PLoS ONE: Ets-2 Regulerer Cell Apoptose via Akt Pathway gennem forordningen af ​​urothelial Cancer Associated 1, en lang ikke-kodende RNA, i Blærekræft Cells

Abstrakt

De fleste af det humane genom er transskriberede og genererer ikke-kodning RNA (ncRNAer), der undlader at kode protein oplysninger. Lange ikke-kodning RNA (lncRNAs) dukker op som en ny klasse af ncRNAer, men vores viden om disse ncRNAer er begrænset. Tidligere har vores laboratorium identificeret, at en lncRNA, urotelial cancer associeret 1 (UCA1), spillede en vigtig rolle i blærekræft. På trods af den nylige interesse i UCA1 som en diagnostisk markør for blærekræft, vides der kun lidt om dens transkriptionel regulering. For at belyse reguleringen af ​​UCA1 genekspression, har vi karakteriseret det humane UCA1 gen promotor. Et 2,0 kb fragment af dens 5′-flankerende region blev klonet ind i en luciferase reporter vektor. Sletning og mutation analyse foreslået, at en Ets-2 bindingssted var kritisk for UCA1 gen promoter aktivitet. Yderligere analyse af dette websted ved gel skiftende, chromatin immunpræcipitation (chip), og co-transfektionsforsøg viser, at transkriptionsfaktoren Ets-2 direkte bundet til UCA1 promotorregionen og stimuleret UCA1 promotoraktivitet i blære cancerceller. Under hensyntagen til den anti-apoptose funktion af Ets-2, vores data antydede, at Ets-2 regulerer apoptose proces ved at regulere ekspressionen af ​​UCA1 øvrigt UCA1 kan være involveret i aktiveringen af ​​Akt signalvejen fra Ets-2 i blære kræftceller .

Henvisning: Wu W, Zhang S, Li X, Xue M, Cao S, Chen W (2013) Ets-2 Regulerer Cell Apoptose via Akt Pathway gennem forordningen af ​​urothelial Cancer Associated 1, en lang Ikke-Coding RNA, i Blære Cancer Cells. PLoS ONE 8 (9): e73920. doi: 10,1371 /journal.pone.0073920

Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA

Modtaget: Marts 6, 2013; Accepteret: 24 juli 2013; Udgivet 12. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af bevilling fra Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.072.104). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Eukaryote genomer er ikke de enkle, velordnet substrater af gentranskription der engang var troet. Vi ved nu, dem at omskrive et bredt spektrum af RNA-molekyler, der spænder fra lange protein-kodende mRNA’er til korte ikke-kodende transkripter, som ofte overlapper hinanden eller sammenflettes på begge strenge [1]. Lange ikke-kodende RNA’er (lncRNAs) dukker op som en ny klasse af ikke-kodende RNA’er indeholder mere end 200 nucleotider, men vores viden om disse lncRNAs er begrænset. LncRNAs er transkripterne, der ligner proteinkodende mRNA’er ved, at de er udjævnet, splejsede og polyadenyleret RNA-polymerase II transkripter. De adskiller sig fra mRNA’er kun i deres mangel på protein-kodende åbne læserammer (ORF) [2].

I modsætning til de forskellige RNA-arter, der kun et lille antal lncRNAs blev identificeret til at have eksperimentelt afledte funktioner. Desuden har dysregulering af lncRNA blevet vist i forskellige typer af kræft [3], [4], såsom MALAT-1 i lungekræft [5], HULC i hepatocellulært carcinom [6], og hotair i brystkræft [7] , hvilket indikerer, at lncRNAs kan spille en kritisk rolle ved tumorigenese eller tumorprogression.

vi har tidligere etablerede BLZ-211 og BLS-211 celler, som er et par blære overgangsperiode celle carcinom (TCC) cellelinjer klonet separat fra den samme patients prøve, men med forskellige biologiske egenskaber [8], [9], [10]. Derefter Vi rapporteret en hidtil ukendt udtrykt sekvens tag (EST) (Genbank DR159656) isoleret fra disse to cellelinier ved anvendelse af subtraktiv suppression hybridisering (SSH) teknik [11]. Baseret på dette EST, vi klonet og identificeret en ncRNA opkaldt urotelial cancer associeret 1 (UCA1) (Genbank EU334869) [12]. UCA1 tilhører lncRNAs grundet manglen på en stærk Kozak konsensussekvens for translationsinitiering i nogen af ​​ATG-kodoner ved multiple små ORF’er [12]. Mange undersøgelser antydet, at UCA1 kan fungere som en molekylær markør for blærekræft på grund af sin fremragende specificitet og følsomhed [13], [14]. En tidligere undersøgelse i vores laboratorium også underforstået, at forhøjet UCA1 udtryk kan påvirke blærekræft cellevækst og fremme invasion af blærekræft celler [12], hvilket tyder på at det ville være en roman terapeutisk target gen for blærekræft. På trods af denne interesse, er lidt kendt om

