PLoS ONE: Exosomer: Nedsat følsomhed lungekræft A549 celler til Cisplatin

Abstrakt

Exosomer er små ekstracellulære membranblærer af endocytisk oprindelse frigivet af mange celler, der kunne findes i de fleste kropsvæsker. De vigtigste funktioner i exosomer er cellulær kommunikation og cellulære affald oprydning. Denne undersøgelse blev udført for at bestemme involvering af exosomer i reguleringen af ​​følsomheden af ​​lungekræft cellelinien A549 til cisplatin (DDP). Da DDP blev tilføjet til A549 celler, exosomer sekretion blev styrket. Tilsætning af de udskilte exosomer til andre A549-celler forøgede resistens af disse A549-celler til DDP. Ved udsættelse af A549 til DDP, ekspressionsniveauerne af flere miRNA og mRNA’er sigende forbundet med DDP følsomhed ændret sig væsentligt i exosomer; disse ændringer kan mediere resistensen af ​​A549-celler til DDP. Exosomer frigivet af A549-celler under DDP eksponering faldt følsomheden af ​​andre A549 celler til DDP, som kan medieres af miRNA og mRNA’er udveksling af exosomer via celle-til-celle kommunikation. Selv om den detaljerede mekanisme af resistens er fortsat uklart, vi troede, at hæmning af exosomer dannelse og udslip kan udgøre en ny strategi for lungekræft behandling i fremtiden

Henvisning:. Xiao X, Yu S, Li S, Wu J , Ma R, Cao H, et al. (2014) Exosomer: Nedsat følsomhed lungekræft A549 celler til Cisplatin. PLoS ONE 9 (2): e89534. doi: 10,1371 /journal.pone.0089534

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: 8. oktober, 2013; Accepteret 22. januar 2014 Udgivet: 21 februar 2014

Copyright: © 2014 Xiao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.372.396), og de seks Talent Peak of Human Affairs Hall i Jiangsu-provinsen (nr 40). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relateret dødelighed i ordet og ikke-småcellet caner (NSCLC) er den mest almindelige form for lungekræft. Patienter med sådan en aggressiv tumor har en dårlig fem års overlevelse mindre end 20%, hvilket er mest sandsynligt tilskrives metastatisk sygdom på tidspunktet for diagnosen. Selv om flere mål stoffer som erlotinib og cetuximab kunne øge den samlede overlevelse NSCLC patienter, platin-dublet kemoterapi er fortsat den vigtigste behandling for patienter med fremskreden NSCLC.

Platinum (DDP) er en DNA-ødelæggende middel, som kunne træde tumorceller og forårsage aquation og hydrolyse til dannelse af reaktive platinkomponenter [1]. Aquated DDP genkender generelt DNA som det primære mål og interagerer med DNA, hvilket fører til dannelsen af ​​interstreng og /eller intrastrand tværbindinger [2]. DNA-skade responset (DDR) systemet og diverse signalveje aktiveres [3], og ekspressionsniveauerne af RNA kunne blive påvirket i overensstemmelse hermed [4]. Mange patienter vise enten medfødte følsomhed over for lægemidlet eller DPP-ufølsomhed tilbagevendende af sygdommen efter en indledende periode med behandling. Flere mekanismer er involveret i følsomheden regulering af tumorceller til DDP; disse mekanismer omfatter intracellulær ophobning og udstrømning af DDP [5], DNA-reparation evne, tolerance over for unrepaired DNA-læsioner [6], og regulering af flere gener [7].

