PLoS ONE: terpinen-4-ol: A Novel og lovende terapeutisk middel til menneskelig Mave Kræft

abstrakt

Baggrund

terpinen-4-ol, et naturligt forekommende monoterpen er den vigtigste bioaktive bestanddel af tea-tree olie og har vist sig at have mange biologiske aktiviteter.

Sigt

for at studere antitumor virkninger af terpinen-4-ol og dens virkningsmekanisme i prostata og GI maligniteter, alene og i kombination med kemoterapeutiske og biologiske midler.

Metoder

terpinen-4-ol blev administreret alene eller kombineret med standard kemoterapi (Oxaliplatin, fluorouracil, gemcitabin, Tarceva) og biologisk middel (Cetuximab). Det blev også kombineret med humaniseret anti-CD24 mAbs (blev udviklet af os). Killing virkninger blev målt kvalitativt ved lysmikroskopi og kvantitativt under anvendelse af MTT og FACS-analyse, efter behandling af colorektale, pancreas, gastriske og prostatacancerceller. Terpinen-4-ol virkning på tumorudvikling blev vurderet i xenograft model.

Resultater

terpinen-4-ol inducerer en signifikant vækstinhibering af colorektal, pancreas-, prostata- og mavecancer celler i en dosisafhængig måde (10-90% i 0,005-0,1%). Terpinen-4-ol og forskellige anticancer-midler (0,2 uM oxaliplatin og 0,5 pM fluorouracil) demonstrerede en synergistisk hæmmende virkning (83% og 91%, henholdsvis) på cancercelleproliferation. I

KRAS

muterede colorektale cancerceller, som er resistente over for anti-EGFR terapi, der kombinerer af terpinen-4-ol med cetuximab (1 uM) resulterede i imponerende effektivitet på 80-90% vækstinhibering. Sub-toksiske koncentrationer af terpinen-4-ol potensere anti-CD24 mAb (150 ug /ml) -induceret vækstinhibering (90%). Betydelig reduktion i tumorvolumen blev set efter terpinen-4-ol (0,2%) behandling alene og med cetuximab (10 mg /kg) (40% og 63%, henholdsvis) som sammenlignes med kontrolgruppen.

Konklusion

terpinen-4-ol forøger signifikant virkningen af ​​flere kemoterapeutiske og biologiske agenser. Den mulige molekylære mekanisme for dets aktivitet indebærer induktion af celledød rendering denne forbindelse som en potentiel anti-cancer lægemiddel alene og i kombination i behandlingen af ​​talrige maligniteter. Terpinen-4-ol gendanner aktiviteten af ​​cetuximab i kræft med muteret KRAS

Henvisning:. Shapira S, Pleban S, Kazanov D, Tirosh P, Arber N (2016) terpinen-4-ol: A Novel og lovende terapeutisk middel til humane mave kræftformer. PLoS ONE 11 (6): e0156540. doi: 10,1371 /journal.pone.0156540

Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Februar 26, 2016 Accepteret: 16 maj 2016; Udgivet: 8 jun 2016

Copyright: © 2016 Shapira et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. EMERALD BIO-LABS LTD ydet støtte i form af lønninger til forfatterne SP PT, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling af data og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser: EMERALD BIO-LABS LTD ydet støtte i form af lønninger til forfatterne SP . PT, men det ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer

Forkortelser:. CRC, Tyktarmskræft; DMSO, dimethylsulfoxid; EGFR, epidermal vækstfaktor receptor; FACS, fluorescens-aktiveret cellesortering; Luc luciferase

Introduktion

æteriske olier og deres komponenter udvundet af vegetabilske materialer har vist sig at udvise anti-mikrobielle, anti-virus, anti-svampe, anti-oxidant, anti-inflammatoriske og anti-cancer aktiviteter [1-3].

