PLoS ONE: modtagelighed for Human hoved- og halscancer Celler til kombineret Hæmning af glutathion og Thioredoxin Metabolism

Abstrakt

Øget glutathion (GSH) og thioredoxin (Trx) stofskifte er mekanismer, der er almindeligt impliceret i modstand kræft celler til kemoterapi. Den aktuelle undersøgelse bestemmes, hvis samtidige inhibering af GSH og Trx metabolisme forøget celledrab af menneskelige hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) celler ved en mekanisme, der involverer oxidativ stress. Hæmning af GSH og Trx metabolisme med buthioninsulfoximin (BSO) og auranofin (AUR), henholdsvis inducerede signifikante fald i klonogene overlevelse sammenlignet med enten lægemiddel alene i FaDu, Cal-27 og SCC-25 HNSCC celler

in vitro

og

in vivo

i Cal-27 xenotransplantater. BSO + AUR signifikant øget glutathion og thioredoxin oxidation og undertrykt peroxiredoxin aktivitet

in vitro

. Forbehandling med N-acetylcystein helt vendt BSO + AUR-induceret celle drab i FaDu og Cal-27 celler, mens katalase og selen tilskud kun hæmmede BSO + AUR-induceret celle drab i FaDu celler. BSO + AUR faldt caspase 3/7 aktivitet i HNSCC celler og væsentligt reduceret levedygtighed både Bax /Bak dobbelt knockout (DKO) og DKO-Bax rekonstituerede hæmatopoietiske celler tyder på, at nekrose var involveret. BSO + AUR også signifikant sensibiliserede FaDu, Cal-27, SCC-25 og SQ20B celler til celledræbende fremkaldt af EGFR inhibitor Erlotinib

in vitro

. Disse resultater understøtter den konklusion, at samtidige hæmning af GSH og Trx stofskifte veje inducerer oxidativt stress og klonogenisk drab i HNSCCs og denne strategi kan være nyttige i sensibiliserende HNSCCs til EGFR-hæmmere

Henvisning:. Sobhakumari A, Love-Homan L Fletcher EVM, Martin SM, Parsons AD, Spitz DR, et al. (2012) modtagelighed for Human hoved- og halscancer Celler til kombineret Hæmning af glutathion og Thioredoxin Metabolism. PLoS ONE 7 (10): e48175. doi: 10,1371 /journal.pone.0048175

Redaktør: Jinah Choi, University of California, Merced, USA

Modtaget: 19. juni 2012; Accepteret: September 21, 2012; Udgivet 31. oktober, 2012 |

Copyright: © 2012 Sobhakumari et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health Tilskud K01CA134941 (ALS), R01CA133114 og P30CA086862 (DRS), samt departementerne Patologi og Radiation Oncology ved The University of Iowa. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Erhvervet resistens mod kemoterapi er en væsentlig hindring for en vellykket hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) behandling. Tidlige stadie HNSCC patienter har en høj risiko for at udvikle sekundære tumorer, selv efter lokal kontrol er opnået [1] – [3]. Derfor forstå de molekylære mekanismer, der er forbundet med kemoterapi modstand i kræftceller kan føre til forbedringer i patientens overlevelse

Øget glutathion (GSH) og thioredoxin (Trx) stofskifte er mekanismer, der er blevet bredt impliceret i kemoterapi resistens [4] – [7] og begge disse metabolisme baner spiller en vigtig rolle i reaktive oxygenarter (ROS) afgiftning [ ,,,0],8] – [11]. Funktionerne GSH systemet via glutathionperoxidase (GPX) enzymer, der inaktiverer H

2O

2 og andre hydroperoxider (herunder alkyl- og lipidperoxider) ved omdannelse af GSH til glutathiondisulfid (GSSG), som omdannes tilbage til GSH ved glutathionreduktase (GR) under anvendelse NADPH ([12], figur 1A). TRX-systemet er involveret i afgiftning af H

2O

2 og hydroperoxider via virkningen af ​​peroxiredoxins (Prx). Under denne proces oxideres Trx (Trx [S

2]) er dannet som derefter reduceres med thioredoxin reduktase (TR) også ved anvendelse af reducerende ækvivalenter fra NADPH (figur 1A [13])

A.: NADPH er en kilde til reducerende ækvivalenter for glutathion bestående af reduceret glutathion (GSH), glutathiondisulfid (GSSG), glutathionperoxidase (GPX), og glutathion reduktase (GR) og thioredoxin bestående af reduceret thioredoxin [Trx (SH)