Exosomer er små ekstracellulære membranvesikler, der kunne udskilles af mange slags tumorceller og findes i de fleste kropsvæske [8], [9]. Uanset oprindelse, exosomer har lignende protein kompositioner, der kan kategoriseres i tre hovedgrupper: ægte tømmerflåde proteiner, cytoskeleton som proteiner og varmechokproteiner [10]. Interne vesikler dannes ved indadgående knopskydning af celler kendt som multivesikulære endosomer (MVE). Fusion af MVE med plasmamembranen fører til frigivelse af de interne vesikler kendt som exosomer [11]. Exosomer kunne rejse til de omkringliggende celler eller fjerne væv til at vise funktioner såsom immunstimulering, immunsuppression [12], induktion af spredning og tolerance [13] – [15], overførsel af genetisk materiale [10] og skrald fjernelse [16]. Exosomer indeholder en betydelig mængde af RNA og kan overføres fra én celle til en anden [10], og dermed bidrage til spredning og metastaser af kræft og kræft udvikling [13], [14], [17], [18]. Men til vores bedste overbevisning, inddragelse af exosomer i reguleringen af ​​følsomheden af ​​lungekræft celler til DDP fortsat ukendt.

Når de udsættes for DDP, tumorceller normalt tilpasse sig mikromiljø og tilpasse sig stimulering. Da exosomer rapporteres at være involveret i celle kommunikation, vi hypotese den mulige involvering af exosomer i reguleringen af ​​A549 celle responser på DDP. Specifikt kan exosomer frigivet af A549-celler under DDP eksponering ændre følsomheden af ​​de omgivende celler til DDP. Desuden kan exosomal RNA’er overføres fra en celle til en anden [10]. Som sådan formodes vi, at nogle miRNA og mRNA’er sigende forbundet med DDP resistens kan overføres fra én celle til en anden ved exosomer. MIR-21, miR-98, miR-133b, miR-138, miR-181a og miR-200c [19] – [24] blev angiveligt forbundet med DDP følsomhed regulering, mens ERCC1, BRCA1 og RRM1 [25] – [27 ] var relateret til DDP modstand. For at teste vores hypoteser, blev disse miRNA og mRNA udvalgt til at foreløbigt studere deres involvering i processen med DDP modstand.

Resultater

Karakterisering af Exosomer frigivet af A549 celler

Til sikre en vellykket isolering af exosomer blev de indsamlede exosomer observeret af TEM (transmission electron microscope) og analyseret ved Western-blot (figur 1A). Mikrovesikel klynger udviste runde vesikler måler 30-100 nm i diameter (figur 1B, 1C). Figur 1D viser ekspressionen af ​​CD63, et tetraspanin familiemedlem, der lokaliseres i exosomal interne vesikler, som en dual band i exosomer og som et lyst bånd i celler.

(A) exosome isoleringsmetode anvendt i denne undersøgelse. (B, C) Transmission elektronmikroskopisk billede af exosomer. Exosomer er små vesikler måler fra 30 nm til 100 nm i diameter. (D) Western blot af CD63 og β-actin i exosomer og celler.

Cellular Effekt af A549-celler for cisplatin

Dosis-respons blev vurderet i denne undersøgelse. En koncentration på 3 pg /mL DDP blev udvalgt til vores protokol, da denne dosis forårsagede døden for omkring 50% af A549-celler (figur 2A, 2B). For at teste effekten af ​​DDP om frigivelse af exosomer, exosomer blev kvantificeret med BCA; proteinet standardkurve er vist i figur 2C. Som vist i figur 2D, mængden af ​​exosomer frigives af hver celle under DDP eksponering var højere end under normale forhold, hvilket indikerer en betydelig stigning i exosomer frigivet af A549-celler efter udsættelse for DDP.

