PLoS ONE: prognostiske værdi af Polycomb Proteiner EZH2, BMI1 og SUZ12 og histon Ændring H3K27me3 i kolorektal Cancer

Abstrakt

Mange ændringer i epigenetiske mekanismer er blevet beskrevet i forskellige typer af tumorer. I søgen efter nye biomarkører, undersøgte vi udtryk for Polycomb-gruppe (PcG) proteiner EZH2, BMI1 og SUZ12 og tilhørende histon modifikation H3K27me3 i kolorektal cancer. Nuklear udtryk for PCG proteiner og histon modifikation H3K27me3 var immunhistokemisk (IHC) farvet på et væv microarray (TMA), herunder 247 tumorvæv og 47 normale væv, og scoret med den semi-automatiske ARIOL system. Tumorvæv viste højere ekspression af EZH2 (p = 0,05) og H3K27me3 (p 0,001) sammenlignet med deres normale modstykker. Kombineret markør trend analyser indikerer, at en stigning i antallet af markører, der viser høj ekspression var forbundet med bedre prognose. Høj ekspression af alle fire markører i den kombinerede markør analyser blev korreleret med den bedste patientoverlevelse og den længste gentagelse overlevelse, med samlet overlevelse (p = 0,01, HR 0,42 (0,21-0,84)), sygdomsfri overlevelse (p = 0,007, HR 0,23 (0,08-0,67) og lokalt recidiv overlevelse (p = 0,02, HR 0,30 (0,11-0,84)). som konklusion fandt vi, at ekspression af PCG proteiner og H3K27me3 viste prognostisk værdi i vores undersøgelse kohorte. Bedre lagdeling af patienterne blev opnået ved at kombinere udtrykket data for de undersøgte biomarkører i forhold til de enkelte markører, hvilket understreger vigtigheden af ​​at undersøge flere markører samtidig

Henvisning:. Benard A, Goossens-Beumer IJ, van Hoesel AQ, .. Horati H, Putter H, Zeestraten ECM, et al (2014) prognostiske værdi af Polycomb Proteiner EZH2, BMI1 og SUZ12 og histon Ændring H3K27me3 i kolorektal cancer PLoS ONE 9 (9):. e108265 doi: 10,1371 /journal.pone. 0108265

Redaktør: Richard L. Eckert, University of Maryland School of Medicine, USA

modtaget dateret 25. april 2014 Accepteret: August 20, 2014; Udgivet: 22 September, 2014

Copyright: © 2014 Benard et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Nye prognostiske biomarkører er berettiget i kolorektal cancer, der kunne forbedre beslutninger for behandling af individuelle patienter i tillæg til den nuværende TNM (American fælles udvalg om kræft, AJCC [1]) iscenesættelse systemet , da selv patienter med samme TNM klassifikationen stede med store forskelle i patientens overlevelse og tumortilbagevenden [2], [3]. Epigenetiske mekanismer er blevet identificeret som faktorer ofte dereguleret i tumorer og er attraktive mål for biomarkør forskning, på grund af deres roller i regulering af genekspression og deres potentielt reversible natur. Talrige ændringer i DNA-methylering, histon modifikationer og deres modificerende enzymer er blevet beskrevet i forskellige tumortyper, herunder colorectal cancer [4] – [6]. I denne undersøgelse har vi fokuseret på ekspressionen af ​​histon-modificerende enzymer af Polycomb-gruppen (PcG) og deres tilhørende histon modifikation, trimethylation af lysin 27 på histon H3 (H3K27me3) i kolorektale kræft væv.

PCG proteiner virker i store multi-protein-komplekser, de såkaldte Polycomb repressive komplekser (PRC) 1 og 2 [7]. PCG proteiner spiller en vigtig rolle i fosterudviklingen og celledeling [8], [9], og er også involveret i at fremkalde epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [10]. Afvigende ekspression af flere PCG proteiner og korrelationer med patient resultat er blevet rapporteret i forskellige kræftformer. For eksempel, ekspression af BMI1 Polycomb ringfinger onkogen (BMI1), en komponent i PRC1 og en vigtig faktor i stamceller [11], [12], viste sig at være korreleret til patient resultat i flere typer af kræft [13] – [16]. Forstærker af Zeste homolog 2 (EZH2), et centralt protein i PRC2 komplekset, viste sig også at have prognostisk værdi i flere typer cancer [17] – [20]. SUZ12 Polycomb undertrykkende kompleks 2 underenhed (SUZ12), en anden vigtig del af PRC2 kompleks, viste sig at have tumorfremmende funktioner i flere kræftformer, herunder tyktarmskræft [21] – [23]. Den tilhørende histon modifikation H3K27me3 viste sig at være højere udtrykt i tumorvæv, og at være forbundet med bedre prognose i ikke-småcellet lungecancer [24] og brystkræft [19].