2], thioredoxin disulfid [Trx (S

2)], peroxiredoxin (Prx), og thioredoxin reduktase (TR). BSO inhiberer γ-glutamylcystein ligase (GCL), som katalyserer reaktionen mellem cystein og L-glutamat til dannelse γ-glutamyl-cystein. Glutathionsyntetase (GS) konverterer γ-GCS til GSH. AUR inhiberer TR aktivitet. FaDu, Cal-27 og SCC-25-celler blev behandlet med 0,5 pM AUR og /eller 1 mM BSO i 24 timer og analyseret for total GSH (B) og TR-aktivitet (C). Fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien (SEM) af N = 3 eksperimenter *, p. 0,05 versus kontrol

Talrige undersøgelser i årenes løb har udforsket strategier individuelt hæmme GSH eller Trx metabolisme i supplement til konventionel kemoterapeutiske stoffer, men har ført til variable resultater [14] – [16] sandsynligvis på grund af de afskedigede beskyttende funktioner disse systemer [17] – [20]. I betragtning af, at begge systemer afgifte H

2O

2 og bruge NADPH som reducerende ækvivalenter, er det logisk, at både GSH og Trx systemer har overlappende og overflødige funktioner i afgiftning af ROS. At overvinde redundans i disse veje, som de vedrører resistens mod terapi i HNSCC, den aktuelle undersøgelse bestemmes virkningen af ​​samtidig inhibering både GSH og Trx metabolisme ved hjælp buthioninsulfoximin (BSO, en inhibitor af GSH-syntese), og auranofin (AUR; en inhibitor af TR aktivitet

in vitro

in vivo

. Denne strategi viste sig at være meget effektiv til at øge oxidativ stress-medieret tumor celle drab og øge følsomhed over for Erlotinib kemoterapi.

Materialer og metoder

celler og dyrkningsbetingelser

FaDu, Cal-27 og SCC-25 menneskelige hoved og hals skællede carcinom (HNSCC) celler blev opnået fra American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA). SQ20B HNSCC celler [21] var en gave fra Dr. Anjali Gupta (Department of Radiation Oncology, The University of Iowa). Alle HNSCC cellelinjer var p53 mutant. HNEpC celler blev opnået fra Promocell (Heidelberg, Tyskland). Alle cellelinjer blev bekræftet af ATCC for levedygtighed (før frysning og efter optøning), vækst, morfologi og isoenzymology. Celler blev opbevaret i henhold til leverandørens anvisninger og bruges i et kursus på højst 3 måneder efter genoplivning af frosne portioner. Bax /Bak double-knockout (DKO) og DKO-Bax rekonstitueret muse hæmatopoietiske celler var en generøs gave fra Dr. Craig Thompson (University of Pennsylvania, Philadelphia, PA). FaDu, Cal-27 og SQ20B-celler blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 4 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1,5 g /l natriumbicarbonat og 4,5 g /l glucose med 10% føtalt bovint serum (FBS ; Hyclone, Logan, UT). SCC-25 celler blev holdt i en 01:01 blanding af Dulbeccos modificerede Eagles medium og Hams F12-medium indeholdende 1,2 g /l natriumbicarbonat, 2,5 mM L-glutamin, 15 mM HEPES, 0,5 mM natriumpyruvat, 4,5 g /l glucose, og 400 ng /ml hydrocortison med 10% føtalt bovint serum. DKO og DKO-Bax-celler blev opretholdt i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin, 100 g /ml streptomycin og 50 uM 2-mercaptoethanol. HNEpC celler blev holdt i luftvejsepitelceller vækstmedium (Promocell) indeholdende 4 pl /ml oksehypofyseekstrakt, 10 ng /mL epidermal vækstfaktor, 5 pg /ml insulin, 0,5 ug /ml hydrocortison, 0,5 ug /ml epinephrin, 6,7 ng /ml triiod-L-thyronin og 0,1 ng /mL retinsyre. Kulturerne blev holdt i 5% CO

2 og befugtede i en 37 ° C inkubator.