cis

reguleringsmyndigheder elementer er direkte involveret i transkriptionelle modulation af UCA1 genet i blærekræft. Desuden undersøgelsen fra vores laboratorium har vist, at der er tre splejsningsvarianter af UCA1 genet eksisterer i blæren cancerceller [12], [15]. Den forhøjede ekspression af UCA1 i blærecancer og eksistensen af ​​splejsningsvarianter indikerer kraftigt, at den transkriptionelle regulering af UCA1 genet stramt styres. Den UCA1

cis

regulering kan forme komplekse genekspression netværk, der i sidste ende drive biologiske processer, såsom celle apoptose.

I denne undersøgelse identificerede vi promotoren for det humane UCA1 gen for første gang og undersøgt reguleringen af ​​UCA1 promotoren fra Ets-2 transskription faktor. Ets-2 kan påvirke blærekræft celle apoptose ved at regulere ekspressionen af ​​UCA1. Vi fandt også lncRNA UCA1 kan være involveret i aktiveringen af ​​Akt pathway. Denne forskning vil give indsigt i de lovgivningsmæssige mekanisme UCA1 udtryk i yderligere undersøgelser.

Materialer og metoder

Promoter Forudsigelse

Tidligere var fulde længde af UCA1 cDNA og dets transskriptionsstartstedet (TSS) blev identificeret ved hjælp af SMART RACE-teknologi [12]. I denne undersøgelse blev MegaBLAST (NCBI) program anvendt til at kortlægge UCA1 genet og dets 5′-flankerende region og DNA-sekvenser blev downloadet fra GenBank (NC_000019.9). Den TSS af UCA1 genet blev markeret som en. At forudsige promotoren og formodede transkriptionsfaktorer, blev følgende nogle online software anvendes. Promotoren og TSS forudsige værktøjer omfatter FPROM program fra Softberry software (https://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom group=programs subgroup=promoter) og PromoterInspector program fra genomatix (http: //www.genomatix.de/online_help/help_gems/PromoterInspector_help.html) [16]. Den Matlnspector program fra genomatix (https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html) [17], [18] blev anvendt til transskriptionsfaktoren forudsigelse.

plasmidkonstruktioner

for at generere pGL3-UCA1-2000 plasmid blev et DNA-fragment indeholdende

cis

region i UCA1 genet fra -1800 til at +200 bp amplificeret ved PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase, TaKaRa, Dalian ). PCR-produktet blev derefter udskåret fra agarosegel og isoleres ved hjælp af agarosegel-DNA-fragment Recovery Kit (Takara, Dalian). Det oprensede DNA-fragment blev derefter indsat i pGL3-Basic luciferase udtrykkende vektor (Promega, USA) gennem

Kpnl

I og

Nhe

I sites. Andre trunkerede fragmenter blev foretaget på den ovenfor beskrevne måde. De anvendte primersæt for denne serie af produkter blev tilvejebragt i tabel 1. De amplificerede DNA-fragmenter blev indsat i pGL3-basisk vektor gennem samme restriktionsendonukleaser sites. Alle DNA konstruktioner blev sekventeret.

mutagenese

Udskiftning mutation af Ets-2-bindingssteder blev genereret af PCR-baseret mutagenese (Byotime, Kina) . Den pGL3-UCA1-1200 vektor blev anvendt som DNA-skabelonen, og Ets-2 core bindingssted (GGGAAG) blev erstattet med en

Hind

III restriktionssted (AAGCTT) (tabel 1). Mutant vektor blev navngivet som pGL3-UCA1-1200-mut. Mutationerne blev bekræftet ved restriktionsenzymfordøjelse og sekventering.