Brug immunhistokemisk farvning (IHC ) og semi-automatiske scoring, studerede vi udtryk for PCG proteiner EZH2, BMI1 og SUZ12 og tilhørende histon modifikation H3K27me3 i en kohorte af 247 TNM stadie i-III kolorektal cancer patienter, i sammenhæng med kliniske resultat. Som PCG proteiner virker sammen på den samme histon modifikation, vi hypotese kombinationen af ​​alle fire markører ville være mere informativ med hensyn til kliniske resultater sammenlignet med hver af de individuelle markører.

Materialer og metoder

Patient valg

tumorvæv blev indsamlet fra en fortløbende serie af 408 kolorektal cancer patienter, som gennemgik kirurgisk resektion af deres primære tumor ved Leiden University Medical center (LUMC) mellem 1991 og 2001. patienter, der gennemgik præoperativ behandling, der havde bilaterale tumorer, eller en historie af kræft end basalcellekræft eller

situ

tumorer i, blev udelukket fra undersøgelsen analyser. Desuden har vi medtaget kun patienter med en histologisk påvist TNM stadie I-III kolorektal karcinom, som bestemt af en erfaren patolog. Dette resulterede i en undersøgelse kohorte af 259 patienter, med en gennemsnitlig opfølgning på 8,6 år. Klinisk-patologisk data var tilgængelige for alle patienter i undersøgelsen kohorte. Data, havde ret-censureret, når patienterne var i live eller uden tilbagefald på deres sidste opfølgning date. Patient karakteristika er vist i tabel 1. Patientjournaler oplysninger blev anonymiseret og de-identificeret før analyse i henhold til nationale etiske retningslinjer ( “Code for korrekt sekundær anvendelse af humant væv”, hollandsk Federation of Medical videnskabelige selskaber), og godkendt af Medical Etisk Komité Leiden University Medical center (LUMC). Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med bemærkningen retningslinjer (NCI-EORTC) [25].

Tissue microarray konstruktion og immunhistokemi

formalinfikseret paraffinindlejrede (FFPE) tumorvæv fra hver af patienterne i den fortløbende serie af patienter med tyktarmskræft (n = 408) blev opsamlet fra LUMC patologi arkiver og anvendes til at konstruere et væv microarray (TMA), som tidligere [26] beskrevne. Sektioner af 4 um blev skåret fra hver TMA blok og anvendes til IHC-farvning. Histologisk normale kolorektale væv, som bestemt af en erfaren patolog, fra 47 patienter med tilsvarende tumorvæv inkluderet i denne undersøgelse blev også indsamlet og forberedt til IHC. Følgende antistoffer blev anvendt til IHC: anti-EZH2 (612.667, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), anti-BMI1 (ab14389, Abcam, Cambridge, UK), anti-SUZ12 (ab12073, Abcam) og anti-H3K27me3 (ab6002, Abcam). Alle antistoffer er valideret til brug i immunhistokemi ved Western blot [27] – [30]. Alle primære antistoffer blev anvendt ved forudbestemte optimale fortyndinger og IHC blev udført under anvendelse af en standard IHC-protokol [31]. Kort fortalt blev endogen peroxidase blokeret ved inkubering af sektionerne i en 0,3% opløsning af hydrogenperoxid (i PBS) i 20 min. Antigen genfinding blev udført ved opvarmning af sektionerne i 10 minutter ved 95 ° C i en citratbuffer (pH 6; pH Low Target Retrieval Solution, Dako, Glostrup, Danmark) for EZH2, BMI-1 og H3K27me3 og ved opvarmning af sektionerne i 10 min ved 95 ° C i en Tris-EDTA-buffer (pH 9, pH høj Target Retrieval Solution, Dako) for SUZ12. TMA snit blev inkuberet med de respektive primære antistoffer natten over (16 timer). Farvning blev visualiseret ved hjælp af Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase /DAB +, Kanin /Mus (Dako). De farvede TMA sektioner blev scannet ved hjælp af en 20x forstørrelse på semi-automatiske ARIOL systemet (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Tumorcellelinier områder (tumorvæv) og colon epitel (i normale væv) blev markeret på computerskærmen ved visuel inspektion, efterfulgt af omhyggelig træning af ARIOL system til at identificere korrekt positivt farvede og negative kerner inden for det markerede vævsområder, for hver af markørerne separat. Nuklear udtryk, defineret som procentdelen af ​​positivt farvede kerner i det markerede område af hvert væv kerne, blev derefter vurderet af ARIOL software. Adskillige tilfældige kerner blev evalueret for hver TMA sektion ved visuel inspektion efter automatisk analyse for at verificere korrekt identifikation af positivt farvede kerner.