Drug Treatment

Pegyleret katalase (CAT), staurosporin (STS), ionomycin (ION) og L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (BSO) blev opnået fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Auranofin (AUR) blev opnået fra ICN Biochemicals (Aurora, OH). Erlotinib (ERL) markedsføres som Tarceva og N-acetylcystein (NAC) markedsført som Acetadote (Cumberland Pharmaceuticals, Nashville TN), blev opnået fra indlæggelse apotek på University of Iowa Hospitaler og Klinikker. Alle lægemidler blev anvendt uden yderligere oprensning. Lægemidler blev tilsat til celler ved slutkoncentrationer på 1 mM BSO, 0,5 uM AUR, 20 mM NAC, 1000 U /ml CAT, 10 uM ERL, 10 uM STS og 100 uM ION. BSO, CAT, og SEL blev opløst i phosphatbufret saltvand (PBS). AUR, STS, ERL og ION blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO). Det påkrævede volumen af ​​hvert lægemiddel blev tilsat til celledyrkningsmedier på celler for at opnå de ønskede slutkoncentrationer. kontrol af køretøjer blev inkluderet i hvert forsøg.

Glutathion assay

Reduceret glutathion (GSH) og glutathion disulfid (GSSG) blev bestemt ved hjælp af et kommercielt glutathion assay kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) . Alle glutathion bestemmelser blev normaliseret til indholdet af hele homogenater under anvendelse af Bradford-metoden protein.

Thioredoxin reduktase Assay

Thioredoxin reduktase (TR) aktivitet blev bestemt spektrofotometrisk under anvendelse af et kommercielt thioredoxin reduktase assaykit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Proteinkoncentrationer blev bestemt ved Bradford-metoden.

cellelevedygtighed

Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse Prestoblue ™ cellelevedygtighed reagens (Invitrogen, USA) ifølge producentens protokol.

klonogene celleoverlevelsestilstande eksperimenter

Klonogen overlevelse blev bestemt som tidligere beskrevet [21]. Individuelle assays blev udført med flere fortyndinger med mindst fire kloning retter per datapunkt, gentaget i mindst 3 separate eksperimenter.

siRNA Transfektion

Thioredoxin reduktase (TR) og kontrol-siRNA blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). HNSCC celler blev transficeret med 20 nM siRNA ved 80% sammenløb i reduceret serum Eagles minimale essentielle medium (EMEM, Santa Cruz, CA) i 24 timer. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) blev anvendt til transfektioner følgende protokoller leveret af fabrikanten. Biokemiske analyser blev udført 48-72 timer efter transfektion.

Caspase 3/7 Aktivitet

Caspase 3/7 aktivitet blev vurderet ved hjælp af ApoTox-Glo ™ Triplex Assay (Promega Corporation, Madison WI) .

thioredoxin redox western blots

thioredoxin Western blots blev udført som tidligere beskrevet [22] – [25]. Celler blev inkuberet med enten 2 mM DL-dithiothreitol (DTT) eller 2 mM H

2O

2 i 10 minutter ved stuetemperatur, før inkubation med 50 mM IAA, der skal anvendes som kontroller for at hjælpe med identifikation af thioredoxin redoxtilstand bands.

glutathionreduktase (GR) Assay

GR-aktivitet blev målt ifølge fremgangsmåden beskrevet af Alison og Stellwagen [26] metode. Dataene blev normaliseret per mg protein som bestemt ved Lowry-proteinassay.

glutathionperoxidase (GPX) Aktivitet

Selen afhængig GPX-aktivitet blev målt som tidligere [27] beskrevne. Dataene blev normaliseret per mg protein som bestemt ved Lowry-proteinassay.

Peroxiredoxin aktivitetsassay

2-Cys-Peroxiredoxin aktivitet blev målt som beskrevet [28]. Kort fortalt blev den indledende hastighed af NADPH oxidation overvåges spektrofotometrisk ved 340 nm ved 30 ° C i en reaktionsblanding (150 pi) indeholdende 50 mM Hepes-NaOH (pH 7,0), 0,25 mM NADPH, 46 nM TR, 2,4 mM Trx og 0,13 mM H

2O

2. Reaktionen blev initieret ved tilsætning af H

2O

2 og overvåges i 10 min.

katalaseaktivitet Assay

CAT-aktivitet blev målt på cellehomogenater ved at overvåge forsvinden 10 mmol /LH

2O

2 i 50 mmol /l kaliumphosphat (pH = 7,0) spektrofotometrisk ved 240 nm. Aktiviteter blev udtrykt i mk enheder /mg protein som beskrevet [29].