Cell Culture, transient transfektion

Menneskelig blære overgangsperiode celle carcinom (TCC) cellelinier BLZ-211 og BLS-211 blev dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA). BLZ-211 og BLS-211 cellelinjer blev oprettet af vores laboratorium i 1994. blærekræft væv var fra kirurgiske prøver af en 55-år gammel mand med diagnosen multifokal papillære overgangsordning celle carcinom (TCC) grad II. Alle proceduren blev administreret unber godkendelse af etiske komité af First Affiliated Sygehus, School of Medicine, Xian Jiaotong Universitet [8]. Celler med mere end 80% konfluens blev anvendt til transfektion.

BLZ-211-celler blev transficeret med FuGENE®HD transfektionsreagens (Roche, USA) i 24-brønds plade. Hver brønd indeholdt 2 × 10

5 celler, 0,5 pg af pGL3-UCA1 serie vektor, 0,02 gg af den interne kontrol vektor pRL-TK (Promega, USA), 1 pi FuGENE®HD, og ​​500 pi RPMI 1640 medium uden serum eller antibiotika. pGL3-basic (Promega, USA) vektoren blev transficeret som kontrol. For siRNA transfektion blev cellerne transficeret med X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent (Roche, USA) i pladen med 6 brønde. Både Ets-2 siRNA og krypterede kontrol siRNA er kommercielle produkter (Santa Cruz, USA).

luciferaseassays Salg

inden assay celler blev skyllet med phosphatbufret saltvand (PBS) ved 48 timer efter transfektion og lyseret i en passiv lysisbuffer (Promega, USA). Luciferaseaktivitet blev målt ved et luminometer (Promega, USA) ved anvendelse af Dual-Luciferase reporter assay kit (Promega, USA). Resultatet blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Rapporterede data blev repræsenteret som middelværdien fra tre uafhængige forsøg.

elektroforetiske mobilitet (EMSA)

Nuclear proteiner blev ekstraheret fra BLZ-211 celler under anvendelse proteinekstrakt nuklear kit (Byotime, Kina ). Derefter elektroforetisk mobility shift-assay blev udført ifølge EMSA Kit (Pierce, USA). Så sonder blev udarbejdet på baggrund af Ets-2 bindingssted i UCA1 gen promotoren og dens tilsvarende komplementære sekvens (5′-TGTCCTCTGGGAAGAAATGACC-3 ‘) kaldet UCA1-wt-Ets ledsaget med en mutant version (5′-TGTCCTCTGTATAGAAATGACC-3′ ) samt, opkaldt UCA1-mut-Ets. En 5’-biotin modifikation blev inkluderet i UCA1-wt-Ets sonde. For kompetitive assays, 200 ganges overskud af umærket prober og umærkede mutant prober blev inkuberet med reaktionsblandingen før tilsætning af mærkede probe.

chromatin immunoprecipitation (chip) Assay

1 × 10

7-celler blev tværbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C. Derefter blev cellerne vasket med koldt PBS, høstet ved skrabning og resuspenderet i cellelyse-buffer indeholdende proteaseinhibitorer (Roche, USA). Efter inkubation i 10 minutter på is blev cellerne sonikeret at generere ca. 200-1000 bp DNA-fragmenter, og centrifugeret i 10 min ved 4 ° C. Supernatanterne blev delt og inkuberet med enten anti-Ets-2-antistof (Santa Cruz, USA), eller IgG (Boster, Kina) som en negativ kontrol ved 4 ° C natten over med rotation, henholdsvis. Immunkomplekserne blev udfældet med laksesperm DNA /protein G-agarose (Millipore, USA) i 2 timer ved 4 ° C, derefter blev udvundet, vasket, elueret med chippen elueringspufferen og revers tværbundet ved opvarmning ved 65 ° C i 4 timer. DNA blev oprenset fra immunpræcipitering med antistof eller fra input prøver og blev analyseret ved PCR under anvendelse af primere som flankerer Ets-2-bindingsstedet i UCA1 genpromotoren (tabel 1). Chip assays blev udført in duplo.