statistiske analyser

Data blev analyseret i samråd med en statistiker (HP ) under anvendelse af SPSS 20,0 til Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). 12 patienter blev ekskluderet fra de statistiske analyser, da ikke alle data for alle fire markører var til rådighed for disse patienter, hvilket resulterer i en endelig patient kohorte bestod af 247 patienter. Da de individuelle markør data ikke var normalt fordelt (Shapiro Wilk-test), ikke-parametrisk Wilcoxon signed-rank test blev udført for at vurdere forskellene i nukleare udtryk mellem tumor og parrede normale væv (n = 47) for hver af markørerne. Spearman er signed rank korrelation analyser blev udført for at undersøge sammenhængen mellem nukleare udtryk for de enkelte PCG proteiner, og histon modifikation H3K27me3. Cox proportional hazard trend analyser blev udført for univariate og multivariate overlevelse analyser af de enkelte markører. Kovariater inkluderet i alle multivariate analyser var alder ved operation, køn, TNM tumor stadie (tumor stadier I-III), tumor placering, tumorstørrelse, mikrosatellit stabilitet (MSS) status. Kovariater “tumor i opfølgningen” og “adjuverende terapi” blev opført som tidsafhængige kovariater. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som tiden fra kirurgi indtil døden (af enhver årsag). Sygdomsfri overlevelse (DFS) blev defineret som tiden fra kirurgi, indtil forekomsten af ​​en anden primær kolorektal tumor, locoregional recidiv eller fjernmetastaser, eller død af tyktarmskræft. Lokoregional gentagelse overlevelse (LRRFS) blev defineret som tiden fra kirurgi, indtil forekomsten af ​​en locoregional tilbagefald eller død ved cancer. Fjernmetastaser overlevelse (DRFS) blev defineret som tiden fra kirurgi indtil forekomsten af ​​en fjern recidiv eller død ved cancer.

På grundlag af den skæv fordeling af udtryk data for hver af de individuelle markører, medianen udtryk blev anvendt til at opdele patienterne i høj ekspression (ovenfor median) og lav ekspression (under-median) grupper. De fire markører blev derefter kombineret i en ny variabel, baseret på antallet af markører, der viser høj nuklear ekspression, resulterer i den følgende gruppering: alle lav (gruppe 1), 1 høj (gruppe 2), 2 høj (gruppe 3), 3 høj (gruppe 4) og alle høj (gruppe 5). Univariate og multivariate Cox proportional hazard analyser blev udført ved hjælp af gruppens numre som en kategorisk variabel, ved hjælp af gruppe 1 (alle lav) som referencegruppe. Baseret på disse resultater besluttede vi at kombinere patientgrupper 2, 3 og 4 i en patientgruppe; alle yderligere statistiske analyser blev udført ved anvendelse af tre patientgrupper. Foruden de af Cox proportional hazard analyser, analyser tendens blev udført ved anvendelse gruppenumrene som kontinuerlige variabler til at vurdere indflydelsen af ​​de kombinerede markører på patientens overlevelse og tumortilbagevenden. Resulterende hazard ratio (HR) repræsenterer HR for hver enhed af stigning (stigning i gruppe nummer). Kumulative incidens kurver blev foretaget for DFS, LRRFS og DRFS, der tegner sig for konkurrerende risici [32]. Kaplan-Meier-kurver blev anvendt til at visualisere forskelle mellem de tre patientgrupper til OS. For alle statistiske analyser blev tosidede p-værdier ≤ 0,05 betragtes som statistisk signifikant, og p-værdier 0,05 p≤0.1 blev betragtet som en trend