Tumor celle implantation

Kvindelige 4-5 uger gamle athymiske-nu /nu nøgne mus blev købt fra Harlan Laboratories (Indianapolis , IN). Mus blev huset i et patogen-fri barriere rum i Animal Care Facility på University of Iowa og håndteres anvendelse af aseptiske procedurer. Alle procedurer blev godkendt af IACUC udvalg fra University of Iowa og var i overensstemmelse med de retningslinjer, som NIH. Mus fik lov mindst 3 dage at akklimatisere før begyndelsen eksperimenter og mad og vand blev gjort frit tilgængelige. Tumorceller blev inokuleret i nøgne mus ved subkutan injektion af 0,1 ml portioner af saltvand indeholdende 4 × 10

6 Cal-27 celler i den højre flanke under anvendelse af 26-gauge nåle.

Tumormålinger

i de

in vivo

eksperimenter mus begyndte narkotikabehandling 1 uge efter tumor podning med en gennemsnitlig tumor volumen på 0,025 cm

3. Mus blev evalueret dagligt og tumormålinger tages tre gange om ugen ved hjælp af Vernier skydelære. Tumorvolumener blev beregnet ved hjælp af formlen: tumor volumen = (længde × bredde

2) /2 hvor længden var den længste dimension, og bredden var dimensionen vinkelret på længden

In vivo.

narkotika administration

mus var inddelt i 4 grupper (n = 6-10 mus /gruppe). BSO gruppe: BSO blev opløst i saltvand og administreret 400 mg /kg i.p. hver dag i 2 uger. AUR gruppe: AUR stamopløsning blev fortyndet med saltvand og administreret i.p. 1 mg /kg hver dag i 2 uger. BSO + AUR gruppe: mus blev administreret 400 mg /kg BSO plus 1 mg /kg AUR i.p. hver anden dag i 2 uger. Kontrolgruppe: mus blev administreret en saltopløsning hver dag i.p. Mus blev aflivet via CO

2 gas kvælning eller dødelig overdosis af natrium pentobarbital (100 mg /kg), når tumor diameter oversteg 1,5 cm i enhver dimension.

Statistisk analyse

Statistisk analyse var gøres ved hjælp af GraphPad Prism, version 5 til Windows (GraphPad Software, San Diego, CA). Forskelle mellem 3 eller flere midler blev bestemt ved envejs ANOVA med Tukey post-tests. Lineære effekter regressionsmodeller blev anvendt til at estimere og sammenligne det gruppespecifikke ændring i tumorvækstkurver. Alle statistiske analyser blev udført på p. 0,05 signifikansniveau

Resultater

BSO og AUR faldt GSH syntese og TR aktivitet

BSO og AUR er almindeligt kendt hæmmere af cellulær GSH syntese og TR-aktivitet henholdsvis som illustreret i forenklet skematisk i figur 1A. For at bekræfte disse virkninger af BSO og AUR i HNSCC celler, eksponentielt voksende FaDu blev Cal-27 og SCC-25-celler behandlet med 1 mM BSO og /eller 0,5 pM AUR i 24 timer og derefter analyseret for totale GSH-indholdet og TR-aktivitet. GSH-produktion blev signifikant formindsket både BSO og BSO + AUR behandlede celler i alle 3 cellelinier, hvilket antyder, at BSO faktisk var stand til at inhibere GSH-syntese (figur 1B). BSO også signifikant forøget TR aktivitet i FaDu og SCC-25 celler og viste en tendens mod øget TR aktivitet i Cal-27-celler (Figur 1C). Desuden blev TR aktivitet inhiberes i AUR og BSO + AUR-behandlede celler bekræfter virkningsmekanismen for AUR (figur 1C). AUR også øget GSH produktion i alle 3 cellelinjer (figur 1B). Disse resultater antyder, at BSO og AUR inhibere GSH produktion og TR-aktivitet henholdsvis efter 24 timers behandling i HNSCC celler

in vitro

.