Western Blot

Celler blev pelleteret og derpå lyseret ved RIPA puffer (Thermo Scientific, USA). Efter SDS-PAGE opløsning og membran overførsel blev målproteiner sonderet med antistof mod human Ets-2 (Santa Cruz, USA), Akt, Pakt (Cell Signaling, USA), Bax (Epitomics, USA) eller GAPDH (Abmart, Kina ) efterfulgt af inkubation med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære immunglobulin-antistoffer (Santa Cruz, USA). Endelig blev båndene visualiseret ved kemiluminescens under anvendelse af et kemiluminescensdetektion kit (Pierce, USA) og de specifikke bånd blev registreret på røntgenfilm.

Apoptose Assay

For at kvantificere apoptose blev celler farvet med Annexin V og PI hjælp Annexin V-FITC /PI Apoptose detektion kit (Keygene Biotech, Kina) ifølge producentens instruktioner. Fluorescens blev detekteret ved fluorescens mikroskop (Olympus, Japan) og flowcytometri cyan ADP 9 farve fra Beckman Coulter (Beckman Coulter Brea, CA). Flowcytometri blev udført tredobbelt og gentaget tre gange.

Statistical Analysis

Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) fra tre separate forsøg. Statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS 13.0 software. Forskelle mellem grupper blev analyseret ved hjælp af Student

t

-test.

P

. 0,05 værdi blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Kloning og Bioinformatial Analyse af UCA1 arrangøren Region

I tidligere undersøgelse, den transkriptionsstartstedet (TSS) i UCA1 blev identificeret ved 5′-RACE [12]. Den MegaBLAST program NCBI blev anvendt til bestemmelse af TSS på UCA1 genet, som var placeret på 15.939.757 position CHR19 (GRCh37 /hg19). Mærkning dette websted som en, i alt 3,0 kb DNA-sekvenser af den UCA1 5′-flankerende regulering region (-2000 BP- + 1000 bp) blev opnået fra GenBank, som blev anvendt til bioinformatiske analyse. Resultatet af FPROM program foreslog, at TSS er placeret på +135 bp og en TATA-box ved +105 bp. Analysen af ​​PromoterInspector programmet viste, at promotor-regionen er mellem -515 bp og 100 bp region. I betragtning af de tidligere 5′-RACE resultater og forudsigelse resultater, valgte vi sekvenserne fra -1800 bp til 200 bp for at følge forskningen. At evaluere UCA1 promoter aktivitet, reporter konstruktioner indeholdende en række af de 5′-flankerende sekvenser (pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900, pGL3-UCA1-600, pGL3-UCA1-350) blev målt ved luciferaseanalyse i BLZ-211 celler. Konstruktionerne pGL3-UCA1-2000, pGL3-UCA1-1200, pGL3-UCA1-900 og pGL3-UCA1-600 vises forskellige promotoraktivitet. Den pGL3-UAC1-1200 gav den stærkeste promotoraktivitet i disse konstruktioner. Især når DNA-fragmentet mellem -400 bp og -150 bp blev slettet, promotoraktiviteten næsten elimineret (Fig. 1A), hvilket antyder eksistensen af ​​en kritisk positiv regulatorisk element i denne region. Disse sletning forsøg antyder, at UCA1 promotoraktiviteten detekteret i BLZ-211-celler er for det meste tilskrives den positive regulatoriske element mellem -400 bp og -150 bp af promotorregionen. Der var mange transskription faktor (TF) -bindende websteder i denne region forudsagt af bioinformatik programmet Matlnspector, herunder formodede Ets-2, C /EBP, SP-1, c-Myb,

et, al

. (Fig. 1B). Ud fra disse transkriptionsfaktorer, valgte vi Ets-2 som den potentielle TF på grund af sin højeste forudsigelse score.

(A) Luciferase assay. Fem afkortede DNA-fragmenter af den UCA1 promotorregionen i pGL3-vektorer, en negativ kontrol vektor, pGL3 basisk, og positiv vektor kontrol blev pGL3-kontrol, transficeret ind BLZ-211 celler. Luciferaseaktiviteter blev målt ved 48 timer efter transfektion. Værdier repræsenterer middel ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. *

P

0,05. (B) transkriptionsfaktorer forudsigelse ved hjælp Matlnspector software. Transkriptionsfaktorer med høj forudsigelse score var til stede.