Monoterpener er store plante-afledte sekundære metabolitter almindeligt findes i naturlige produkter, herunder frugt, grøntsager og urter og kendt for at være forbundet med anlægget forsvarsmekanismer. De monoterpenerne består af to isopren enheder, og findes i store mængder i æteriske olier [4,5]. Desuden er der blevet foreslået mange monoterpener at udøve potent anticancer aktivitet. Nogle af dem angiveligt vist lovende resultater i forebyggelse og behandling af forskellige typer af leukæmi og cancere, såsom bryst, hud, pancreas og tyktarmskræft hos gnavere [6]. Især flere af disse forbindelser, blandt dem perillylalkohol og limonen, er ved at blive afprøvning i igangværende humane undersøgelser [7-9].

terpinen-4-ol, en af ​​de primære aktive ingredienser i tea tree olie , består af en blanding af mere end 100 forskellige forbindelser, og findes i en række forskellige aromatiske planter (appelsiner, mandariner, Origanum, New Zealand lemonwood træ, Japansk cedarand sort peber) [10]. Terpinen-4-ol er et potent baktericidt middel [11], der besidder svampedræbende egenskaber [12]. Af særlig interesse er dens

in vitro

aktivitet mod

Staphylococcus aureus

C

.

albicans

[13,14]. Det blev vist, at kombinere denne naturlige stof og konventionelle lægemidler kan hjælpe med at behandle resistente gær og bakterielle infektioner.

Adskillige nylige rapporter har antydet, at terpinen-4-ol inducerer antitumorvirkninger ved selektivt at forårsage nekrotisk celledød og celle-cyklus standsning i melanomcellelinier, eller ved at udløse caspase-afhængig apoptose i humane melanomceller, især i lægemiddel (Adriamycin) resistente celler [15,16]. Desuden blev terpinen-4-ol vist sig at fremkalde en dosisafhængig cytotoksisk reaktion på humane ikke-småcellet lungekræft celler, formentlig gennem inddragelse af mitokondrie apoptosecyklus [17].

CD24 er et lille , stærkt glycosyleret mucin-lignende celleoverfladeprotein forankret til membranen via glycosyl phosphatidylinositol (GPI) [18]. CD24 er kendt for at være overudtrykt i forskellige humane maligniteter, både fast og hæmatologiske [19], og er normalt bundet med en mere aggressiv forløb af sygdommen [18,20,21]. Vi har vist, at anti-CD24-baserede kræft immunterapi har potentiale klinisk anvendelse i solide tumorer [21-23]. Derfor blev kombinationen af ​​terpinen-4-ol sammen med anti-CD24-terapi evalueret i dette arbejde.

I denne undersøgelse var det et mål at vise anticancer effekter af terpinen-4-ol i forskellige former for kræft celler

in vitro

in vivo

. Det er også vist, at terpinen-4-ol kan gendanne styrken af ​​cetuximab i tumorer med en mutant RAS.

Materialer og metoder

Materialer

Alle reagenser blev købt fra Sigma, Israel medmindre andet er angivet. Cellekulturmedier og tilsætningsstoffer blev opnået fra Beit-Haemek, Israel. Annexin V og propidiumiodid blev købt fra Biotium

Følgende materialer blev testet:.

terpinen-4-ol

Blanding 1 = γ-terpinen, α-terpinen, 1,8-cineole, p-cymen, terpinen-4-ol

Blanding 2 = γ-terpinen, α-terpinen, 1,8-cineole, p-cymen,

forholdet mellem hver forbindelse er beskrevet i tabel 1.

følgende kemoterapi narkotika og antistoffer blev testet:

Eloxatin

® (Oxaliplatin) ved en koncentration på mellem 0,2 -0,5 uM

5-FU (fluoruracil) -.. 0,3-0,5 uM

GEMZAR (Gemcitabin) – 0,1-1 uM

Tarceva (0,05-0,1 uM) .

Erbitux (Cetuximab) ved et koncentrationsinterval på 1 uM.

humaniseret anti-CD24 mAb (humaniseret IgG1 antistof, som binder til celleoverfladen CD24 protein) i koncentrationer på 75-150 ug /ml.