BSO og AUR nedsat cellelevedygtighed og klonogene overlevelse

at undersøge de cytotoksiske virkninger af BSO og AUR på HNSCC celler, cellernes levedygtighed og klonogene overlevelse blev testet efter BSO og AUR behandling i eksponentielt voksende FaDu, Cal-27 og SCC-25 celler. BSO og AUR som enkelte midler inducerede ikke nogen væsentlig reduktion i metaboliske cellelevedygtighed selv blev observeret en stigning i levedygtighed med BSO behandling (i Cal-27 og SCC-25 celler) og med AUR behandling (i FaDu celler, figur 2A). I modsætning hertil kombinationen af ​​BSO og AUR signifikant reduceret cellelevedygtighed i alle 3 cellelinjer sammenlignet med de andre behandlingsgrupper (figur 2A). Tilsvarende blev signifikant klonogenisk celledrab observeret med kombinationen af ​​BSO og AUR i alle 3 cellelinjer sammenlignet med enten alene agent antyder, at BSO og AUR skal anvendes på samme tid for at inducere celledrab i HNSCC celler (figur 2B) . Når cellelevedygtighed som respons på BSO + AUR blev testet over en 24 timers periode, viste det sig, at betydelige reduktioner i cellelevedygtighed ikke blev observeret indtil 16 timer (CAL-27 og SCC-25) og 24 timer (FaDu) efter behandling (figur 2C). I modsætning hertil signifikant reduktion i klonogene overlevelse som reaktion på BSO + AUR begyndte at dukke så snart 1 time efter behandling i SCC-25-celler og 4 timer efter behandling i FaDu celler (Figur 2D). Disse resultater viser klart, at overvågning af ændringer i cellelevedygtighed som en funktion af tiden ikke nødvendigvis afspejler lægemiddelinduceret celledrab som målt ved kolonidannende evne. Vi har desuden observeret, at BSO + AUR-induceret cytotoksicitet målt ved klonogene assay, var signifikant mindre i sammenflydende HNSCC celler sammenlignet med eksponentielt voksende kræftceller (figur 3A) antyder, at BSO + AUR var mere effektivt i eksponentielt voksende celler. Derudover FaDu celler var signifikant mere følsomme end normale humane epitelceller (HNEpCs) og BSO + AUR efter 24 timer, hvilket antyder, at BSO + AUR var fortrinsvis toksisk for HNSCC celler sammenlignet med normale “ikke-transformerede” celler (figur 3B). Samlet set resultaterne i både levedygtighed og klonogene forsøg tyder på, at BSO + AUR synes at fremkalde mere end additiv celle drab i FaDu, Cal-27 og SCC-25 celler

in vitro

.

FaDu, Cal-27 og SCC-25-celler blev behandlet med 0,5 pM AUR og /eller 1 mM BSO i 24 timer og analyseret for cellelevedygtighed (A) og klonogenisk celleoverlevelse (B). Celler blev behandlet som nævnt ovenfor og levedygtighed (C) og klonogenisk celleoverlevelse (D) blev målt over en periode på 8 timer (klonogene overlevelse, [D]) eller 24 timer (levedygtighed, [C]). Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus kontrol; ¥, s 0,05 versus BSO eller AUR

A:. Eksponentiel voksende og sammenflydende FaDu, Cal-27 og SCC-25 celler blev behandlet med 0,5 pM AUR og /eller 1 mM BSO i 24 timer og analyseret for klonogene overlevelse. Klonogene celle overlevelsesdata blev normaliseret til eksponentielt voksende og sammenflydende kontrolceller (ikke vist). B: FaDu og HNEpC celler blev behandlet med BSO + AUR og antallet af levedygtige bundne celler blev talt efter 24 timer. Antallet af levedygtige BSO + AUR-behandlede celler blev normaliseret til deres respektive kontroller (con). Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus EXP; ¥, s. 0,05 versus CON

Thioredoxin reduktase (TR) knockdown sensibiliserede FaDu celler til BSO

for at bekræfte, at AUR-inducerede ændringer i cytotoksicitet skyldtes undertrykkelse af TR-aktivitet , TR-ekspression blev slået ned med siRNA rettet mod TR i FaDu celler og behandlet med eller uden BSO i 24 timer. TR knockdown resulterede i en signifikant undertrykkelse af TR-aktivitet (tabel 1) og sensibiliserede FaDu celler til BSO som bestemt ved klonogene assay (figur 4). Disse resultater giver yderligere støtte til den hypotese, at hæmning af Trx stofskiftet sensibiliserer HNSCC celler til celle drab i tilstedeværelse af inhibitorer af GSH stofskifte.