(A) dosis og respons mellem levedygtighed A549-celler (%) og koncentration af cisplatin (1-10 ug /ml) i 48 timer. (B) Mikroskopisk billede af A549-celler behandlet med 0 og 3 ug /ml cisplatin. Billeder blev opnået ved en forstørrelse på 100 ×. (C, D) Mængde af exosomer bestemmes via BCA standardkurve og forøget sekretion af exosomer normaliseret til celleantal efter eksponering af A549-celler for cisplatin den. (E) Differential ekspressionsniveauer af de seks miRNA i celler efter eksponering af A549-celler for cisplatin. (F) differentiel ekspression niveauerne af de to miRNA i exosomer efter eksponering af A549-celler for cisplatin. (G) Fold-ændringer i ekspressionen af ​​miR-21 og miR-133b i exosomer er højere end dem i celler. Streger indikerer gennemsnit ± SD af tre gentagelser. * Angiver p. 0,05 versus kontrolgrupper

For at afgøre, om exosomer kunne shuttle oplysninger, de udtryk for de seks miRNA foreslået i dette papir blev påvist i celler og exosomer. Alle seks miRNA kunne påvises i celler, hvorimod kunne påvises kun miR-21 og 133b i exosomer (Ct værdien af ​​de fire andre miRNA oversteg 40). For at teste indflydelsen af ​​DDP på ​​ekspressionsniveauerne af miRNA i celler og exosomer blev detekteret ekspressionsniveauerne af disse seks miRNA i celler og exosomer ved udsættelse af A549-celler til DDP. Som vist i figur 2E og 2F, ekspressionsniveauerne af MIR-21, MIR-133b, MIR-98, MIR-181a steg i celler, mens udtrykkene for MIR-21 og 133b steg i exosomer. Fold-ændringer i ekspressionen af ​​miR-21 og miR-133b i exosomer var også højere end i celler (Figur 2G).

Exosomer Formindsk følsomhed A549 celler til DDP

For at bestemme exosomer uptake af A549-celler, blev exosomer mærket ved gjorde og co-inkuberet med A549-celler i 3 timer, hvorefter fluorescens mikroskopi blev udført. Som vist i figur 3B, kan exosomer blive absorberet af omgivende celler. For at bestemme om exosomer kan påvirke følsomheden af ​​A549 til DDP blev exosomer frigivet af A549 celler under normale forhold og under DDP tilstand høstet og tilsættes til cellerne. Som vist i figur 3A og 3C, kunne exosomer frigivet af A549-celler under DDP eksponering nedsætte følsomheden af ​​andre A549 celler til DDP, mens exosomerne frigivet af A549-celler under normale betingelser havde ringe indflydelse på følsomheden af ​​A549-celler til DDP. Fordi exosomer frigivet af A549 celler under normale forhold ikke påvirke følsomheden af ​​omkringliggende celler til DDP, vi valgte at studere funktionen af ​​exosomer frigivet af A549 celler under kun DDP eksponering.

(A) forbehandling af A549 celler med exosomer der frigives under cisplatin (3 ug /ml) eksponering formindsker følsomheden af ​​cellerne for cisplatin med omkring 20% ​​sammenlignet med dem uden forbehandling i 48 timer. (B) Optagelse af exosomer (red) af A549-celler efter inkubering i 3 timer blev visualiseret ved mikroskopi. Scale bar: 50 pm. (C) Mikroskopisk billede af A549 celler dyrket under fire betingelser [kontrol-, exosomer, DDP (3 ug /ml), exosomer + DDP] i 48 timer. Billeder blev opnået ved en forstørrelse på 100 ×. * I (A) angiver p 0,05 versus kontrolgrupper

Exosomer påvirke ekspressionsniveauerne af Cellular miRNA og mRNA

For at teste mulige vekslen i udtryk for miRNA og mRNA i celler. som følge af exosomer frigivet af A549-celler under DDP eksponering blev detekteret ekspressionsniveauerne af disse miRNA og mRNA’er efter celler blev udsat for exosomer. Som vist i figur 4A, ekspressionsniveauet af MIR-21 steg mens ekspressionsniveauerne af MIR-98, 133b, 138, 181a, og 200c faldt. Figur 4B viser en stigning i ekspressionsniveauerne af ERCC1, BRCA1, og RRM1. Som vist i figur 4C og 4D, efter A549-celler blev behandlet med DDP, de relative fold-changes af disse miRNA og mRNA’er i celler forbehandlet med exosomer varierede fra de relative fold-changes iagttaget i celler dyrket under normale forhold.