Cellelinjer

Menneskelig CRC (HT29, HCT116, COLO320), gastrisk karcinom (AGS), bugspytkirtlen (COLO357, Panc-1, MIA-PACA) cellelinjer blev dyrket i høj-glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 5% varmeinaktiveret (HI) føtalt bovint serum (FBS), 1% glutamin og streptomycin /penicillin. En androgen-uafhængig prostatacancer (DU145, CL-1), og colorektale DLD1 cancerceller blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 5% HI-FBS. Salg

MTT celleviabilitetstest

Celler blev podet i plader med 96 brønde (1×10

4 celler /brønd) i komplet medium. Den følgende dag blev forskellige koncentrationer af de ovenfor beskrevne midler til cellerne i triplikater. Efter 72 timer senere blev mediet erstattet med frisk medium (100 pi per brønd) indeholdende 1 mg /ml 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) og inkuberet i 2 -4 h. MTT-formazan krystaller blev opløst ved tilsætning af 100 pi ekstraktionspuffer. Absorbans ved 570 nm og en referencebølgelængde på 690 nm blev registreret på en automatiseret mikropladelæser. Det relative antal levedygtige celler blev sammenlignet med ubehandlede celler.

Transfektion og luciferase assay

Transfektioner blev udført under anvendelse jetPEI

™ (POLYPLUS-transfektion Inc, NY, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. 5 x 10

5HCT116 celler blev podet i 6-brønds plader til Luc assays. Den næste dag, når cellerne var ca. 50% sammenflydende, co-transfektion med 3 ug PY4-SV40-LUC vektor plus 0,3 ng pRL-CMV (Promega) blev udført. 24 timer efter transfektionen blev mediet udskiftet, og cellerne blev udsat for cetuximab, forskellige koncentrationer af terpinen-4-ol eller venstre ubehandlet. Luc assayet blev udført 48 timer efter efter behandlingen. Kort fortalt blev cellerne vasket en gang med PBS og derefter lyseret i 250 ~ pi lysepuffer i 5 minutter ved stuetemperatur. Lysaterne blev centrifugeret ved 14.000 rpm i 5 minutter, og 20 pi af hvert lysat blev anvendt til måling Luc reportergenekspression. Den Luc aktivitet blev normaliseret til Renilla Luc aktivitet fra en parallel co-transfektion af pRL-CMVDual Luc-system, Promega).

Påvisning af celledød

Celler blev podet i 12-brønds plader ( 1×10

5 celler /brønd) i komplet medium og behandlet med terpinen-4-ol i flere koncentrationer i 72 timer. Annexin V blev påvist ifølge fabrikantens protokol. Cellerne blev vasket med PBS og derefter inkuberet i en opløsning af membranen-impermeable nuklear farvestof propidiumiodid. Cellerne blev derefter straks analyseret ved flowcytometri [FACSCalibur (Becton Dickinson, CA)], og resultaterne blev analyseret med CellQuest program (Becton Dickinson).

xenograftmodel til måling

in vivo

antitumoraktiviteten af ​​terpinen-4-ol alene og i kombination med biologiske midler

Male athymiske nøgne mus, 6-8 uger gamle, (Harlan Laboratories) blev holdt i sterile bure og håndteres med aseptiske forholdsregler. De blev fodret ad libitum. Til afprøvning af terapeutiske potentiale terpinen-4-ol, blev eksponentielt voksende kræftceller høstet og resuspenderet ved en slutkoncentration på 5×10

6 celler pr 0,1 ml PBS per injektion. Cellerne blev injiceret subkutant i flanken af ​​musene. Når tumorer var palpable (~ 0,3 cm

3), blev musene tilfældigt inddelt i grupper og behandlingen blev påbegyndt (intraperitoneal og /eller intratumorale injektioner). Dyrene blev behandlet to gange om ugen i 3 uger. De blev vejet og tumorvolumen blev målt med en passer og plottet hver 3 dage startende fra starten af ​​behandlingen. Tumor volumen blev beregnet som 4 /3π ∙ en ∙ b

2. Ved afslutningen af ​​eksperimentet, blev musene bedøvet og aflivet ved cervikal dislokation, og tumorerne blev skåret ud.

Statistik Salg

Data fra

in vitro Salg undersøgelser præsenteres som middelværdi ± SD af datasæt som bestemt i triplikater. Statistisk signifikans mellem behandlingerne blev bestemt ved t-test, og

P

værdier 0,05 blev betragtet som signifikante. I

I

vivo studier, tumor-bærende mus blev randomiseret i 5 behandlingsgrupper og tumor volumen blev periodisk overvåget og beregnet som 4 /3π ∙ en ∙ b

2. Signifikante forskelle mellem grupper og på forskellige tidspunkter blev bestemt ved t-test.

Study godkendelse

Undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle udvalg for dyrevelfærd ved Tel-Aviv Sourasky Medical Center.