Resultater

Expression i tumor. versus parrede normale kolorektale væv

nuklear udtryk for alle individuelle markører (EZH2, BMI1, SUZ12 og H3K27me3) i tumorvæv blev sammenlignet med nukleare udtryk i parrede normale kolorektale væv. Ved analyse ekspressionsforskelle i undersøgelsen kohorte som helhed kun median H3K27me3 og EZH2 ekspression var signifikant forskellige mellem tumor og normalt væv (p 0,001 og p = 0,05, henholdsvis, figur 1A). I individuelle tumorer, men alle markører viste markante forskelle i udtryk i forhold til deres normale modstykker (figur 1B). Overlevelse analyser baseret på nedenfor- eller over-median udtryk i normale væv ikke udviste forskelle i patient overlevelse eller tumor recidiv (data ikke vist).

(A) Vist er forskelle i nukleare udtryk, målt som procentdel af positivt farvede kerner, mellem normale og tumorvæv (n = 47). Boxplots viser median og rækkevidde af ekspression af hver af de individuelle markører i normal (N) og tumor (T) prøver. Medianen procentdele af positive kerner er givet for hver af markørerne. P-værdier repræsenterer statistiske forskelle mellem normale og tumor prøver, beregnet ved hjælp af Wilcoxon-test. (B) Histogrammer viser forskellen i ekspression mellem tumor og parrede normale væv (y-akse) for hver af de individuelle patienter (x-akse). Forskelle i udtryk blev beregnet som følger: udtryk forskel = udtryk i tumorvæv – udtryk i normalt væv. Negative værdier indikerer højere udtryk i normale væv, positive værdier angiver højere udtryk i tumorvæv.

Individuel markør analyser i tumorvæv

Eksempler på identifikation af positive og negative tumor cellekerner til hver af de individuelle markører fra ARIOL systemet er vist i figur 2. Vi analyserede først, hvis forekomsten af ​​histon modifikation H3K27me3 var korreleret med ekspressionen af ​​de individuelle PCG-proteiner. Den nukleare udtryk (procentdelen af ​​positive kerner) i H3K27me3 blev faktisk positivt korreleret med udtryk for EZH2 (p 0,001), BMI1 (p 0,001) og SUZ12 (p = 0,05). blev ikke observeret nogen korrelation mellem forekomsten af ​​de enkelte markører og TNM tumor stadie. For overlevelse analyser blev patienterne opdelt i lave og høje ekspressionsniveauer grupper baseret på medianen ekspression af hvert af de individuelle markører, som angivet i figur 1A. I overlevelse analyser af individuelle markører viste BMI1 stærke korrelationer til patientoverlevelse (OS og DFS) og tumor tilbagefald (LRRFS og DRFS) i begge univariate og multivariate analyser (tabel 2). EZH2 og H3K27me3 viste signifikante sammenhænge for DFS kun. For alle tre markører (BMI1, EZH2 og H3K27me3), blev høj ekspression forbundet med bedre patientoverlevelse sammenlignet med de patienter, der viser lav ekspression, med p-værdier for DFS p = 0,07 (BMI1), p = 0,04 (EZH2) og p = 0,06 (H3K27me3). SUZ12 viste ingen forskelle i patient overlevelse eller tumor tilbagefald baseret på lav eller høj ekspression af markøren i tumorvæv.

ARIOL systemet træner overlay viser korrekt identifikation af positive (angivet med gule prikker) og negative ( blå prikker) kerner i tumor kerner. TMA objektglas blev scannet under anvendelse af et 20x forstørrelse. Vist for alle markører er positivt farvede tumor kerner (

øverste række

) og negative tumor kerner (

nederste række

). Det ARIOL system blev uddannet til at identificere positive og negative celler for hver markør individuelt.

Combined markører

Vi antager, at kombinere flere markører ville resultere i en bedre lagdeling af patienter. Derfor har vi udført statistiske analyser på kombinationer af de histon-modificerende enzymer. Disse analyser viste, at ja kombinerer flere markører resulterede i statistisk signifikante forskelle mellem de patientgrupper og mere udtalte hazard ratio, hvilket indikerer en mere udtalt effekt på patientens overlevelse. Kombinationen af ​​histon-modificerende enzymer EZH2 og BMI1 viste signifikante forskelle for både patient overlevelse og gentagelse overlevelse, med p = 0,02 (HR = 0,72; 95% CI 0,54-0,94) for DFS og p = 0,012 (HR = 0,71; 95% CI 0,54-0,92) for LRRFS i multivariate analyser. Kombination EZH2 og SUZ12 viste en tendens til DFS i multivariate analyser, med p = 0,08 (HR = 0,77; 95% CI 0,57-1,04). Kombinationen af ​​BMI1 og SUZ12 viste signifikante forskelle for patient overlevelse, med p = 0,02 (HR = 0,76; 95% CI 0,61-0,96) for samlet overlevelse og p = 0,05 (HR = 0,73; 95% CI 0,54-1,00).

