoy celler blevet beskrevet at udtrykke GFAP efter differentiering med phenylbutyrat [34], og i den stabile 199bSC1 klonen blev GFAP-niveauer øges. Samlet set billedet af genekspression i vores stabile cellelinje over-udtrykkende miR-199B-5p er indforstået med fænotype, der er blevet set i hjernen af ​​

Hes1 – /-

mus [23]. Blandt de andre gener, GABRA6, en markør for cerebellar granula celledifferentiering, var også signifikant overudtrykt i de stabile kloner (fig. 1C).

En finjusteret kaskade af positive og negative bHLH transkriptionsfaktorer er centralt for neurogenese, med gener såsom

MASH1

,

MATH3

NGN2

overtalelse neurogenese, og HES1-mutant mus viser opregulering af disse aktivator-type bHLHs [ ,,,0],35]. Begge MIR-199B-5p stabile kloner viste stigninger i ekspressionen af ​​pro-neurale bHLH. Efter aftale med deres reduktion i spredning sats blev proliferationsmarkører c-myc og cyclin D1 faldet. Af de to analyserede kloner, viste 199bSC1 mere konsekvent fænotype; vi forklare disse resultater ved mere effektiv HES1 lyddæmpning i denne klon.

Siden miR-199B-5p stabil 199bSC1 klon viste en stærkere og mere sammenhængende fænotype, vi næste undersøgt det i en standard klonogen assay, for at bestemme hvorvidt forankringsuafhængig vækst blev påvirket af miR-199B-5p. Her var en 80% reduktion i potentiel kolonidannelse, sammenlignet med den tomme-vektor-klon (fig. 1D). I overensstemmelse med denne reduktion i spredning sats, blev proliferationsmarkører c-myc og cyklin D1 faldt (fig. 1E). Vi bekræftede også på proteinniveauet at GABRA6 og MATH3 var opreguleret i 199bSC1 klonen (figur 1F.); sidstnævnte er kendt for at blive undertrykt direkte af HES1 [35].

MIR-199B-5p udtømmer den side befolkning rum i Daoy cellelinje, og negativt regulerer MB tumor stem-cellepopulationer

den Notch pathway er blevet forbundet med den del af MB tumorceller, som skjuler prækursor stamme-cellemarkører [36], og HES1 har en rolle i selvfornyende af multipotente progenitorceller [23]. Denne side befolkning (SP) af tumorceller har en rolle i engraftment af en tumor i dyremodeller [37]. Vi undersøgte derfor indflydelse miR-199B-5p på befolkningen af ​​tumorceller, der udelukker Hoechst 33342 farvestof, en strategi til at identificere disse SP celler. Dette blev bestemt ved flowcytometri i Daoy cellelinien, SP hvoraf udgør indtil 4,9% af cellerne, sammenlignet med verapamil-behandlede celler (den negative kontrol) (Tekst S1, fig. S3A, B). Denne verapamil behandling var baseret på verapamil inhibering af ionen-pumper ansvarlig for Hoechst 33342 farvestof udstødelse, således at de SP-celler ses [38]. Farvning af 199bSC1 og 199bMC1 celler indikerede, at SP blev ablateret, da der var tæt på ingen forskelle mellem Hoechst-behandlede prøve og Hoechst plus verapamil prøver (Tekst S1, fig. S3C-F).

Det er også kendt, at centralnervesystemet tumor stamceller udtrykker CD133-antigen, og at disse celler er entydigt i stand til tumordannelse i NOD-SCID-mus [18], [39]. Derudover Notch pathway har en central rolle i selvfornyende proces, med dets inhibering fører til udtømning af CD133-positive (CD133 +) Daoy celler via induktion af apoptose af progenitor-lignende celler [36]. For nylig blev det vist, at CD133 + Daoy celler fremmer tumorvækst i flanken af ​​nøgne mus, mens CD133- celler ikke [40]. Af disse grunde har vi vurderet CD133 positivitet af Daoy celler sammenlignet med de stabile 199bSC1 og 199bMC1 kloner (fig. 2). Her, vildtype celler var 14,8% CD133 +, mens i de stabile 199bSC1 og 199bMC1 kloner dette blev reduceret til 2,4% og 6,5% CD133 +, (fig. 2C-F). Dette viste således en rolle for MIR-199B-5p i negativ regulering af denne del af tumor-initierende celler.