Ets-2-bindende steder Bidrage til arrangøren Activation

For at undersøge om Ets-2 er kritisk for UCA1 promotor-aktivitet, erstattet vi ETS-2 bindingssteder til

Hind

III restriktionsendonukleasesteder i pGL3-UCA1-1200-mut. Sammenlignet med reporter luciferaseaktivitet af vildtype pGL3-UCA1-1200, den pGL3-UCA1-1200-mut gav en meget lavere promotoraktivitet i BLZ-211-celler (fig. 2A), hvilket viser, at disse Ets-2 bindingssteder rent faktisk spillet en væsentlig rolle i reguleringen af ​​UCA1 promotor-aktivitet. At bekræfte, om transkriptionsfaktor Ets-2 kan binde til denne region, blev kerneekstrakt fra BLZ-211-celler fremstillet og EMSA blev udført. De 22 bp oligonukleotider fra -378 til -357 nt indeholdende Ets-2 bindingssteder blev anvendt som vildtype-proben og samme region med muterede bindingssteder blev anvendt som mutanten probe (fig. 2B). Som vist i fig. 2B, en fremtrædende DNA-protein-kompleks blev dannet med vildtype-probe. Bindingen blev konkurreret fra ved en 200 ganges overskud af umærket vildtype-probe, men ikke af et 200 fold overskud af umærket mutant-probe. Resultaterne indikerede, at denne region var ansvarlig for DNA-protein-kompleks-dannelse. For yderligere at undersøge, om Ets-2 kan binde direkte til den proximale UCA1 promotoren

in vivo

blev ChIP udført under anvendelse antistof mod Ets-2 til at immunpræcipitere formaldehyd-fikseret kromatin fra BLZ-211 celler. Som vist i fig. 2C, fremtrædende PCR-produkter, der indeholder de Ets-2 bindingssteder blev påvist ved hjælp af DNA trækkes ned af antistof mod Ets-2, mens der ikke forstærkning blev observeret i DNA immunudfældet af IgG, som viser, at Ets-2 direkte kan binde til UCA1 promotoren i BLZ-211 celler.

(A) Luciferase assay. ETS-2 bindingssteder (GGGAAG) blev erstattet med

Hind

III sites (AAGCTT) ved site-directed mutagenese (øverste panel). Relative luciferaseaktiviteter af vildtype (wt) og mutante vektorer (mutant) blev målt ved luciferase assay. Værdier repræsenterer middel ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. *

P

0,05. (B)

In vitro

detektion af Ets-2 transkriptionsfaktor binding til promotorregionen af ​​UCA1 genet af EMSA-assay. Et dominerende bånd blev observeret, når biotin-mærket Ets-2 probe blev inkuberet med det kerneekstrakt (bane 2). Ets-2 binding kunne ikke hæmmes af mutant-probe (bane 3), mens det blev konkurrerede med umærket kold probe (bane 4). (C)

In vivo

påvisning af Ets-2 transkriptionsfaktor binding til promotorregionen af ​​UCA1 genpromotoren af ​​Chip assay. Input chromatin (input), som repræsenterede dele af sonikeret kromatin før immunfældning, blev anvendt som en positiv kontrol. IgG-antistof blev anvendt som en negtive kontrol chip-analysen.

Ets-2 er afgørende for Transskription Regulering af UCA1

For at bestemme om transkriptionsfaktor Ets-2 kunne regulere UCA1 udtryk , semi-kvantitativ RT-PCR blev udført efter banker ned Ets-2 ved specifik siRNA i BLZ-211 celler. PCR Resultaterne viste, at UCA1 mRNA ekspression blev reduceret med omkring 50% efter dæmpningen af ​​Ets-2-ekspression (fig. 3A). Som de luciferase analyseresultaterne vist, når vi co-transficeret ETS-2 specifikke siRNA eller scrambled kontrol siRNA med pGL3-UCA1-1200 i BLZ-211 celler, knockdown af Ets-2 forårsagede nedsat aktivitet af UCA1 promotor i sammenligning med scrambled kontrol siRNA gruppe (fig. 3B). Disse resultater indikerede, at Ets-2 kan regulere ekspressionen af ​​UCA1 ved at påvirke aktiviteten af ​​UCA1 promotoren.