TR udtryk blev slået ned i FaDu celler ved hjælp siRNA målrettet til TR og analyseret for klonogene overlevelse med og uden 1 mM BSO behandling i 24 timer. Klonogen overlevelse data normaliseret til kontrol (CON). Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus kontrol; ¥, s. 0,05 versus BSO eller siTR

BSO + AUR induceret nekrotisk celledød

Den cytotoksiske respons BSO + AUR kunne påvises morfologisk hjælp fasekontrast mikroskopi . Cal-27 celler behandlet med BSO og /eller AUR kun 6 timer blev rundet og frigjort fra vævskulturskåle sammenlignet med BSO eller AUR-behandlede celler, der var knyttet og kiggede intakt (figur 5A). De samme observationer blev set i FaDu og SCC-25-celler (data ikke vist). At afgøre, om apoptose eller nekrose var involveret i BSO + AUR-induceret celledød, analyserede vi caspase 3/7 aktivitet som respons på BSO og /eller AUR i 24 timer i FaDu og Cal-27-celler. Celler behandlet med staurosporin (STS, 10 um, 6 h) og ionomycin (ION, 100 um, 6 timer) blev anvendt som positive kontroller for apoptose og nekrose hhv. Vi fandt, at AUR signifikant forøget caspase 3/7 aktivitet sammenlignet med kontrol behandlede celler på kun Cal-27-celler (figur 5B). Imidlertid BSO + AUR faldt betydeligt caspase 3/7 aktivitet i FaDu og Cal-27-celler, som var sammenlignelig med ionomycin behandlede celler (figur 5B), hvilket antyder, at nekrose og ikke apoptose var involveret i mekanismen af ​​celledød. Til støtte for disse resultater, vi desuden undersøgt effekten af ​​BSO + AUR på Bax

– /- Bak

– /- double knock out (DKO) muse hæmatopoietiske celler. Apoptosisvejen ophæves i DKO-celler ved genetisk deletion af de pro-apoptotiske faktorer, Bax og Bak rendering disse celler er afhængige af nekrose når de udsættes for dødelige fornærmelser [30]. Vi anvendte også DKO celler, som blev rekonstitueret med Bax (DKO-Bax) ved transfektion med en vektor indeholdende Bax (pCDNA3 /Bax) som tidligere beskrevet [30]. Rekonstituering af Bax i DKO-celler er blevet vist at genoprette deres følsomhed over for apoptotiske stimuli [30], [31]. Vi observerede, at BSO alene ikke påvirkede levedygtighed enten DKO eller DKO-Bax celler (Figur 5C). Imidlertid DKO-Bax men ikke DKO-celler var meget følsomme over for AUR behandling (figur 5C), som understøtter tidligere rapporter om, at AUR fremkalder et apoptotisk respons [32]. Både DKO og DKO-Bax-celler var meget følsomme over for BSO + AUR tyder på, at nekrose var celledøden pathway involveret i respons på BSO + AUR (figur 5C). Disse resultater antyder, at BSO + AUR i doser og anvendt i disse studier behandlingstider induceret nekrotisk celledød

A:. Fasekontrast billeder af Cal-27-celler blev udtaget efter 6 timers behandling med 0,5 pM AUR og /eller 1 mM BSO. B: FaDu og Cal-27-celler blev behandlet med 0,5 pM AUR og /eller 1 mM BSO i 24 timer, derefter analyseret for caspase 3/7 aktivitet under anvendelse af et luminescens-assay. Celle behandling med staurosporin (STS) og ionomycin (ION) i 6 timer, blev anvendt som positive kontroller for apoptose og nekrose hhv. Alle behandlinger blev normaliseret til kontrol. *, P 0,05 versus kontrol; ¥, s 0,05 versus BSO eller AUR. C: Bax /Bak dobbelt knockout (DKO) celler og DKO celler med rekonstitueret Bax (DKO-Bax) blev behandlet med 0,05 mM BSO og 2 uM AUR i 24 timer og derefter analyseret for celleviabilitet. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus kontrol; ¥, s 0,05 versus BSO eller AUR; £, p. 0,05 versus DKO celler

BSO + AUR inducerede GSH og Trx oxidation

Da en stigning i oxideret GSSG (% GSSG) menes at betyde et skift i retning af en mere stærkt oxiderende intracellulære miljø indikerer oxidativ stress [12], undersøgte vi ændringer i% GSSG som reaktion på BSO og AUR. BSO + AUR inducerede en signifikant forøgelse i% GSSG sammenlignet med BSO og AUR alene i FaDu celler, mens både BSO og BSO + AUR behandlede grupper inducerede en signifikant stigning i% GSSG sammenlignet med kontrol i Cal-27-celler (figur 6A). Analyse af thioredoxin-1 (Trx-1) redox-western blot eksperimenter viste, at behandling med BSO + AUR i FaDu celler resulterede i en stigning i oxideret TrX-1 (TRX1 [S