Resultater

Identifikation af terpinen-4-ol som den effektive ingrediens

To blandinger med forskellige monoterpens sammensætning blev testet (tabel 1). Blanding 1 var signifikant mere effektiv og giftige end blanding 2 (

P. 0

005

). Den væsentligste forskel mellem de to var terpinen-4-ol. Resultaterne (Fig 1A) indiceret til betydelige forskelle i celle overlevelse mellem blandingerne, tillader os at identificere terpinen-4-ol og dens bidrag til den cytotoksiske effekt.

A. Identifikation og isolering af terpinen-4-ol. To blandinger (deres sammensætning er beskrevet i tabel 1) af monoterpens blev testet på kolorektal (HCT116, DLD1, COLO320), gastrisk (AGS), pancreas (PANC-1, COLO357, MIA-PACA) og prostata (CL-1, DU145 ) cancercellelinjer. 1×10

4-celler blev podet i plader med 96 brønde i komplet medium. 0,05% af blandingerne blev tilsat til cellerne på den næste dag. Celleoverlevelse blev evalueret ved enzymatisk MTT assay72 timer efter behandlingen. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af et sæt data bestemt i tredobbelte. *

P

.

05

, **

P

.

005

. B. terpinen-4-ol aktivitet ikke afhænger af tilstedeværelsen af ​​DMSO. 1×10

4CRC blev gastrisk, pancreas- og prostatacancerceller podet i plader med 96 brønde i komplet medium.0.05% af terpinen-4-ol med eller uden 0,01% DMSO blev tilsat til cellerne på den næste dag. Celleoverlevelse blev evalueret ved enzymatisk MTT assay72 timer efter behandlingen. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af et sæt data bestemt i tredobbelte. *

P

.

05

, **

P

.

005

.

Ingen effekt af DMSO på aktiviteten af ​​terpinen-4-ol

En af de forhindringer, der er stødt på ved brug af cytotoksiske forbindelser som terapeutisk midler er deres lave opløselighed i farmaceutisk løsninger og deres ringe evne til at trænge ind i celler. For så vidt, vi undersøgte, om terpinen-4-ol vil være aktiv i fraværet af dimethylsulfoxid (DMSO). DMSO blev anvendt til at opløse terpinen-4-ol og dens virkning blev evalueret. Det fremgik, at den cytotoksiske aktivitet af terpinen-4-ol ikke blev hæmmet ved tilsætning af DMSO (Fig 1B). Adskillige koncentrationer af terpinen-4-ol (0,005% -0.1%) med og uden DMSO blev testet (data ikke vist) og forskellen i effekten af ​​DMSO blev observeret hovedsagelig ved højere doser af terpinen-4-ol. DMSO syntes forstyrre eller hæmme den biologiske effekt af terpinen-4-ol, måske ved at hindre absorption af dette biologisk aktive molekyle.

terpinen-4-ol som et anti-cancer middel

terpinen -4-ol inhiberede væksten af ​​colorektal (fig 2A), pancreas (fig 2B), gastrisk (fig 2C) og prostata (fig 2D) cancere i en dosisafhængig måde [10% (i 0,005%) – 90 (i 0,1%) vækstinhibering)], som målt kvalitativt ved mikroskopiske observationer (data ikke vist) og kvantitativt ved den enzymatiske MTT-assayet (figur 2).

1×10

4 HCT116, DLD1, HT29 og Colo320 CRC (A), blev MIA-PACA, Colo357 og Panc-1 pancreatisk (B), AGS gastrisk (C), og DU145 og CL-1 prostatacancerceller (D) podet i plader med 96 brønde i komplet medium. Adskillige koncentrationer af terpinen-4-ol [0,005%, 0,01%, 0,05 og 0,1% (vol /vol)] blev tilsat til cellerne på den næste dag. Celleoverlevelse blev evalueret ved enzymatisk MTT assay 72 timer efter behandlingen. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af et sæt data bestemt i tredobbelte. *

P

.

05

, **

P

.