(A) Ekspression af Ets-2 og UCA1 blev målt ved RT-PCR efter Ets-2-specifikt siRNA eller scrambled siRNA behandling i BLZ-211 celler. 18 S rRNA blev anvendt som en intern kontrol. (B) Luciferase assay. Ets-2-specifikt siRNA eller krypteret kontrol siRNA blev co-transficeret med pGL3-UCA1-1200 ind BLZ-211 celler. Værdier repræsenterer middel ± SD af mindst tre uafhængige forsøg. *

P

0,05. NSC: ikke-specifik kontrol siRNA

UCA1 kan være involveret i apoptose induceret af Ets-2 Knockdown i BLZ-211 Celler

rolle Ets-2 i blærekræft. er uklart, hvilket vi bekræftet funktionelle konsekvens af Ets-2 knockdown i blæren kræftceller. En stigning niveau af apoptose blev observeret efter en 48 timers behandling med Ets-2 siRNAs i BLZ-211 celler via fluorescensmikroskop. Resultaterne af celleapoptose assays viste øget niveau af apoptose i BLZ-211 celler, når celler blev behandlet med Ets-2-specifikt siRNA i forhold til den krypterede kontrol siRNA behandling (fig. 4A). For at kontrollere, om Ets-2 induceret UCA1 genekspression var involveret i apoptose vi studerede en anden blære TCC cellelinje, kaldet BLS-211. BLS-211 er manglende endogen UCA1 ekspression og er afledt fra den samme patient som BLZ-211 cellelinje. Interessant, efter at vælte den Ets-2-genet, vi ikke observeret efterfølgende apoptose i BLS-211 celler (fig. S1). Desuden har vi tælles de apoptotiske celler ved anvendelse af flowcytometri i begge cellelinier separat. I overensstemmelse med fluorescensmikroskop resultater, er flowcytometri resultater afslørede en signifikant stigning i celle pro-apoptose (øverste højre kvadrant) efter Ets-2 knockdown i BLZ-211 celler (12,49 ± 1,21%

vs.

6.40 ± 1,47%), mens der blev observeret nogen forøgelse af pro-apoptose efter Ets-2 knockdown i BLS-211 celler (4,12 ± 0,28%

vs.

3,20 ± 2,50%) (fig. 4B). Disse resultater antydede, at UCA1 kan være involveret i cellen apoptose induceret af undertrykkelsen af ​​Ets-2.

(A) induktion af apoptose efter en 48-timers behandling af Ets-2 siRNA eller scrambled kontrol siRNAs i BLZ-211-celler blev undersøgt ved anvendelse af et fluorescensmikroskop. Celler blev farvet med Annexin V (grøn) og PI (Red). Scale bar 25 pm. Billederne var repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) Apoptose blev kvantificeret ved flowcytometri (FCM). FCM Resultaterne var repræsentative for tre uafhængige forsøg. Cellular pro-apoptose processer (øverste højre kvadrant) blev forøget efter Ets-2 knockdown i BLZ-211 celler (12,49 ± 1,21% vs. 6,40 ± 1,47%, *

P

0,05), mens ingen signifikant ændring i BLS-211 celler (4,12 ± 0,28% vs. 3,20 ± 2,50%,

P

0,05). NSC:. Ikke-specifik kontrol siRNA

UCA1 kan deltage i Inaktivering af Akt Pathway i Cell apoptose induceret af Ets-2 Nedregulering

For at afgøre, om undertrykkelse af Ets -2 inducere apoptose i blæren cancerceller via Akt pathway, en privotal apoptose regulator pathway, undersøgte vi proteinet ekspressionsniveauet af total Akt og phosphoryleret Akt (Pakt). Interessant, viste de vestlige blotting resultater, efter tavshed Ets-2, Pakt udtryk efterfølgende blev reduceret, mens ekspressionen af ​​proapoptotiske protein Bax blev forøget (fig. 5, venstre panel). Vores resultater indebar, at Ets-2 knockdown i stand til at inducere apoptose i BLZ-211 celler via inaktivering af Akt vej og ført til ændringer i de nedstrøms target molekyler. vi antog derfor, at UCA1 genekspression kan være forbundet med aktiveringen af ​​Akt pathway, som er involveret i Ets-2 medieret anti-apoptose proces i blæren kræftceller. For at løse dette koncept, vi næste undersøgt proteinet ekspressionsniveauet af Akt, Pakt og Bax i BLS-211 celler. Som vist var ingen mærkbar forskel mellem Ets-2 siRNA behandlede gruppe og krypterede siRNA behandlede gruppe (fig. 5, højre panel). Vores resultater antydede, at nedregulering af Ets-2, en transskriptionsfaktor af UCA1 genet, kan inducere apoptose i BLZ-211-celler ved at nedsætte UCA1 ekspression og dette kan bidrage til inaktivering af Akt pathway (fig. 6).