A-F) repræsentant FACS-analyser af den stabile 199bSC1 (D) og 199bMC1 (F) kloner viste et fald i procentdelen af ​​celler, der var positive for stamcellemarkør CD133 (B); A, C og E er negative kontroller (ingen antistof).

HES1 overekspression redder miR-199B-5p klon fænotype

For at bekræfte, at den cellulære fænotype er direkte korreleret med nedregulering af HES1, vi udførte

in vitro

celle-redning eksperimenter. Vi valgte at redde mere ensartet fænotype, vist ved den stabile 199bSC1 klonen. Når fuld længde HES1 cDNA blev klonet og transficeret ind i stalden Daoy-celle 199bSC1 klon blev HES1 ekspression genoprettet, som vurderet ved immunoblotting (fig. 3A). Vi bemærkede også re-ekspressionen af ​​cyklin D1, der blev nedreguleret i stalden 199bSC1 klon. Restaureret HES1 udtryk også vendt virkningerne af miR-199B-5p på celleproliferation (fig. 3B). Samtidig, transfektion af HES1 cDNA i 199bSC1 klonen faldt induktion af pro-neurale bHLHs og differentieringsmarkører, og forhøjede niveauer af spredning gener (fig. 3C). Endvidere forbigående transfektion af HES1 cDNA i den stabile 199bSC1 klonen ført til en stigning i procentdelen af ​​celler i S-fase, og en fjernelse af blokken på G0-G1-fasen (fig. 3D). Dette var modsat de virkninger, der ses i den stabile 199bSC1 klonen overudtrykker MIR-199B-5p (se fig. 1C og fig. 3C). Virkningerne af genoprettede ekspression af HES1 om SP af det stabile 199bSC1 klonen blev også vurderet. Når HES1 transficerede celler (GFP-positive) blev evalueret for deres evne til at udelukke Hoechst farvestof, viste de en minimal stigning i SP, på op til 1,3%. Selvom højere end målt for de stabile 199B kloner (fig. 3E-H), dette var stadig under niveauet af SP-celler til vildtype celler (Text S1, fig. S3). Dette skyldes sandsynligvis den korte tid af re-ekspression af HES1 efter transient transfektion, som måske ikke er nok til at muliggøre fuldstændig fænotype redning. Vi forsøgte derefter at redde virkningerne på CD133 rum; imidlertid havde forbigående transfektion af HES1 i 199bSC1 klonen ikke resultere i en signifikant stigning i CD133 + celler. Vi mener, at dette skyldes den korte transient transfektion tid, som ikke tillader en re-organisering af Daoy celle hierarki.

A) Repræsentant Western blot og densitometrisk analyse, der viser, at redningen af ​​HES1 udtryk ved over- udtryk for HES1 cDNA i stalden 199bSC1 klon genskaber cyklin D1 udtryk. B) Proliferation assay af 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-5-3-carboxymethoxyphenyl-2-4-sulfophenyl-2H-tetrazolium-salt (MTS) viser forøget proliferationshastighed af det stabile 199bSC1 klon med HES1 ekspression (mørk blå firkanter) sammenlignet med den stabile 199bSC1 klonen alene (lyseblå diamanter). De viste data er middelværdier ± SD fra to uafhængige forsøg, der hver udført in triplo. C) Rapresentative mRNA ekspression af differentiering (f.eks MASH1, MATH3 og NEUROGENIN 2) og proliferation (f.eks c-myc, cyclin D1) markører upon celle-redning med HES1 i stalden 199bSC1 klon, sammenligning med vildtypeceller, som afsløret ved real-time PCR. Udtrykket af Gabra 6 og MAP2 er nedreguleret i redningsaktionen eksperimentet. D) repræsentative FACS-analyse af HES1-udtrykkende stabil 199bSC1 klon viser en stigning i fraktionen af ​​celler i S-fase, og et fald i G1, i forhold til den stabile 199bSC1 klonen alene. E-H) Effekten af ​​miR-199B-5p udtryk på SP af Daoy celler vendes ved HES1 re-udtryk. 199bSC1 stabil klon blev transficeret med HES1 cDNA og et GFP-kodende plasmid, derefter behandlet efter 48 timer med Hoechst og verapamil (E-F) eller Hoechst alene (G-H) og analyseret ved FACS. GFP-positive celler (P5 gate), panel E og G, blev analyseret for tilstedeværelse af farvestof-eksklusive-celler (F-H, P6 gate). De ikke-transficerede GFP negative celler (P3 gate), blev ikke analised.