2] og TRX1 [S

2 ]

2) ekspression som ses ved den forøgede ekspression af de øverste 2 bands i figur 6B sammenlignet med de andre behandlingsgrupper. En lignende virkning blev set i Cal-27 celler som respons på BSO + AUR behandling, selvom den totale mængde af Trx (reduceret + oxideret) syntes at være mindre end de andre behandlingsgrupper (figur 6b). Tidligere rapporter har indikeret, at reduktionen i total Trx ekspression kan skyldes dannelsen af ​​store thioredoxin blandede protein disulfid-komplekser, der er i stand til at komme ind i gelen under elektroforese [23]. Vi bekræftede dette ved at inkubere BSO + AUR-behandlede lysater med DTT at reducere blandede protein disulfider inden analyse for reduceret og oxideret TRX1. Vi fandt, at DTT lykkedes at reducere den oxiderede TRX1 dannet af BSO + AUR og genoprette niveauerne af reduceret TRX1 til nær kontrolniveauer i både FaDu og Cal-27 celler (Figur 6B) tyder på, at blandede protein disulfider blev dannet som reaktion på BSO + AUR. Endelig blev ændringer i aktiviteten af ​​andre GSH og Trx beslægtede enzymer, såsom glutathion reduktase (GR), glutathionperoxidase (GPX) og peroxiredoxin (Prx) som respons på BSO og AUR undersøgt i FaDu og Cal-27-celler. Der var ingen signifikante ændringer i GR (figur 7A) eller GPX (Figur 7B) som svar på BSO + AUR i enten cellelinie sammenlignet med kontrollen. PRX aktivitet var signifikant forøget i BSO-behandlede Cal-27 celler, men blev signifikant undertrykt i AUR og BSO + AUR-behandlede FaDu og Cal-27-celler (Figur 7C). Disse resultater antyder, at BSO + AUR induceret oxidativt stress via øget GSH og Trx oxidation i HNSCC celler

A, B:. Blev FaDu og Cal-27-celler behandlet med 0,5 pM AUR og /eller 1 mM BSO i 24 timer, derefter analyseret for procent glutathiondisulfid (% GSSG, (A)) og thioredoxin redox-status (B). Dithiotrietol (DTT, 2 mM) eller 2 mM H

2O blev tilføjet

2 i 15 min for at styre lysater som positive kontroller for reduceret og oxideret thioredoxin henholdsvis (B). *, P 0,05 versus kontrol (CON); ¥, s 0,05 versus BSO eller AUR

A-C:. FaDu og Cal-27-celler blev behandlet med 0,5 pM AUR og /eller 1 mM BSO i 24 timer, derefter analyseret for glutathionreduktase (GR) aktivitet (A), glutathionperoxidase (GPX) aktivitet (B), og peroxiredoxin aktivitet (C). Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P. 0,05 versus kontrol

BSO + AUR-induceret cytotoksicitet inhiberes af antioxidanter

For yderligere at analysere den rolle, oxidativt stress i BSO + AUR-induceret celle drab, FaDu og Cal-27-celler blev forbehandlet med 20 mM NAC (en thiol antioxidant) i 1 time før og under BSO + AUR behandling, analyseres derefter for klonogene overlevelse. NAC var i stand til helt at vende cytotoxicty induceret af BSO + AUR i FaDu og Cal-27 celler, hvilket antyder, at hæmning af BSO + AUR inducerer oxidativt stress via forstyrrelser i thiol metabolisme (figur 8A). For at bekræfte, at H

2O

2 var involveret i BSO + AUR-induceret cytotoksicitet, blev FaDu og Cal-27 celler forbehandlet i 1 time med 1000 U /ml pegyleret katalase (CAT), før behandling med BSO + AUR. CAT vendte markant BSO + AUR-induceret cytotoksicitet i FaDu celler, men ikke Cal-27-celler (figur 8A). Analyse af CAT-aktivitet i BSO + AUR versus CAT + BSO + AUR-behandlede celler viste, at behandling med CAT ikke øgede CAT-aktivitet i Cal-27 celler sammenlignet med FaDu celler (Figur 8B), hvilket tyder på, at CAT kan have ikke tilstrækkeligt indtastet cellerne. Desuden Cal-27 celler besad en markant højere CAT aktivitet sammenlignet med FaDu celler (Figur 8B). Samlet set resultaterne i figurerne 6, 7 og 8 understøtter hypotesen om, at H

2O

2 inducerede disrutions i thiol stofskifte fører til oxidativt stress er involveret i cellen drab fremkaldt af BSO + AUR i humane HNSCC celler.