Ets-2 og apoptose relaterede proteiner blev detekteret ved Western blot. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. NSC:.. Ikke-specifik kontrol siRNA

stiplet linje fra UCA1 til Akt viser, at sammenhængen mellem UCA1 og Akt kan være indirekte

Diskussion

Blærekræft er en af ​​de mest almindelige ondartede sygdomme i Kina, ranking som den første hyppige neoplasme af urinvejene. Vi har tidligere vist, at UCA1 kan fremme cellevækst og invasion i blærekræft [12]. UCA1 er en lncRNA, da det har flere små ORF selvom ingen stærke Kozak-konsensussekvenser blev fundet i nogen af ​​ATG codoner [12], [13]. Adskillige lncRNAs er blevet identificeret som er knyttet til sygdomme hos mennesker og har specifikke funktioner i forbindelse med humane sygdomme [19]. Tidligere viste vi den rumlige og tidsmæssige udtryk mønster af UCA1. Imidlertid har den transkriptionelle regulering af UCA1 genekspression ikke undersøgt. Her for første gang, vi har karakteriseret promotorregionen af ​​det humane UCA1 gen og rapporteres dens regulering af Ets-2 transkriptionsfaktoren.

I modsætning til konventionelle protein-kodende gener, sekvenserne, de transkriptionelle startsteder , exon-strukturerne, og længderne af disse lange ikke-kodende gener er alle meget variabel [20]. Baseret på deres genomiske nærhed til protein-kodende gener, er lncRNAs klassificeret som overlappende, cis-antisense, tovejs eller intron ncRNAer [21], [22] .De mekanismer lncRNA udtryk er ukendt, selv om der er mange tegn på, at foreslå lncRNAs reguleres af lignende mekanismer som protein-kodende gener. Kort fortalt, i studiet af Wang et al, fandt de en kerne promotorregion (fra nukleotid -132 til -48) af lncRNA HULC genet og de karakteriseret en CREB-bindingssted mellem nucleotiderne -67 og -53 i kernen promotorregionen [ ,,,0],23]. I en anden undersøgelse af Zhao et al, de analyserede en 5 kb genomisk DNA-fragment opstrøms for det første exon af lncRNA MEG3 genet, kendetegnet en CRE websted involveret i MEG3 gentranskription og også fundet adskillige proteiner fra CREB familien direkte binde til CRE websted [24]. Desuden har mange undersøgelser tyder på, at de mekanismer, som ncRNA udtryk ændret i kræft svarer til dem for protein kodning gener, herunder epigenetiske mekanismer [25], [26], [27], [28].

i vores undersøgelse analyserede vi den proximale promotorregion af UCA1 som ligger ved -2000 nukleotider opstrøms for transkriptionsstartstedet af UCA1 genet. Vi demonstreret ved luciferaseaktivitet assay og deletionsanalyse at regionen mellem nucleotiderne -400 til -150, kan bidrage til den grundlæggende promotoraktivitet. Og i denne region vi forudsagde mange kendte transkriptionsfaktor via bioinformatik forudsigelse metoder. Vi har også påvist af EMSA og chip analyse, at de Ets-2 bindingssteder mellem nukleotider -385 og -380 spillede en vigtig rolle i reguleringen af ​​UCA1 promotor-aktivitet. I vores undersøgelse har vi brugt BLS-211 celler, som blev undladt at udtrykke UCA1 genet, selv om de udtrykte Ets-2-genet. Når vi behandlet cellerne med Ets-2 siRNA blev UCA1 promotor aktiviteten ikke helt afskaffet. Begge observationer antyder, at UCA1 ekspression kan styres ved andre transkriptionelle faktorer. Bemærkelsesværdige når regionen mellem nukleotider -700 og -400 blev slettet, promotoren aktiviteten faldet betydeligt. Den foreslår en tilstedeværelse af nogle transskriptionelle aktivatorer i denne region. For yderligere præcisering brug fremtidige undersøgelser at være fokuseret på andre TF’er af promotorregionen af ​​UCA1 genet, der bidrager til aktiviteten af ​​UCA1 genet.