Tumor vækst er reduceret i xenotransplantater afledt af stabile 199SC1 klon

Resultaterne her viste, at miR-199b- 5p er en potentiel hæmmer af tumordannelse. Derfor, for at undersøge den rolle, MIR-199B-5p i et

in vivo

tumormodel, vi stabiliserede 199bSC1 og styre Daoy kloner med en ekspressionsvektor, som bærer luciferase cDNA. De opnåede kloner blev testet for luciferase ekspressionsniveauer og også valideret til fastholdelse af den parentale fænotype, både HES1 og MIR-199B-5p-ekspression (se tekst S1, fig. S4A-D). Disse stabile 199B-Luc1 og CTL-Luc-4 Daoy kloner blev derefter injiceret ind i venstre og højre flanker henholdsvis fem athymiske nøgne /nøgne mus. Tumorvækst blev bedømt ved ugentlig

in vivo

bioluminescens imaging (BLI) af injicerede mus. På otte uger, alle de mus viste synlige masser i hvert kontrolrum flanke, mens kun tre flanker injiceret med 199B-Luc1 viste tumor engraftment. Samlet blev en signifikant forskel i tumorvolumener mellem kontrol- flanker og MIR-199B-5P flanker set (fig. 4A). De bioluminescens målinger viste betydelige reduktioner i udledningen for miR-199B-5P sider under tumorvækst, sammenlignet med de kontrol- sider (fx mus # 4, fig. 4B). Efter ni uger, fire ud af de fem mus udviste statistisk signifikante forskelle i disse bioluminescens signaler mellem kontrol- sider og MIR-199B-5p counter sider (fig. 4C). Tilsammen viser disse data, at miR-199B-5p kan forringe tumordannelse

in vivo

i athymiske nøgne /nøgne mus. De xenotransplantattumorer fra mus # 5 og mus # 4 blev eksplanteret og analyseret for miR-199B-5p og HES1 udtryk og evalueret histopatologisk (Tekst S1, fig. S4E-H).

A) xenograft eksperiment løbet ni uger efter sc injektion af fem mus med kontrol Daoy celler (CTR side) og Daoy celler over-udtrykkende miR-199B-5p (199B side). Med CTR celler, tumorer var påviselige makroskopisk i 5/5 mus; med over-udtrykkende celler, i 3/5 mus. Samlet forskel tumor volumen mellem CTR og 199B injicerede sider efter ni ugers vækst var statistisk signifikant, som angivet (middel ± SD). B) Photon emission af muse # 4 efter ni ugers tumorvækst. Den 199B side (199bLuc-1) havde en konstant lavere fotonemission end kontrollen side (CTL-Luc-4). Sammenligninger af tumordimensionerne er også vist. C) Når foton emission (se B) blev omdannet til celleantal; en af ​​fem mus viste ingen signifikante forskelle (betyder ± SD) (tosidet uparret

t

test). D) Photon emission af 3 mus injiceret i fjerde ventrikel med henholdsvis: 199bLuc-1, CTL-Luc-4 inficeret med mock AdV5, og CTL-Luc-4 inficeret med en miR-199B-5p AdV5. E) Hele hjerne af animalsk og injektionsstedet (hvid pil). Hematoxylin /eosin-farvning af cerebellum; sort pil, websted om indledning af tumorigenese. F) BLI af injicerede mus som for D, efter en måneds tumorvækst. Forskellene mellem grupperne er statistisk signifikante. G) BLI af to udvalgte mus viser udviklingen af ​​tumor byrde med CTL-luc4-AdV5-Mock # 7, og reduktion med CTL-luc4-AdV5-199b # 3 over tid (0-8 uger). H) Hematoxylin-eosin farvning af lillehjernen fra AdV5-Mock # 2 og AdV5-199b # 3 dyr på 10 uger efter ortotopisk injektion, viser tumorer celler omgiver ekstern kornet lag og inden for IV ventrikel (hvid stjerne). I blå, DAPY farvning sammen med GFP detektion. Forstørrelse som angivet.