A: FaDu og Cal-27-celler blev behandlet med 20 mM NAC eller 1.000 U /ml pegyleret katalase (CAT) i 1 time før og under 24 h behandling med 0,5 pM AUR og /eller 1 mM BSO. Lægemiddelbehandlede celler blev målt for cellelevedygtighed. Alle behandlinger blev normaliseret til kontrol. B: BSO + AUR og CAT + BSO + AUR-behandlede FaDu og Cal-27 celler blev analyseret for CAT-aktivitet. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus kontrol; ¥, s 0,05 versus BSO + AUR; **, P. 0,05 versus respektive behandling i FaDu celler

BSO + AUR undertrykte Cal-27 tumorvækst

in vivo

aktiviteten af ​​BSO og AUR i Cal-27 tumorbærende athymiske nøgne mus blev undersøgt. Resultaterne viste, at mus behandlet med 400 mg /kg BSO i kombination med 1 mg /kg AUR i.p. dagligt i 10 dage, viste en undertrykkelse af tumorvækst i forhold til kontrol og BSO-behandlede tumorer (Figur 9A) uden nogen bivirkninger på kropsvægt (Figur 9B) bekræfter de resultater, set

in vitro

. Selv viste BSO + AUR-behandlede tumorer en tendens til lavere vækst i forhold til AUR-behandlede tumorer, var denne forskel ikke nå signifikans (figur 9A)

A, B:. Athymiske (nu /nu) mus, der bærer Cal-27 xenotransplantattumorer blev behandlet begynder ved en gennemsnitlig tumor volumen på 0,025 cm

3 med 450 mg /kg BSO ip og /eller 1 mg /kg AUR i.p. dagligt i 10 dage. Kontrolmus modtog 10% ethanol i saltvand i.p. dagligt i 10 dage. Tumorvolumen (A) og kropsvægt (B) blev målt på dag 1, 3, 5, 8, 10 og 12 i behandlingen. Datapunkter repræsenterer middelværdierne for 10 mus. B: Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM) af N = 3 eksperimenter. *, P. 0,05 versus CON

BSO + AUR sensibiliserede HNSCC celler til Erlotinib

I betragtning af at resistens over for kemoterapi agenter, såsom EGFR-hæmmere, er en væsentlig begrænsning i HNSCC behandling [33], bestemte vi, hvis BSO + AUR ville bevidstgøre sammenflydende HNSCC celler til EGFR inhibitor Erlotinib. Vi fandt, at BSO og AUR når de anvendes alene var ikke i stand til at sensibilisere cellerne til Erlotinib (10 uM, 24 timer (figur 10)). Imidlertid BSO + AUR signifikant sensibiliserede alle testede til Erlotinib (figur 10) cellelinier antyder, at BSO + AUR skal anvendes i kombination med EGFR inhibitorer at opnå maksimal kemo-sensibilisering.

Konfluente FaDu, Cal-27, SCC-25 og SQ20B-celler blev behandlet med 1 mM BSO og eller 0,5 uM AUR i kombination med 10 pM Erlotinib (ERL) i 24 timer. Klonogene celle overlevelsesdata blev normaliseret til at styre (CON) celler. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM) N = 3 eksperimenter. *, P 0,05 versus CON; ¥, s 0,05 versus CON, BSO og AUR; £, p 0,05 versus ERL; §, s. 0,05 versus alle andre behandlingsgrupper

Diskussion

Øget GSH og Trx stofskiftet har været kendt i årevis for at være korreleret med høj tumor aggressivitet og resistens mod kemoterapi [4 ] – [7]. Som et resultat af denne viden, har inhibering af GSH eller Trx i forbindelse med kemoterapi blevet grundigt udforsket, men er meget cellelinie specifikke og har givet skuffende resultater, hvilket kan skyldes at de overlappende og redundante antioxidant funktioner GSH og Trx systemer [17 ] – [20]. Faktisk har vores tidligere undersøgelser vist, at evnen hos BSO eller AUR at sensibilisere HNSCC celler til Akt inhibitorer var stærkt cellelinje specifik [16].