005

terpinen-4-ol inducerer apoptose og ikke nekrose

Lave koncentrationer af terpinen-4-ol (0,005-0,01%) hæmmede HCT116 celle proliferation på en beskeden måde (20-30%) som målt ved MTT levedygtighedsassayet. Høje koncentrationer (0,05-0,1%), inducerede massiv celledød (75-90%). Som det kan ses i figur 3, apoptose er celledød mekanisme ansvarlig for den cytotoksiske virkning induceret af terpinen-4-ol. Tidlig apoptotisk død blev induceret ved lav dosis af terpinen-4-ol, mens procentsatserne for sent apoptose steg ved højere koncentrationer. Ingen nekrotiske celler blev observeret.

1×10

5 HCT116-celler blev podet i plader med 12 brønde i komplet medium og udsat for forskellige koncentrationer af terpinen-4-ol i 72 timer. Celledød blev målt ved FACS efter farvning med Annexin V og PI farvestoffer. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af et sæt data bestemt i tredobbelte. *

P

.

05

, **

P

.

005

Forbedring af terpinen-4-ol effekt

terpinen-4-ol blev kombineret med forskellige typer af konventionel kemoterapi, afhængigt af typen af cancer, der behandles. For CRC terapi, blev terpinen-4-ol kombineret med oxaliplatin (Fig 4A) og 5-FU (fig 4B). En imponerende synergistisk vækstinhibering virkning blev opnået (83% og 91%, for oxaliplatin og 5-FU, henholdsvis) i den kombinerede regime sammenlignet med hvert middel alene [12% (oxaliplatin), 25% (terpinen-4-ol) og 20% ​​(5-FU)]. Disse resultater har opnået statistisk signifikans,

P 0

005

.. Lignende resultater blev opnået i bugspytkirtelkræftceller (Fig 4C-4F). Terpinen-4-ol imponerende øget effektiviteten af ​​gemcitabin og af Tarceva (60-85% celledød).

1×10

4 CR DLD1 celler (A, B), og pancreas MIA-PACA ( C, D) og Panc-1 (E, F) celler blev podet i plader med 96 brønde i komplet medium. Den næste dag, oxaliplatin i en koncentration på 0,2 uM og terpinen-4-ol i en koncentration på 0,01% (A), 5-FU i en koncentration på 0.3μM og terpinen-4-ol i en koncentration på 0,01% ( B), gemcitabin ved en koncentration på 0,1 uM og terpinen-4-ol i en koncentration på 0,01%, (C) gemcitabin ved en koncentration på 0,1 uM, erlotinib hydrochlorider (Tarceva

®) ved en koncentration på 0,1 uM, og terpinen-4-ol i en koncentration på 0,01% (D), gemcitabin ved en koncentration på 1 uM og terpinen-4-ol i en koncentration på 0,01% (E), gemcitabin ved en koncentration på 1 uM, anderlotinib hydrochlorider (Tarceva

®) ved en koncentration på 0,1 uM, og terpinen-4-ol i en koncentration på 0,01% (F) blev tilsat i 72 timer. Celle overlevelse blev vurderet ved den enzymatiske MTT-assayet. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af et sæt data bestemt i tredobbelte. *

P

.

05

, **

P

.

05

Forbedret cytotoksicitet terpinen-4-ol med biologiske midler

Ved at kombinere terpinen-4-ol med enten humaniseret anti-CD24 modnet antistof (Arber s lab, Tel Aviv, Israel) eller kimære anti EGFR-antistof (Cetuximab, Merck Serono) resulterede i en bemærkelsesværdig synergistisk væksthæmning effekt (85-90%,

P. 0

005

) på human CRC (fig 5A og 5B) og prostatacancerceller (figur 5C og 5D).

1×10

4 CR DLD1 og HCT116-celler (A, B, E), og prostata CL-1 (C, D) celler blev podet i plader med 96 brønde i komplet medium. Den næste dag, terpinen-4-ol i en koncentration på 0,01% og de humaniserede anti-CD24-antistoffer (150 ug /ml) (A, C), og terpinen-4-ol i en koncentration på 0,01% og cetuximab ved en koncentration af 1 uM (B, D, E) blev tilsat i 72 timer. Celle overlevelse blev vurderet ved den enzymatiske MTT-assayet. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af et sæt data bestemt i tredobbelte. (F) 0.4X10

6 HCT116-celler blev podet i plader med 6 brønde i tre eksemplarer. Den næste dag, co-transfektion med PY4-SV40-LUC vektor og pRL-CMV blev udført. 24 timer efter transfektionen blev mediet udskiftet, og cellerne blev udsat for cetuximab, forskellige koncentrationer af terpinen-4-ol eller venstre ubehandlet. Luc assayet blev udført 48 timer efter efter behandlingen. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD af et sæt data bestemt i tredobbelte. *

P

.