Da de tre PCG proteiner virker sammen i multi-protein-komplekser til at regulere H3K27me3 udtryk, vi hypotese, at kombinere alle markører (BMI1, EZH2, SUZ12 og H3K27me3) i én variabel ville resultere i endnu bedre lagdeling af patienter. Patienterne blev inddelt i fem grupper baseret på antallet af markører, der viser høj nuklear ekspression. Dette resulterede i følgende patientgrupper: alle lav (gruppe 1), en høj (gruppe 2), to høj (gruppe 3), tre høj (gruppe 4) og alle høj (gruppe 5). Patientkarakteristika af de 5 patientgrupper var sammenlignelige med undersøgelsen kohorte (tabel S1). Multivariate trend analyser af de kombinerede markører, hjælp patientgruppen numre som kontinuerte variable viste overordnede hazard ratio på 0,79 til 0,88 for hver ekstra markør viser høj nukleare udtryk i både univariate og multivariate analyser, hvilket indikerer en bedre patient overlevelse og lavere chancer for tumor tilbagefald for hver yderligere markør viser høj ekspression (figur 3A). Når patienten numre gruppe blev opført som kategoriske variable blev en lignende tendens (figur 3B og 3C). Generelt hazard ratio for OS faldt med stigende gruppenummer, hvilket indikerer en bedre patientoverlevelse, når flere markører blev højt udtrykt i forhold til “alle lav” ekspression gruppe (gruppe 1). Patienter, der viser høj ekspression af alle markører, “all høj” gruppe (gruppe 5), viste den bedste samlede overlevelse (p = 0,01, HR = 0,42, 95% CI 0,21-0,84) sammenlignet med referencegruppen 1, som viste korteste overlevelse. Grupper 2, 3 og 4 viste lignende hazard ratio (figur 3B og 3C), som også blev afspejlet i Kaplan-Meier overlevelseskurver, der kører tæt på hinanden i forhold til overlevelseskurverne for gruppe 1 og 5. Derfor besluttede vi at kombinere de tre patientgrupper 2,3 og 4 i en gruppe, hvilket resulterer i tre patientgrupper (gruppe 1, gruppe 2-4 og gruppe 5). Kaplan-Meier kurver og kumulative incidens plots viste signifikante forskelle mellem de tre resulterende patientgrupper til OS, DFS, LRRFS og en tendens til DRFS, hvilket også blev afspejlet i de 5-årige overlevelsesrater (figur 4). Den bedste patientoverlevelse og længste gentagelse-fri perioder blev observeret for patienter, der viser høj ekspression af alle fire markører ( “alle høj”, gruppe 5) i tumor prøver, med 5-års overlevelsesrater på 77% til OS, 83% for DFS og DRFS, og 86% for LRFS. Patienter i kombinerede grupper 2-4 viste kortere OS, DFS og LRFS, med 5-års overlevelsesrater på 67% til OS og DFS, 69% for LRFS og 72% for DRFS. Patienterne i “all lav” gruppe (gruppe 1) viste signifikant kortere OS, DFS og LRFS forhold til nogen af ​​de andre patientgrupper, med 5-års overlevelsesrater på 43% til OS og LRFS, 49% for DFS og 55% for DRFS. Tilsammen 5-årige overlevelsesrater var lavere, når flere markører viste lav udtryk. De hazard ratio i både univariate og multivariate afspejles også disse fund (tabel 3): gruppe 5 viser laveste hazard ratio sammenlignet med referencegruppen en (for eksempel multivariate HR = 0,23 (0,08-0,67) for DFS). Dette indikerer en lavere risiko for en hændelse (patient død eller locoregional tumor recidiv) for patienter i “alle høje” gruppe til OS, DFS og LRFS. For DRFS, statistisk signifikante resultater blev kun observeret i univariate analyser