For yderligere at undersøge muligheden for miR-199B-5p at regulere MB vækst, vi injiceret 199bSC1 stabil klon ortotopisk ind i den fjerde ventrikel i nøgne mus af 5 uger gamle (fig . 4D, E). Efter fire ugers

in vivo

ikke-invasiv overvågning tumorvækst ved BLI, i mus injiceret med 199bSC1 klone tumorvækst var betydeligt lavere end hos kontrolgruppen (CTL) -celler-injicerede side. Som en yderligere bekræftelse af disse effekter, vi også injiceres CTL celler inficeret med en adenovirus koder for miR-199B-5p: efter aftale med de tidligere resultater, viste disse mus også reduceret BLI efter 4 uger (figur 4F.). Yderligere BLI erhvervelser efter 8 uger fra implantationen af ​​cellerne er vist i figur 4G. På dette tidspunkt blev to mus aflivet, og yderligere analyseret for histopatologi. Hematoxylin-eosin farvning af frosne væv viste tumor masse i lillehjernen af ​​AdV5-Mock # 2 og AdV5-199b # 3 injicerede dyr. Serielle parallelle frosne histologiske snit blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi for endogen grønt fluorescensprotein (GFP) udtrykt af adenovirus-inficerede celler. Derefter evalueres vi HES1 proteinekspression ved immunhistokemi farvning af andre paraffinindlejrede væv, anvendelse af et anti-HES1 antistof. Samlet vurderede vi niveauerne af persistens af adenovirus-ekspression i inficerede celler, som nedregulering af HES1 ekspression grund miR199b bærer adenovirus ekspression og fulgte således tumorvækst over tid ved BLI se Figur 4G-H, og antistoffer farvning Figur S4L -M (Hes1, Ki67, Gabra6, Nestin, matematik-3, se detaljer i tekst S1 information). Derefter yderligere to nøgne mus (AdV5-Mock # 7; AdV5-199b # 5) gennemgik PET-CT-studier ved 12 uger efter injektion, for at vurdere tumor proliferativ aktivitet (. Figur 5A, B). Yderligere BLI data sammen med to film (Movie S1 og Movie S2), der viser 3D-rekonstruktion af ortotopisk transplantation er beskrevet i tekst S1 oplysninger og viste i figur S6. Disse analyser viste signifikant reduktion af tumor masse i AdV5-199b # 5 dyr, sammenlignet med AdV5-Mock # 7 kontrol mus, med PET-CT-analyser også give tumor volumen (0,024 cm

3 versus 0,044 cm

3, henholdsvis), som beskrevet i Text S1. Samlet indikerer disse data en gavnlig effekt af overekspression af miR199b-5p, som en negativ regulator af tumorvækst på MB-celler i denne ortotopisk xenotransplantat nøgen-musemodel. Salg

PET-CT fusion billeder af AdV5- mock # 7 (A) og AdV5-199b # 5 (B) mus efter 12 uger fra kirurgi og injektion, med 3D volumen rendering og samtidig visning af områder af FLT optagelse (blå-grøn, hvide pile). En bredere knogle defekt i occipito-parietale del af kraniet fremgår i AdV5-Mock # 7 mus. Herunder:. Tabel af målinger (cm

3) af tumor masse iværksat med PET-CT erhvervelse (som beskrevet i tekst S1)

Angivelse af miR-199B-5p i humane medulloblastom tumorer

for at bestemme om miR-199B-5p effektivt udtrykt i sund menneskelig pædiatrisk cerebella, vi brugte 13 kontrolprøver opnået fra NICHD hjerne og Tissue Bank for Developmental Disorders, ved University of Maryland, USA. Vi målte miR-199B-5p udtryk, sammenligner fem cerebellum prøver fra 0-1-årige børn med seks 13-16-årige børn (Fig. 6A). MIR-199B-5p viste større udtryk i eksplantaterne fra de yngre raske kontrolpersoner (Mann-Whitney test,

P

= 0,006).

A) Box-plot af ekspressionsniveauer af miR- 199B-5p i sund menneskelig cerebella i de to aldersgrupper angivet. MIR-199B-5p viste højere udtryk i eksplantater fra yngre kontroller (Mann-Whitney test,

P

= 0,006). B) MIR-199B-5p stærkt udtrykker sager er for det meste M0

P

= 0,001 (Pearson Chi-Square test). C) Kaplan-Meier-overlevelse estimater sammenligner patienter med lave

versus

høj (i forhold til median) niveauer af miR-199B-5p udtryk (45 patienter med tilgængelige opfølgende data). D) MIR-199B-5p ekspression ved real-time PCR i et panel af fem MB cellelinier ubehandlede eller behandlet med 5-aza-C (DAC – /+); Som vist i fig.