05

, **

P

.

05

terpinen-4-ol genskaber følsomheden af ​​

K-ras

mutant kræftceller til ceteximub

DLD1 CRC celler bære en mutation i

KRAS

onkogen. De er derfor modstandsdygtige over for anti-epidermal vækstfaktor (EGFR) terapi. Kombinere terpinen-4-ol (0,01%) med cetuximab (1 uM) resulterede i en temmelig imponerende virkning af et 85-90% vækstinhibering. Disse resultater blev bekræftet i en anden

KRAS

muteret CRC cellelinje (HCT116) (fig 5E), med en 80% væksthæmning (

P. 0

005

) for den kombinerede terapi.

Nedsat aktivitet af

K-ras

signalvejen med terpinen-4-ol

til dette formål brugte vi (Ets /AP1)

4 RAS-responsive element (PY4) konstrukt, som vi tidligere havde fremstillet [24-26]. Aktiviteten af ​​

KRAS

vej blev evalueret i muterede CRC-celler (HCT116) (Fig 5F). Transfektion med PY4-SV40-Luc aktivitet i tilstedeværelse af terpinen-4-ol (0,005 og 0,01%) var 1,3 og 1,5 gange lavere i forhold til aktiviteten i fravær (

P. 0

05

) _. Ingen virkning blev observeret efter eksponering for cetuximab (1 uM).

Inhibering af subkutan DLD1 tumorvækst i mus ved terpinen-4-ol

Dernæst testede vi den potentielle antitumoraktivitet af terpinen-4-ol

in vivo

. Intratumorale injektioner (5 injektioner) af forbindelsen (0,1% og 1%) blev givet to gange om ugen til nøgne mus (n = 6), der bærer xenotransplantater af CRC DLD1 celler. Behandlingen blev startet, da tumorerne var 0,3-0,5 cm

3. Signifikant hæmning af tumor udvikling blev observeret; 40% og 70% reduktion i tumorvolumen og omkring 25% og 50% reduktion af tumorvægt (figur 6A). Disse resultater blev bekræftet i et andet eksperiment (figur 6B). Ingen signifikante bivirkninger blev observeret (data ikke vist).

Eksponentielt voksende DLD1 kræftceller blev høstet og resuspenderet ved en endelig koncentration på 5×10

6 celler pr 0,1 ml PBS pr injektion. Når tumorerne var palpable, blev musene tilfældigt inddelt i grupper og behandlingen blev påbegyndt [intratumorale injektioner af terpinen-4-ol (A, B) eller intratumorale injektioner af terpinen-4-ol og intraperitoneale injektioner af cetuximab (C)] . Musene blev behandlet to gange om ugen. De blev vejet og tumorvolumen blev målt med en passer hver 3. dag startende fra starten af ​​behandlingen med terpinen-4-ol. Tumorvolumen versus tid for behandling blev afbildet. Ved afslutningen af ​​eksperimentet, blev musene bedøvet og aflivet ved cervikal dislokation, og tumorerne blev udskåret og målt for volumen og vægt. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD. *

P

.

05

, **

P

.

005

Kombineret væksthæmning af subkutane tumorer i mus

Når en af ​​tumor diameter nåede på størrelse med 0,5 mm intratumorale injektioner af terpinen-4-ol (0,1%) sammen med systemisk (IP) administration af cetuximab (10 mg /kg) resulterede i et signifikant fald i tumorvolumen (62% ± 2,5%,

P. 0

05

) og vægt (62,5% ± 3%,

P. 0

05

) (fig 6C)

design af en mere effektiv formulering af terpinen-4- ol

To forskellige formuleringer af terpinen-4-ol blev evalueret

in vivo

, en nano og suspension formuleringer. Sidstnævnte opstod som værende mere effektiv og sikrere (data ikke vist). Systemisk indgivelse af suspensionen (1 og 4 mg) til mus med xenografter af CRC (HCT116) celler resulterede i en imponerende reduktion i tumorvolumen (32% ± 1,1%,

P. 0

05

og 72% ± 0,7%,

P. 0

005

henholdsvis) og vægt (26% ± 1,19 og 70% ± 0,71%,

P 0

.