Ets-2 blev oprindeligt karakteriseret som et proto-onkogen. I årenes løb Ets transkriptionsfaktor familie blev et fælles element i tumorudvikling [29]. Resultaterne af Carbone

et al

foreslog, at nedregulering af Ets-2 i prostata kræftceller var forbundet med reducerede niveauer af anti-apoptotiske protein bcl-x (L), vækst- lovgivningsmæssige faktorer cyclin D1 og c-myc . Denne undersøgelse viste, specifikke rolle Ets-2 i at fremme vækst og overlevelse af prostata kræftceller [30]. I en anden undersøgelse viste de, at transient ekspression af Ets-2 beskytte celler mod apoptose ved at øge promotoraktiviteten af ​​Bd-XL og dermed øge dets mRNA og protein ekspressionsniveauer i mesotheliom cellelinjer [31]. Tidligere Hanke

et al

fandt, at forholdet mellem Ets-2 mRNA til urokinase plasminogen aktivator (uPA) mRNA i urin kunne være en potentiel markør for blærecancer [32]. Selv om der er data støttet, at Ets-2 tager del i udviklingen blærekræft, de nøjagtige roller og mekanismer i Ets TF’er i blærekræft er for det meste ukendt.

I vores undersøgelse viste vi en hæmning af UCA1 udtryk fremkaldt af Ets-2-gen-nedregulering. Funktionel konsekvens af Ets-2-genet silencing førte til apoptose i BLZ-211 celler. Vi viste også, at Akt pathway var involveret i denne proces. Serin-threonin kinase Akt (også kendt som proteinkinase B) er en central konvergens knude i et bredt indflydelsesrige signalnet. Akt regulerer vigtige cellulære funktioner, såsom migration, proliferation, differentiering, apoptose, og metabolisme [33]. Desuden aktivering af Akt pathway spiller en central rolle i inhibering af apoptose induceret af en række stimuli, herunder vækstfaktor tilbagetrækning, frigørelse af ekstracellulær matrix, UV-bestråling, cellecyklus uoverensstemmelse og aktivering af FAS signalering [34], [35] , [36]. For at teste om Ets-2 regulerer Akt pathway gennem UCA1, brugte vi en anden blærecancer-cellelinie BLS-211, som mangler i UCA1 genekspression og det er afledt fra den samme patient som BLZ-211. Mest interessant, efter den svækkede udtryk for Ets-2 i BLS-211 celler vi ikke observere nedregulering af Pakt og forøgelse af celle apoptose. Disse resultater viste, at UCA1 kan være involveret i aktiveringen af ​​Pakt pathway af Ets-2 (fig. 6). Disse resultater var i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse viste, at Pakt nedreguleres i UCA1 stabile Knockdown BLZ-211 celler [37]. LncRNAs har vist at indeholde biologiske aktiviteter. Så vidt vides, den brede funktionelle repertoire af lncRNAs omfatter roller i høj-ordens kromosomale dynamik, telomer biologi og subcellulære strukturelle organisation [22], [38]. Udover vores undersøgelse, andre undersøgelser også foreslået, at lncRNA kan være involveret i reguleringen af ​​signal vej, såsom wnt vej, Ras vej [39], [40]. Men den mekanisme, hvordan Ets-2 regulerer Akt pathway er fortsat uklart, og om Akt signalering proteiner direkte interagerer med UCA1 skal bevises yderligere.

Sammenfattende vi kiggede på regulerende elementer direkte involveret i UCA1 gentranskription og fandt, at promoter aktivitet UCA1 er primært henføres til Ets-2 bindingssted i det proksimale promotor-regionen. Vi viste, at transkriptionsfaktor Ets-2 direkte kan binde til dette site, og det er vigtigt at transkriptionel kontrol af UCA1 ekspression. Desuden afslørede vores resultater, at UCA1 kan være involveret i reguleringen af ​​Akt pathway af Ets-2. Vi konkluderede derfor, at Ets-2 regulerer ekspressionen af ​​UCA1 øvrigt lncRNA UCA1 kan være involveret i aktiveringen af ​​Akt signalvejen fra Ets-2. Vores resultater fortaler for yderligere forskning på dette område. Dette er en hidtil ukendt felt med konstant stigende betydning. Det er en stigende betydning og interesse for at udforske funktion og regulering af disse lncRNAs.

Støtte oplysninger

figur S1.