Ekspressionsniveauer af (A) miRNA og (B) mRNA’er under normale forhold med og uden exosome forbehandling. Fold-ændringer i ekspressionen af ​​(C) miRNA og (D) mRNA under cisplatin med og uden exosome forbehandling. Streger indikerer gennemsnit ± SD af tre gentagelser. * Angiver p. 0,05 versus kontrolgrupper

Diskussion

Så vidt vi ved, vores undersøgelse er den første til at demonstrere exosomer involvering i reguleringen af ​​følsomheden af ​​lungekræft A549 celler til DDP. Vi fandt, at eksponering af A549-celler til DDP kan forårsage celler til at frigive flere exosomer end under normale forhold, og at interaktionen af ​​disse exosomer med andre A549-celler kan øge resistensen af ​​disse A549-celler til DDP. Vores undersøgelse først viser, at når A549 celler udsættes for DDP, ekspressionsniveauerne af flere miRNA og mRNA sigende forbundet med DDP følsomhed ændrer sig væsentligt i exosomer og at disse ændringer sandsynligvis medierer DDP modstand A549 celler.

Når udsat for DDP, cancerceller tilpasse sig ændringer i miljøet for at overleve. DNA skade responset (DDR) system og forskelligartede signalveje derefter induceret. Nogle celler kan reparere disse skader og passere gennem cellecyklus checkpoints, mens andre celler ikke er i stand til at reparere læsioner og derved undergå celledød ved apoptose eller cellulær ældning. Som vist i figur 2A, omtrent halvdelen af ​​cellerne døde ved eksponering af A549-celler til 3 ug /ml DDP, medens indholdet og cellulære processer overlevende celler blev ændret på det transskriptionelle niveau. Som vist i figur 2E, ekspressionsniveauerne af MIR-21, MIR-133b, MIR-98 og MIR-181a påvist i dette dokument varieres. RNA indholdet i exosomer sigende afvige fra RNA af donor celler [10], og den differentierede udtryk for exosomal miRNA afhænger både oprindelsen af ​​celler og miljøet. Figur 2G viser, at under DDP behandling, de differential ekspressionsniveauerne af miRNA i exosomer afveg fra dem i celler. Og som vist i figur 2E og 2F, cellulære miRNA udtryk var forskellige fra exosomal miRNA udtryk. Derudover ekspressionsniveauerne af miRNA varierede i celler dyrket under forskellige betingelser, hvilket indikerer, at miRNA indholdet i exosomer kan reguleres i henhold til den biologiske tilstand af cellerne.

Under DDP eksponering, exosomer udgivet af hver overlevende celle øge og nogle af DDP eksporteres af disse exosomer [16]. Exosomal miRNA derpå medieret i celle-til-celle kommunikation [10]. Figur 3B kunne 4A og 4B viser, at exosomer transporterer meddelelser uptaken ved omgivende celler og cellulære indhold ændres tilsvarende. Disse meddelelser kan indeholde oplysninger af overhængende fare, og indholdet i exosomer altid afhænger af tilstand, hvor de exosomer frigives. Når celler blev behandlet med en anden cyklus af DDP blev de transkriptionelle niveauer påvirkes. Som vist i figur 4C, og 4D, celler forbehandlet med exosomer viste nogle forberedelse til den anden cyklus af DDP behandling og transkriptionelle niveauer induceret i celler var forskellige.