patientgrupper var gjort baseret på antallet af markører, der viser høj ekspression:. Alle lav (gruppe 1), en høj (gruppe 2), to high ( gruppe 3), tre høj (gruppe 4) og alle høj (gruppe 5). (A) univariate og multivariate Cox regression trend analyser blev udført ved anvendelse af de kombinerede markørgrupper som kontinuerlige variabler. Hazard ratio pr forøgelse af hver af de patientgrupper blev plottet (B) og opført (C) for både univariate og multivariate Cox regression trend analyser under anvendelse af de kombinerede markørgrupper som kategoriske variable. Antallet af patienter i de enkelte patientgrupper var: gruppe 1 (n = 28), gruppe 2 (n = 59), gruppe 3 (n = 55), gruppe 4 (n = 74) og gruppe 5 (n = 31) .

Kombineret markør (EZH2, BMI1, SUZ12 og H3K27me3) udtryk grupper blev opdelt i tre patientgrupper: gruppe 1, grupper 2-4 og gruppe 5. Antallet af patienter i de enkelte patientgrupper var: gruppe 1 (n = 28), gruppe 2 (n = 59), gruppe 3 (n = 55), gruppe 4 (n = 74) og gruppe 5 (n = 31). Kaplan-Meier-kurver blev foretaget for samlet overlevelse (A) og kumulative incidens kurver er vist for sygdomsfri overlevelse (B), locoregional gentagelse overlevelse (C) og fjernmetastaser overlevelse (D). 5-årige overlevelsesrater er givet for hver patientgruppe. Tabeller kurverne angiver tallene i fare (#) per gruppe for de forskellige tidspunkter.

Diskussion

Ud over genmutationer, afvigende ekspressionsmønstre af epigenetisk regulatorer er blevet anerkendt som afgørende begivenheder i tumorigen proces, hvilket resulterer i markante ændringer i genekspression. Ændringer i ekspressionen af ​​disse epigenetiske regulatorer omfatter DNA methyltransferaser og deraf følgende ændringer i DNA-methylering profiler, og histon-modificerende enzymer og deraf følgende ændringer i deres tilsvarende histon modifikationer. I denne undersøgelse undersøgte vi udtryk for tre PCG proteiner (EZH2, BMI1 og SUZ12) og tilhørende histon modifikation H3K27me3 i kolorektale kræft væv. Afvigende ekspression af hvert af disse histon-modificerende enzymer, og histon modifikation H3K27me3, er blevet angivet at bidrage til tumorigenese i flere typer af cancer og er blevet korreleret til patientresultatet [11] – [24]. Studier i litteraturen viser modstridende resultater vedrørende den prognostiske værdi af de Polycomb gruppe proteiner i kolorektal cancer. For eksempel har høj EZH2 udtryk været forbundet med dårlig prognose i en serie af kolorektal cancer patienter af Wang

et al

. [33], mens blev fundet høje EZH2 udtryk at være forbundet med bedre tilbagefald overlevelse hos patienter med tyktarmskræft (men ikke i rektal kræftpatienter) ved Fluge

et al

. [34]. Derudover blev høj ekspression af BMI1 fundet at korrelere med god prognose ved brystcancer i en undersøgelse af Pietersen

et al

. [35], mens høj BMI1 var forbundet med dårlig prognose i tyktarmskræft i en undersøgelse af Du

et al

. [36]. I vores undersøgelse kohorte, overlevelsesdata for de enkelte markører viste, at høj ekspression af alle markører var korreleret med bedre patientoverlevelse og længere tilbagefald-fri perioder sammenlignet med patienter, der viser lav ekspression. De fundne resultater i denne undersøgelse svarer til vore tidligere fund, at høj ekspression af H3K27me3 var forbundet med bedre overlevelse patient i rektale tumorer [4]. I denne undersøgelse viste vi, at høj ekspression af H3K27me3 faktisk var forbundet med bedre patientoverlevelse og længere tilbagefald-fri perioder. Som vi viste, at ekspressionen af ​​PCG proteinerne var direkte relateret til ekspression af H3K27me3, forventede vi en lignende korrelation mellem ekspressionen af ​​PCG proteiner med kliniske resultater, der faktisk blev bekræftet af resultaterne i dette manuskript. Høje niveauer af H3K27me3, på grund af afvigende ekspression af PCG-proteiner, kan forhindre afvigende ekspression af onkogener, aktivering af retrotransposonregulatoriske sekvenser (såsom LINE-1; [4]), og resulterer i andre (EPI) genomiske begivenheder der fremmer tumor aggressivitet.

Ud over de enkelte markører, har kombinationer af PCG proteiner i sammenhæng med patientens resultat blevet undersøgt af flere forskningsgrupper. For eksempel blev co-ekspression af EZH2 og BMI1 rapporteret at være associeret med dårlig prognose i forskellige cancere [37] – [39]. I modsætning hertil blev overekspression af EZH2 og BMI1 rapporteret at have forskellige indvirkninger på patienten prognose ved brystcancer [35], og viste sig at have nogen prognostisk værdi i urothelial carcinoma i blæren [40]. I vores kolorektal cancer studie kohorte, alle kombinationer af histon-modificerende enzymer viste prognostisk værdi. For at få mere information om epigenetiske veje med potentiel prognostisk værdi i kolorektal cancer, vi udførte multivariat overlevelse analyser ved hjælp kombineret udtryk data fra flere PCG proteiner (EZH2, BMI1 og SUZ12) og deres tilhørende histon modifikation H3K27me3. Kombinere de tre PCG proteiner og deres tilhørende histon modifikation resulterede i signifikant bedre lagdeling af patientgrupper i forhold til de enkelte markører. I kombineret markør analyser, blev den bedste patientens overlevelse og længste gentagelse-fri perioder observeret for patienter, der viser høj ekspression af alle fire markører ( “alle høj”) i tumor prøver. Patienterne i “all lav” gruppe viste signifikant kortere OS, DFS og LRFS forhold til nogen af ​​de andre patientgrupper. Resultaterne af den kombinerede markør analyser understrege samarbejdet af disse tre enzymer i PCG komplekser, og dermed give en bedre risiko lagdeling af patienter.

Ud over de roller EZH2, BMI1 og SUZ12 i epigenetisk regulering af kromatin struktur og genekspression, har direkte regulering af protein-funktion blevet beskrevet for EZH2 og BMI1, herunder protein phosphorylering og ubiquitinering. Et cytosolisk EZH2 og SUZ12-holdige methyltransferase kompleks har været forbundet med actinpolymerisation, en vigtig proces i celleproliferation [41]. Shuttling af EZH2 og SUZ12 indeholdende kompleks mellem forskellige cellulære rum kan forklare den svage cytosoliske farvning observeret for EZH2 og SUZ12 foruden den stærke nukleare farvning for disse markører, i forhold til det strengt nuklear farvning observeret for BMI1. En anden ikke-histon-protein demethyleret ved EZH2 kardial transkriptionsfaktor GATA4. Methylering reducerer transkriptionel aktivitet, hvilket resulterer i inhibering af korrekt hjertefunktion udvikling [42]. Disse eksempler viser, at afvigende ekspression af disse PCG proteiner påvirkninger vigtige processer som gentranskription og celleproliferation, fremme transformationen af ​​normale celler i tumorceller.

Som konklusion, viste vi, at kombineret udtryk for PCG proteiner EZH2, BMI1 og SUZ12 og tilhørende histon modifikation H3K27me3 har prognostisk værdi i vores kolorektal cancer studie kohorte. Kombineret markør udtryk resulterede i en bedre lagdeling af patienter i forhold til de enkelte markører og dermed giver mere indsigt i de roller, disse epigenetiske proteiner og -modifications i kolorektal cancer. Andre kombinationer af epigenetiske mekanismer bør undersøges i kolorektal cancer for yderligere at optrævle den underliggende biologi i individuelle tumorer. Dette vil fremme søgningen efter nye biomarkører, der skal bruges i et klinisk miljø for bedre at klassificere patienter til behandling.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Patient karakteristika for alle patientgrupper, der anvendes i kombineret-markør analyser. Patient karakteristika er vist for alle patientgrupper, som anvendes i den kombinerede-markør analyser. De patientgrupper viser lignende kendetegn patient til fuldstændig undersøgelse kohorte af 247 patienter (tabel 1). P-værdier repræsenterer Jonckheere-Terpstra-test bruges til at teste, om prøverne kom fra samme fordeling. For variablen “tumorstørrelse” blev en envejs ANOVA test udført for at teste for statistiske forskelle mellem patientgrupperne

doi:. 10,1371 /journal.pone.0108265.s001

(DOC)

tak

Vi vil gerne takke CM Janssen for at give os de væv microarray sektioner anvendes til immunhistokemi.