005

henholdsvis) på en dosis-afhængig måde (figur 7).

Eksponentielt voksende HCT116 cancerceller blev høstet og resuspenderet ved en slutkoncentration på 5×10

6 celler pr 0,1 ml PBS pr injektion. Når tumorerne var palpable, blev mus tilfældigt opdelt i 3groups og behandling, der består af intraperitoneale injektioner af terpinen-4-ol (1 og 4 mg /kg), blev startet. Musene blev behandlet to gange om ugen. De blev vejet og tumorvolumen blev målt med en passer hver 3. dag startende fra starten af ​​behandlingen med terpinen-4-ol. Tumorvolumen versus tid for behandling blev afbildet. Ved afslutningen af ​​eksperimentet, blev musene bedøvet og aflivet ved cervikal dislokation, og tumorerne blev udskåret og målt for volumen og vægt. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD. *

P

.

05

, **

P

.

005

Diskussion

De anticancer effekter af terpinen-4-ol er imponerende i forskellige typer af kræftceller både

in vitro

og

in vivo

.

terpinen-4-ol er en vigtig bestanddel af æterisk olie stammer fra forskellige aromatiske planter. Det anvendes som et anti-inflammatorisk og antioxidant agent [27-29]. Bidraget fra terpinen-4-ol som et anti-cancer middel og de underliggende signalveje af forskellige typer celledød er ukendte. Heri er det vist, at virkningsmekanismen for terpinen-4-ol er induktion af apoptose og ikke nekrose. Det er også vist, at terpinen-4-ol og forskellige anticancer-midler udviser en synergistisk vækstinhiberende virkning ved at reducere overlevelsen af ​​forskellige cancercellelinier. Sådanne kombinationer måske forventes at være mere effektiv og mindre toksisk da lavere medikamentkoncentrationer kan anvendes til behandling af en lang række cancere.

Af note, genoprette følsomhed over for anti-EGFR behandling (f.eks Cetuximabs), i CRC tilfælde bærer

KRAS

mutation, når de gives sammen med terpinen-4-ol har en fortjeneste klinisk betydning. Det påvises ved at måle aktiviteten af ​​ras-responsiv promotor før og efter eksponering for terpinen-4-ol. Det er vist, at promotoraktiviteten blev signifikant reduceret ved udsættelse for Terpenin-4-ol. Denne interessante og vigtige observation skal bekræftes i yderligere laboratorieundersøgelser før fører til klinisk brug af terpinuin-4-ol.

Injektion af terpinen-4-ol ind i tumoren bemærkelsesværdigt hæmmet tumorvækst uden væsentlig negativ virkninger. I søgen efter mere bekvemme administrationsveje blev to farmaceutiske formuleringer forberedt og testet for systemisk administration, nano formulering og suspension. Nano-formuleringer øget overfladearealet og dermed dramatisk forbedret vandopløselighed, biotilgængelighed og effektivitet. Formen suspension blev sammensat af små dråber /molekyler af terapeutisk aktive bestanddel (olien) i et suspensionsmedium. Siden nanodrops var forbundet med alvorlig toksicitet (tab af kropsvægt, dødelighed), blev suspensionen tilgang, der var blottet for bivirkninger valgt til yderligere udforskning. Den systemiske administration af terpinen-4-ol ved suspension blev associeret med en signifikant reduktion i tumorstørrelse i de eksperimentelle nøgne mus.

Sammenfattende anvendelsen af ​​en kombination af planteafledte anticancer stoffer og kemoterapeutisk eller biologisk midler til behandling af forskellige former for kræft er lovende, med en synergistisk effekt, der tillader en lavere koncentration af kemoterapi og biologiske midler, der kan ikke kun øger effekten, men kan minimere toksicitet så godt. Vigtigst terpinen-4-ol stor fordel er evnen til at genoprette følsomheden over for EGFR-antagonister i tumorer med

Ras

mutationer.

Tak

Forfatterne er taknemmelige for Esther Eshkol, den institutionelle medicinske copyeditor, for omhyggelig redigering af vores papir.