Ved udsættelse for DDP, A549-celler blev stimuleret og ekspressionsniveauet af mIR-21 øges. Fordi ekspressionsniveauet af MIR-21 i exosomer også steget betydeligt og exosomer kan uptaken ved omgivende celler, vi udledes, at exosomer kunne mediere mere MIR-21 til andre celler. Faktisk var en stigning i ekspressionsniveauet af MIR-21 i andre celler observeret, hvilket antyder, at opreguleret ekspression af MIR-21 [19] formindsker følsomheden af ​​lungecancerceller til DDP. Ved udsættelse for DDP gang mere, celler modtog sit andet stimulering og reagerede mindre kraftigt. Ekspressionsniveauerne af MIR-21 øges, men ikke så markant som i den første ændring. Ekspressionsniveauet af MIR-133b steg også efter A549-celler blev behandlet med DDP. Exosomer medierer MIR-133b kan uptaken ved omgivende celler og påvirke de transkriptionelle niveauer af andre celler. Med hensyn til rigelige af ekstern MIR-133b kan være medieret i cellerne, kan ekspressionen af ​​MIR-133b i celler føres tilbage til at falde. Den nedreguleret ekspression af MIR-133b [28] har vist sig at nedsætte følsomheden af ​​lungecancerceller til DDP. Efter en anden cyklus af DDP behandling, celler med dårlig udtryk for miR-133b reageret og ekspressionsniveauet af miR-133b åbenbart steget.

Mange forskere har udtrykt forskellige synspunkter om funktionen af ​​exosomer påvirke celle responser til stimulering, og disse funktioner af exosomer har altid været afhængig af typen af ​​stimulation. Maria Eldh et al. hævdede, at exosomer påvirke respons modtagende celler til en ekstern stress stimulus ved medierende RNA fra en celle til en anden [29]. Claire Corcoran et al. konstateret, at exosomer dels bidrage til cellulær kommunikation, hvilket resulterer i at mediere docetaxel-resistens til sekundære celler [15]. Vores undersøgelse yderligere demonstreret exosome involvering i reguleringen af ​​følsomheden af ​​A549 celler til DDP under DDP eksponering og at denne indflydelse er sandsynligvis reguleret af exosomer. Men flere mangler og mangler findes i dette arbejde, og det detaljerede mekanisme DDP modstand vil blive yderligere undersøgt i vores næste undersøgelse.

I denne undersøgelse viste vi, at exosomer udgivet af A549 celler udsat for DDP kunne kommunikere med andre celler og påvirke modstand af disse celler til DDP. Selvom detaljeret mekanisme fortsat uklart, mener vi, at hæmning af exosome dannelse og udslip kan udgøre en roman strategi for den fremtidige behandling af lungekræft.

Materialer og metoder

Cell Culture

Celler fra velkarakteriserede human lunge adenocarcinom cancer cellelinje A549 (Shanghai Cellular Research Institute, Kina) blev opretholdt i RPMI-1640 medium (Nanjing Kaiji Biology, Kina) suppleret med 10% FBS (føtalt bovint serum, Hyclone Laboratories, USA ) ved 37 ° C og under 5% CO

2. Celler blev inokuleret i en 96-brønds plade ved en celletæthed på 6 x 10

3 celler /brønd, og dosis-respons evaluering af DDP til A549-celler blev udført under anvendelse af en celletælling kit-8 (CCK-8; Dojindo , Kumamoto, Japan).

Isolering og karakterisering af exosomer frigivet af A549 celler

for at reducere indflydelsen af ​​exosomer i FBS, FBS blev forarmet af exosomer ved ultracentrifugering ved 200.000 x g ved 4 ° C i 16 timer (Beckman 70 Ti-rotor). Efter at have ladet celler at vedhæfte natten over blev mediet erstattet med RPMI-1640 medium og 10% exosom-depleteret FBS. Efter 48 timer blev dyrkningsmediet høstet til opsamling exosomer. Exosomer isolation (figur 1A) blev udført ved hjælp af en Beckman ultracentrifuge (70 Ti rotor) og ExoQuick-TC exosome nedbør løsning (System Biosciences, Mountain View, CA, USA).

Exosomer opløst i 200 uL fosfat- saltvand (PBS) blev kvantificeret ved anvendelse af et forstærket BCA protein assay kit (Beyotime Biotechnology, Kina). Morfologien og partikelstørrelsen af ​​exosomer opløst i PBS blev karakteriseret via en transmission (TEM, JEM-2100, JEOL, Tokyo, Japan). Totalt cellulært og exosomal proteiner blev henholdsvis ekstraheret fra celler og exosomer anvendelse af SDS lysis buffer (250 nM Tris-HCI, pH 7,4, 2,5% SDS). Proteiner (10 mg /ml) blev separeret på 10% SDS-PAGE geler og overført til en PVDF-membran. Antistofferne bruges til immunoblotting inkluderet CD63 (System Biosciences, Mountain View, CA, USA) og β-actin (Sigma-Aldrich). Brug forøget kemiluminescens løsning (ECL kit, Pierce), blev der observeret proteinbånd hjælp Molekylær billede ChemiDoc XRS + (Bio-Rad).

Optagelse af Exosomer og Cell levedygtighed Analyse

De exosom pellets resuspenderedes i 1 ml phosphatebuttered saltvand (PBS) indeholdende 5 ug /ml gjorde (Biotium, USA) i 30 min. Det resuspenderede opløsning blev centrifugeret ved 200.000 x g i 2 timer, og PBS-resuspenderede pellets sattes til A549-celler. Fluorescensimagografi blev efterfølgende udført ved konfokal mikroskopi.

For at vurdere virkningen af ​​exosomer af følsomheden af ​​celler til DDP, 6 × 10

3 celler /brønd blev podet i en 96-brønds plade med RPMI- 1640 indeholdende 10% exosom-depleteret FBS. Efter 24 timer blev exosomer frigivet af A549-celler under normale og DPP-behandlede betingelser i de relevante celler i et forhold på 5: 1 (exosomer høstet fra 5 ml supernatant blev tilsat til celler dyrket i 1 ml dyrkningsmedium) for 3 timer. Det samme volumen af ​​PBS uden exosomer blev tilsat til celler, der anvendes som kontrolgruppe. For cytotoksicitet assays blev 3 ug /ml DDP anvendt til brøndene i 48 timer og det samlede cellelevedygtighed blev vurderet under anvendelse af en celletælling kit-8 (CCK-8).

RNA-isolering og analyse

Exosomal RNA’er blev isoleret ved anvendelse af en Mirvana microRNA isolation kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) og elueret i 100 pi opvarmet eluering opløsning ifølge fabrikantens protokol. Cellular RNA blev opnået ved hjælp Trizol® ekstraktion metode (Invitrogen, Paisley, UK) og elueres i 30 uL af Hedeselskabets

2O.

miRNA blev hårnåle-revers transskriberet (RT) med miRNA revers transkription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). RT-PCR blev udført tredobbelt under anvendelse af TaqMan miRNA assay (Applied Biosystems). Et gen-specifikke probe mix (MIR-21, 000.397; MIR-98, 000.577; MIR-133b, 002.247; MIR-138, 002.284; MIR-181a, 000.480; MIR-200c, 002.300) blev anvendt i denne undersøgelse. U6 snRNA blev anvendt som intern kontrol for TaqMan miRNA assay til påvisning af ekspressionsniveauet af miRNA i celler; syntetiske ikke-menneskelige miRNA [

Caenorbabditis elegans

miR-39 miRNA (cel-miR-39); Takara Bio Inc., Tokyo, Japan] blev tilsat i at normalisere exosomet volumen ved begyndelsen af ​​RNA-isolering.

Tilpasset TaqMan Low Density RT-PCR array (Confinder Bio., Kina) blev påført for at detektere mRNA udtryk, og GAPDH blev valgt som den interne kontrol. Analyse af genekspression blev udført under anvendelse ABI Prism 7900 Sequence D interne detektionssystem software (Applied Biosystems).

Statistical Analysis

Resultater udtrykkes som middel ± SD. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Students

t

-tests når man sammenligner to grupper (PASW Statistics 18.0) og p. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant