PLoS ONE: Genome-Scale skærm til DNA Methylering-Based Detection Markers for æggestokkene Cancer

Abstrakt

Baggrund

identifikation af følsomme biomarkører til påvisning af kræft i æggestokkene er af høj klinisk relevans for tidlig påvisning og /eller overvågning af recidiv. Vi udviklede en systematisk multi-trins biomarkør opdagelse og kontrol strategi for at identificere kandidat DNA methylering markører for blod-baseret detektion af kræft i æggestokkene.

Metode /vigtigste resultater

Vi brugte Illumina Infinium platformen at analysere status DNA methylering af 27,578 CpG sites i 41 tumorer i æggestokkene. Vi anvendte en markør selektionsstrategi der understregede følsomhed ved at kræve konsekvens af methylering tværs tumorer, og samtidig opfylde specificitet ved at udelukke markører med methylering i kontrol leukocyt eller serum DNA. Vores verifikation strategi involveret afprøve, om identificerede markører til at overvåge sygdomsbyrde i serielt indsamlede serumprøver fra patienter med ovariecancer, der havde gennemgået kirurgisk tumor resektion i forhold til CA-125 niveauer.

Vi identificerede en markør,

IFFO1

promotor methylering (IFFO1-M), er der ofte methyleres i ovarietumorer og det er sjældent påvises i blodet af normale kontroller. Ved afprøvning i 127 serielt indsamlet sera fra patienter med ovariecancer, viste IFFO1-M efter resektion kinetik signifikant korreleret med serum CA-125 målinger i seks ud af 16 patienter.

Konklusioner /Betydning

vi implementerede en effektiv markør screening og verifikation strategi, der fører til identifikation af IFFO1-M som et blod-baseret kandidat markør til følsom detektion af ovariecancer. Serum niveauer af IFFO1-M viste post-resektion kinetik i overensstemmelse med en afspejling af sygdomsbyrde. Vi forventer, at IFFO1-M og andre kandidatlande markører nye fra denne markør udviklingsportefølje kan give afsløring sygdom kapaciteter, der supplerer de eksisterende biomarkører

Henvisning:. Campan M, Moffitt M, Houshdaran S, Shen H, Widschwendter M, Daxenbichler G, et al. (2011) Genom-Scale skærm til DNA Methylering-Based Detection Markers for kræft i æggestokkene. PLoS ONE 6 (12): e28141. doi: 10,1371 /journal.pone.0028141

Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: May 10, 2011; Accepteret: November 2, 2011; Udgivet: December 7, 2011

Copyright: © 2011 Campan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af æggestokkene Cancer Research Fund, give PPD /USC.06, og National Institutes of Health og National Cancer Institute, give R01-CA096958. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. PL er en konsulent og Scientific Advisory Board medlem i Epigenomics AG. Han holder udstedte patenter på MethyLight teknologi, som er blevet licenseret til Epigenomics AG. Dette arbejde blev ikke støttet af Epigenomics AG. Epigenomics havde ingen rolle i studie design, indsamling eller analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Desuden er PL og MC navngivet som opfindere på en patentansøgning for Digital MethyLight teknologi. Patenterne og forholdet til Epigenomics ikke ændrer forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om deling af data og materialer. De andre forfattere oplyses nogen potentiel konkurrerende interesser.

Introduktion

Kræft i æggestokkene er den hyppigste årsag til gynækologiske kræftdødsfald og den femte hyppigste årsag til alle kræftrelaterede dødsfald blandt kvinder. Det er blevet anslået, at en kvinde i 72 vil udvikle ovariecancer i hendes levetid i USA, og at en kvinde i 96 vil dø af denne sygdom [1]. Den femårige samlet overlevelse er stærkt etape-afhængig [2], [3] med satser på 94% for fase I sygdom og 28% for fase IV sygdom [1].

Siden tidligt stadie sygdommen er ofte asymptomatisk, og der er ingen effektiv screening strategi, de fleste patienter (62%) til stede med fremskreden fase (III og IV) sygdom, hvor kræften har bredt sig til hele den peritoneale kavitet eller andre organer [1]. Mere end 85% af patienter med fremskreden sygdom tilbagefald efter ophør af primær terapi, trods en indledende god respons [4], [5]. Det forventes, at der er opstået effektive metoder til påvisning af asymptomatisk ovariecancer før invasion og metastase ville væsentligt reducere dødeligheden for denne sygdom. Følsomme detektionsmetoder kunne også anvendes til overvågning af sygdomme tilbagefald efter tumorresektion med eller uden adjuvans kemoterapi.

I øjeblikket er der ingen god biomarkør eller billeddannende fremgangsmåde med tilstrækkelig følsomhed og specificitet til påvisning af præklinisk ovariecancer [6 ]. To protein-baserede biomarkører, CA-125 og HE4, er blevet klinisk godkendt til at måle sygdomsbyrde og vurdere kræft i æggestokkene behandling [7], [8]. Men disse markører ikke forhøjet i alle ovarietumorer og ikke har tilstrækkelig positiv prædiktiv værdi for vurdering populationsbaseret risiko eller tidlig påvisning. I betragtning af de begrænsninger nuværende tilgange, der er et presserende behov for at udvikle mere effektive strategier til påvisning af præklinisk ovariecancer tidligt nok til behandling for at blive en succes. Da ovariecancer er heterogene, med ukendte celler oprindelses- og dårligt forstået patogenese [9] markøren opdagelse processer bør stole på high-throughput teknologi-baserede tilgange frem for mekanistiske-drevet markør opdagelse strategier. Desuden bør markører for ovariecancer kunne detektere tumorer hundrede gange mindre end de klinisk betydende serøs cancere typisk anvendes til at evaluere biomarkør ydeevne [10].

Epigenetisk biomarkører for nylig har vist sig som alternativer til protein biomarkører for den tidlig påvisning af cancer [11] – [13], herunder ovariecancer [14] – [17]. Afvigende DNA hypermethylering ofte observeret i cancerceller [18]. Kræftpatienter har forhøjede niveauer af frit DNA, der cirkulerer i blodbanen [19]. Cancerassocieret afvigende DNA-methylering, opstod i det mindste delvis i tumorceller, kan detekteres i serum eller plasma DNA fra cancerpatienter [11], [12]. Methyleret DNA er kemisk og biologisk stabile, let påviselig i mange typer af kropsvæsker og derfor velegnet til blod-baserede cancer påvisning [11] – [17]. Men det begrænsede antal DNA methylering markører øjeblikket gælder kun en lille brøkdel af ovariecancer [14], og er ikke-specifikke, mens detektionsteknologier mangler følsomhed, er stort set gel-baseret, og er ikke-kvantitative [15] – [17]. Nylige fremskridt i DNA-methylering assay teknologier har potentiale til at øge DNA-methylering markør opdagelse gennemløb gennem den samtidige analyse af tusindvis af genomisk loci [20], [21] og for at muliggøre ultra følsom påvisning af meget små mængder af denatureret DNA i en kvantitativ måde [22], [23].

i denne undersøgelse, vi gennemførte en storstilet systematisk markør opdagelse for DNA methylering markører for kræft i æggestokkene, der ikke er til stede i blodet hos kvinder uden kræft i æggestokkene. DNA methylering markører har vist sig at have moderat klinisk følsomhed i mange tidligere rapporter. I overvejer, hvordan at forbedre følsomheden af ​​DNA methylering markører, vi erkendt, at methylering status normal æggestok er irrelevant, så længe normal ovarie DNA normalt ikke sive ud i blodbanen og markørerne er negative hos raske kontroller. Derfor har vi modificeret vores opdagelse strategi til at fokusere på en direkte sammenligning af tumor versus blod, i modsætning til tumor vs. normalt væv. I vores udvælgelsesproces understregede vi markør følsomhed ved at kræve konsistens tumor methylering, og markør specificitet ved at udelukke markører med methylering i kontrol leukocyt eller serum DNA. Vi identificerede en lovende kandidat DNA-methylering markering, IFFO1-M, som vi testet som en blod-baseret biomarkør i et begrænset antal tilfælde og kontrolsera. At dokumentere, at vores kandidat IFFO1-M markør foranstaltninger sygdomsbyrde i blodet, vi analyserede de tidsmæssige mønstre af IFFO1-M niveauer i serielle blodprøver trukket før og efter resektion af den primære tumor, og sammenlignet disse til en valideret markør for sygdom byrde, CA-125. Dette inden for individet sammenligning tillader hver patient til at fungere som sin egen kontrol, med nogen variation i genetisk baggrund mellem de serielle blodprøver. I denne undersøgelse, rapporterer vi om den kvantitative digital analyse af IFFO1-M i serielle prøver fra ni patienter, for i alt 127 blodprøver.

Metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsinki mennesker doktrin og blev godkendt af de Institutional Review Boards, der er involveret i undersøgelsen institutter: Duke University Medical center (Durham, USA), Keck School of Medicine ved University of Southern California ( Los Angeles, USA), og Innsbruck University Hospital (Innsbruck, Østrig). Underskrevet informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere til indsamling af prøverne og deres efterfølgende analyse.

Patienter og kontroller prøvetagning og behandling

De 41 æggestokkene tumor prøver, der anvendes i Infinium-baserede markør opdagelse fase af undersøgelsen blev opnået fra patienter, der blev opereret på to institutioner, Duke University Medical center (30 prøver) og University of Southern California Medical center (11 prøver). Alle tumor prøver blev opnået fra patienter, som forudsat skriftligt informeret samtykke, som blev godkendt af Institutional Review Boards i de respektive institutioner. Blandt tumor prøver indsamlet, var der en blandet (klar celle og endometrioide), tre klare celle, fire mucinous, fire endometrioide, og 32 serøse epitelial ovariecancer prøver (tabel S1). Tumorvæv var lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C, indtil den forarbejdes. Perifert blod leukocyt (PBL) og plasmaprøver anvendes i opdagelsen og verifikation stadier blev opnået fra 10 raske postmenopausale kvinder, hvis blod blev kommercielt indkøbt (HemaCare Corporation). Plasma blev isoleret fra blod opsamlet i rør indeholdende EDTA. Rørene blev centrifugeret i 10 minutter ved 300

g

ved 4 ° C. Uden at fjerne plasmaet fra røret efter den første centrifugering, vi spundet rørene i yderligere 10 minutter ved 1.600

g

ved 4 ° C. Det separerede plasma blev overført til mikrocentrifugerør og centrifugeres igen ved 16.000

g

i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C indtil klar til brug. Den tynde perifere blodleukocytter lag, der sedimenteret over de røde blodlegemer blev opsamlet og opbevaret -80 ° C, indtil klar til brug til DNA-ekstraktion.

DNA blev ekstraheret fra væv ved anvendelse af standard protokoller. DNA blev ekstraheret fra PBL prøver under anvendelse af QIAamp® DNA Blood Kit (Qiagen), medens frit DNA fra plasma og sera blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp® UltraSens Virus Kit (Qiagen). I begge forsøg blev DNA ekstraheret efter producentens anvisninger.

Blodprøverne anvendes i de langsgående analyser blev indsamlet fra 16 patienter behandlet for kræft i æggestokkene mellem 1992-2000 ved Institut for Obstetrik og Gynækologi, Innsbruck University Hospital (Innsbruck, Østrig) i overensstemmelse med og godkendt af Innsbruck University Board Institutional Review. De kliniske og patologiske egenskaber ved disse patienter er anført i tabel S3. De første blodprøver rensede, benævnt baseline prøver blev opnået før operationen for elleve af patienterne og flere dage efter operationen hos fem patienter (se fuldstændige oplysninger i tabel S4). Supplerende blod blev opsamlet fra alle patienter ved hvert opfølgningsbesøg besøg i perioder af tider på mellem 37 til 246 uger (Tabel S4). For serum isolation blev blod lov til at koagulere i 1-4 timer ved stuetemperatur (RT) og centrifugeret i 10 minutter ved 2000

g

ved stuetemperatur. Serum blev isoleret fra koagulatet, opdelt i alikvoter i mikrocentrifugerør og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Kontrol sera fra otte raske kvinder blev kommercielt indkøbt (Innovative Research). Frit cirkulerende DNA blev isoleret fra patienter og kontroller sera under anvendelse af QIAamp® UltraSens Virus Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Niveauer af CA-125 blev bestemt ved en mikro-partikel-enzym-immunoassay (MEIA) under anvendelse af IMX analysator (Abbott Laboratories).

DNA methyleringsanalyse

Alle DNA-prøver blev underkastet bisulfit modifikation under anvendelse af EZ DNA-methylering Kit (Zymo Research) ifølge producentens instruktioner. På Infinium-baseret analyse, 1 ug genomisk DNA fra hver prøve blev bisulfit omdannet i 96 brønds pladeformat hjælp af EZ96 DNA-methylering kit (Zymo Research). Kvaliteten og kvantiteten af ​​bisulfit omdannet DNA, såvel som fuldstændigheden af ​​omdannelse med bisulfit, blev vurderet ved anvendelse af et panel af kvalitetskontrol reaktioner som beskrevet tidligere [24]. Efter omdannelsen blev det modificerede DNA elueret i 18 pi elueringsbuffer leveret med kittet, og 5 pi af hver prøve blev anvendt i Illumina Infinium methylering af DNA assay som angivet af fabrikanten.

I MethyLight analyse, 1 ug genomisk DNA fra hver tumor og PBL-prøve blev behandlet med bisulfit hjælp af Zymo EZ DNA-methylering kit (Zymo Research). Tilsvarende blev Zymo EZ methylering af DNA kit anvendt til at bisulfit konvertere DNA ekstraheret fra plasma eller serumprøver. Generelt 1 ml plasma eller sera blev behandlet i én kolonne af Zymo kit. Efter oprensning blev alle bisulfit modificerede DNA-prøver elueret i 10 pi elueringsbuffer og yderligere fortyndet som følger: PBL-DNA blev fortyndet til en slutkoncentration på 0,5 ng /pl. Tumoren DNA blev fortyndet baseret på tærsklen cyklus (Ct) af en ALU-baserede MethyLight reaktion. Kun DNA’er med en Ct mindre end 21 for denne ALU-baserede reaktion blev anvendt i nogen af ​​de efterfølgende analyser [24]. Plasma-DNA blev fortyndet således, at hver 1 pi modificeret DNA udgjorde 10 pi af det oprindelige volumen af ​​plasma eller serum, der anvendes. For hver MethyLight reaktion 10 pi af den fortyndede tumor, PBL eller plasma bisulfit omdannet DNA blev anvendt. For Digital MethyLight analyse, hele mængden af ​​DNA ekstraheret fra 1 ml serum var bisulfit konverterede, og prøverne blev fortyndet således, at hver 1 pi af hver bisulfit-konverterede DNA-prøve repræsenterede 1 pi det oprindelige serum anvendte mængde. I hvert Digital MethyLight analyse blev 100 pi af den fortyndede DNA anvendes.

Infinium analyse blev udført i USC epigenome centret ved hjælp af HumanMethylation27 BeadArray (Illumina). Protokollerne og sonden oplysninger findes på www.illumina.com. Resultaterne af Infinium assayet blev kompileret for hvert locus hjælp Illumina BeadStudio software (Illumina) og rapporteres som beta (p) værdier, som er DNA-methylering scorer fra 0 til 1, der afspejler den fraktionerede DNA methylering niveau af et enkelt CpG site [ ,,,0],20]. De Infinium analyseresultater er tilgængelige for download på Gene Expression Omnibus (GEO) datalager på National Center for Biotechnology Information (NCBI) under accessionsnummer GSE26989 (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ? acc = GSE26989).

MethyLight assay og dataanalyse blev udført som beskrevet tidligere [22], [25]. De primere og prober til disse analyser er anført i tabellen S2. Den digitale MethyLight assay og dataanalyse blev udført som tidligere beskrevet [23] med den forskel, at PCR reaktioner blev udført i et volumen på 10 pi i stedet for 30 pi.

markørselektion

Infinium sonder, der mislykkedes i nogen af ​​prøverne blev udelukket fra analysen. Sonder forbundet med enkelte nukleotid polymorfier (SNP), er identificeret ved hjælp af NCBI dbSNP bygger 126 og 128, eller repetitive elementer identificeret af RepeatMasker blev også udelukket. De to PBL prøver anvendt i analysen blev kørt in duplo på Infinium DNA-methylering platform og de midlede p-værdier for hver prøve blev anvendt til markering filtrering. Vi slået eventuelle prober med en β-værdi højere end eller lig med 0,2 i nogen af ​​de to gennemsnit PBL-prøver. Vi identificerede tumorprøven med den laveste DNA-methylering værdi (T

L) og PBL prøven med den højeste DNA-methylering værdi (PBL

H) for hver probe og vi beregnet forskellen mellem ß værdier af disse to prøver (T

L- PBL

H). Proberne blev rangeret baseret på denne forskel, og sonder, for hvilket forskellen var mindre eller lig med 0 blev elimineret.

Verifikation af de 15 top-rangerede markører ved hjælp af Cancer Genome Atlas (TCGA) data

de ß værdier af de 15 top-rangerede markører blev hentet fra offentligt tilgængelige DNA methylering datasæt for serøs ovariecancer lagt ud på TCGA data Portal (htpp: //tcga-data.nci.nih.gov/tcga) . Vi sammenlignede fordelingen af ​​Infinium genererede p værdier af disse 15 markører i alle de 41 ovariecancer prøver eller blot de 29 serøs ovariecancere af denne undersøgelse til dem, der opnås fra 284 serøse ovariecancer prøver i TCGA undersøgelsen og i alt 10 normal PBL prøver ved hjælp af dot-diagrammer fra GraphPad Prism Software (GraphPad Software Inc.).

Statistisk analyse

evne IFFO1-M til at skelne mellem tilfælde og kontrolprøver blev vurderet ved at afbilde receiver Operating egenskaber kurve, der forbinder den sande positive rate (følsomhed) til falske positive (1-specificitet) og ved at beregne arealet under kurven (AUC). De 95% konfidensinterval (CI) i AUC blev beregnet med 2000 bootstrap prøver ved hjælp af PROC R pakke [26]. Pearsons korrelation (Pearsons r) blev beregnet til at måle graden af ​​korrelation mellem de IFFO1-M-DNA methylering niveauer og de CA-125 niveauer i hver af de ni patienter. Statistisk test mod nulhypotesen at R = 0 blev udført og en

s Drømmeholdet værdi cutoff på 0,05 blev anvendt til at erklære betydning. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af R 2.13 softwaren.

Resultater

DNA methylering-baserede markør opdagelse rørledning

Vi udtænkt en omfattende og systematisk strategi for at identificere og evaluere blod- baserede DNA-methylering markører for ovariecancer, der kun er til stede i blodet fra individer ramt af sygdommen. Figur 1 illustrerer de skridt, vi forpligtede sig til at nå dette mål. Hvert af disse trin er beskrevet mere detaljeret i de efterfølgende afsnit.

Infinium platform blev anvendt til at screene 27,578 sonder, der repræsenterer 14.489 individuelle gen loci. Vi anvendte en systematisk trinvis fremgangsmåde til at fjerne prober, der mislykkedes i nogen af ​​prøverne, sonder, der indeholdt SNP’er eller repeat sekvenser eller prober med en beta-værdi højere end 0,2 i nogen af ​​PBL-prøver. De resterende prober blev rangeret baseret på deres forskel mellem tumorer og blod (se Materialer og fremgangsmåder), og proberne med højere DNA-methylering i PBL end i nogen af ​​tumorprøverne blev elimineret. Den top 15 fra de resterende 517 markører blev skiftet til MethyLight platform for yderligere kontrol. Alle 15 markører bestået en uafhængig verifikation test udført på offentligt tilgængelige TCGA ovariecancer datasæt og yderligere PBL prøver. Tre markører mislykkedes på grund af uforenelighed spørgsmål relateret til MethyLight platform, mens en anden ti mislykkedes, fordi de blev methylerede i normale PBL DNA (3 markører) eller normal plasma (7 markører). Kun én markør,

IFFO1

, blev udvalgt til yderligere kontrol på patientprøver vha Digital MethyLight. (Stjernen angiver sonder, der mislykkedes i nogen af ​​prøverne, såvel som dem, der omfattede SNPs og gentag sekvenser).

Screening for og udvælgelse af DNA methylering markører for kræft i æggestokkene

Vi først gennemført en omfattende DNA-methylering analyse af 41 kræft i æggestokkene prøver (tabel S1) og to PBL-prøver fra sygdomsfrie postmenopausale kvinder. Vi brugte Infinium DNA methylering BeadArray der samtidig afhører status DNA methylering af 27,578 sonder spænder 14.489 unikke genetiske loci. Vi begyndte markøren udvælgelsesprocessen ved at frafiltrere alle sonder, der mislykkedes (afsløring p-værdi 0,05) i nogen af ​​prøverne, samt sonder, der indeholder enkelt-nukleotid polymorfier (SNPs) [27], og gentag sekvenser (fig 1. og 2A). Dernæst elimineres alle proberne med høj DNA-methylering niveauer i PBL (β 0,2 ethvert af PBL prøven) (Fig. 1). De resterende 13,628 prober (8701 unikke gener) blev rangordnet i en faldende orden baseret på en algoritme, der beregner forskellen mellem den mindste methylerede ovarietumoren prøve og den mest methylerede blodprøve for hver probe (fig. 1 og 2B) (Materialer og metoder ). De 554 prober (517 unikke gener) med højere DNA-methylering i en hvilken som helst af de ovarietumorer i forhold til de to normale blodprøver blev opbevares til senere evaluering (fig. 1 og 2C). Vi næste udført bekræftende analyser med top 15-klassificeret markører (fig. 1 og 2D). Valget af test kun denne begrænsede antal markører var motiveret af omkostnings- og patientprøve tilgængelighed begrænser.

A, de 12,194 markører tilbage efter fjernelse af sonderne, der mislykkedes i nogen af ​​prøverne, og af sonderne indeholdende SNP’er eller repetitive elementer. Markers rangeres i en stigende orden baseret på den gennemsnitlige DNA methylering β værdi af de to PBL prøver. B, 8,701 markører tilbage efter eliminering prober med DNA methylering β values≥0.2 i nogen af ​​de to PBL-prøver. Prober blev rangeret i en faldende orden baseret på forskellen i DNA-methylering mellem tumoren med den laveste β-værdi (T

L) og PBL prøven med den højeste β værdi (PBL

H). C, de 517 markører med højere DNA-methylering værdier i nogen af ​​tumoren end i nogen af ​​PBL-prøver. Markørerne rangeres i en faldende orden baseret på forskellen mellem tumorerne og PBL DNA-methylering værdier. D, de top-rangeret 15 markører, der blev skiftet til den MethyLight platform for yderligere kontrol.

Uafhængig vurdering af reproducerbarhed af de øverste 15-klassificeret beslutningstagere

Da antallet af æggestokkene cancer prøver, der anvendes i screeningen skridt var relativt lille, tog vi fordel af de offentligt tilgængelige TCGA DNA methylering data på serøse ovariecancer [28] for at bekræfte resultaterne af de 15 top-rangerede markører i en uafhængig større datasæt. Denne analyse blev lettet af det faktum, at TCGA data blev dannet ved anvendelse af den samme teknologi som i vores studie. Fordelingen af ​​DNA methylering beta-værdier for alle 15 markører i de to tumor datasæt (nærværende undersøgelse (PS) og TCGA) i sammenligning med et sæt af ti raske kontrolpersoner PBL prøver er vist i figur 3. Rækken af ​​DNA methylering værdier i vores eksperimentelle sæt af 41 serøs, mucinous, klar-celle, og endometrioide ovariecancere svarede til det af de 284 serøs ovariecancer prøver fra TCGA, med både viser meget højere DNA methylering niveauer end i de ti raske kontrolpersoner PBL-prøver. Resultaterne afveg ikke når analysen var begrænset til 29 af de 41 patienter med ovariecancer med serøs histologi (data ikke vist).

Infinium-afledte beta værdier (Y-akse) til toppen 15- sorteret markører blev sammenlignet i den foreliggende undersøgelse (PS) datasæt (41 ovariecancere af blandet undertyper), den TCGA datasæt (284 serøse ovariecancere) og ti normale PBL-prøver. De vandrette linjer repræsenterer medianværdier for hver gruppe.

MethyLight analyser udvikling og verifikation i kontrolprøver for de 15 top-rangerede markører

Vi næste omformede de 15 markører til mere følsomme PCR-baserede DNA-methylering afsløring platforme, MethyLight og Digital MethyLight. I modsætning Illumina Infinium DNA-methylering sonder, der assay status DNA methylering af en enkelt cytosin, MethyLight-baserede primere og probe forhøre overensstemmende DNA-methylering af flere methylerede cytosiner samtidigt over en kort genomiske region. Følgelig kan MethyLight resultater for et specifikt genetisk locus adskiller sig fra dem registreret af en Illumina Infinium probe på samme sted på grund af tilstedeværelsen af ​​tilstødende cytosiner og variationer i primerne /probe positionering. Vi var succes med at udvikle MethyLight reaktioner i 12 af de 15 kandidatlande markører (tabel S2). De DNA sekvenser tilgrænsende til Infinium målrettede cytosiner til tre af de 15 markører ikke var egnet til MethyLight design (Fig. 4). En yderligere markør blev elimineret fra rørledningen, fordi det ikke lykkedes at forstærke

in vitro

methylerede (M.SssI-behandlet) kontrol DNA (fig. 4). Vi udsættes de resterende 11 markører til en stringent tæller skærm mod overskydende mængder af PBL-DNA (50 ng) fra to sygdomsfri postmenopausale kvinder, til at udelukke DNA methylering markører, der ville præsentere baggrund problemer for den følsomme påvisning af æggestokkene DNA methylering markører i blodet . Denne MethyLight-baseret skærm afkaster otte markører med meget lave niveauer af DNA methylering i PBL (MethyLight cyklus tærskler (Ct) højere end 35 i begge prøver).

Tekniske kontroller for MethyLight (ML) platform førte til eliminering af fire markører (krydsede grå kasser) på grund af at designe uforenelighed og manglende forstærke

in vitro

denatureret DNA positiv kontrol for MethyLight reaktioner (M.SssI test). Elleve markører blev testet i normale PBL prøver ved anvendelse af et overskud af PBL-DNA (50 ng). Markører med en cyklus tærskel (Ct) højere end 35 (blå bokse) i de to normale PBL prøver blev lagret, og markører med en Ct mindre end 35 (gule kasser) blev elimineret. MethyLight analyser med Ct-værdier 35 indikerer mærkbart påviselige mængder af denatureret DNA ved disse loci. Yderligere testning i normale kontrol plasmaprøver (100 pi) resulterede i elimineringen af ​​syv af de otte resterende markører. Et resterende markør,

IFFO1

, blev testet i 15 ovariecancer af forskellige histologiske undertyper. De MethyLight resultater for den normale plasma kontrol og de ovariecancer prøverne udtrykt som procent methyleret Reference (PMR). Blå kasser repræsenterer PMR værdier mindre end 10, gule felter angiver PMR værdier mellem 10 og 50, mens røde kasser betyde PMR værdier højere end 50. De typer af ovarietumorer anvendt i analysen er: klare celle carcinomer (CC), blandet klar celle og endometrioide (CC /E), endometrioide (E), mucinøs (M), og serøs (S).

Disse otte markører blev efterfølgende evalueret på koncentrerede gratis plasma DNA-prøver fra ti raske postmenopausale kvinder, hvilket giver kun en markør,

IFFO1

, med næsten ikke målbart DNA methylering i alle disse kontrol plasmaprøver (PMRS 5) (fig. 4). Vi næste testede

IFFO1

på 15 ovarietumorer af forskellige histologiske undertyper, hvoraf 14 er også blevet anvendt i den indledende screening trin (tabel S1), og fundet signifikante niveauer af DNA methylering (PMR 20) i alle tumorerne analyseret (fig. 4). Dette er i overensstemmelse med Infinium DNA methylering analyse fra den samme tumor prøver (fig. 2). Denne markør blev derfor udvalgt til efterfølgende klinisk kontrol i et sæt af serumprøver opsamlet i længderetningen fra et separat sæt ovariecancerpatienter.

IFFO1 genpromotor DNA-methylering (IFFO1-M) markør ydeevne i serumprøver

Vi vurderede først udførelsen af ​​IFFO1-M markør i serumprøver opnået fra otte raske ældre kvinder kontroller og 16 æggestokkene kræftpatienter med fremskreden (stadium III og IV) sygdom ved hjælp af den meget følsomme og kvantitativ Digital MethyLight assay [23]. De klinisk-patologiske egenskaber ved ovariecancerpatienter inkluderet i denne analyse er opsummeret i tabel S3. Udgangen for Digital MethyLight måles ved at tælle de individuelt methylerede DNA-molekyler. Vi opdaget IFFO1-M markør i alle patientprøver. I modsætning hertil blev IFFO1-M detekteres ved meget lave niveauer i kun to af de otte kontrolprøver (fig. 5A). Ti af patienten sera havde mere IFFO1-M DNA-methylering end nogen af ​​de positive kontrolprøver. Receiver Operating Karakteristika (ROC) analyse med en anslået areal under kurven på 0,95 [95% CI, 0,8359 til 1] viste en god diskriminerende potentiale for IFFO1-M markør (fig. 5B). Da disse resultater kunne have været påvirket af forskelle i den måde kontrol- og case prøver blev indsamlet og behandlet vi fortsatte afprøvning af IFFO1-M i serielt indsamlede serumprøver fra patienter med ovariecancer.

A, IFFO1-M niveauer (udtrykt som antallet af IFFO1-M methylerede molekyler påvist i en ml sera) i baseline prøver af 16 patienter og otte normale kontroller blev bestemt ved Digital MethyLight. Antallet af molekyler i patientens # 1 er en tilnærmelse, da tællinger højere end 15 hits /96-brønds plade /100 pi testede kunne afspejle tilstedeværelsen af ​​mere end ét molekyle /brønd. Den histologiske subtype af tumorerne er angivet i parentes som følger: serøs (S), mucinøs (M), og endometrioide (E). Stjernerne angiver patienten, fra hvem prøverne blev anvendt i det efterfølgende longitudinal analyse. B, Receiver Operating karakteristik for IFFO1-M. AUC = areal under kurven.

Verifikation af IFFO1-M markør i en langsgående skærm til tilbagevendende kræft i æggestokkene

Vi testede, om IFFO1-M markør kunne måle sygdomsbyrde i serielt indsamlet serumprøver fra patienter med ovariecancer og sammenlignet dens præstationer med den for CA-125. Dette inden for individet sammenligning eliminerer behovet for kontrolprøver da hver patient tjener som hendes egen kontrol. Serumprøver blev indsamlet omkring tidspunktet for kirurgi (baseline prøver) og under efterfølgende opfølgende undersøgelser for 16 patienter kræft i æggestokkene. Baseline prøver fra hver af disse 16 patienter blev anvendt i den foregående analyse (Tabel S3). Elleve af de baseline blev udtaget før operationen (middelværdi = 11 +/- 5 dage), mens fem af dem blev indsamlet efter operationen (middelværdi = 13 +/- 10 dage) (tabel S4). I gennemsnit blev 15 serumprøver (mellem 8 og 23) indsamlet på opfølgende besøg fra hver af patienterne, med en gennemsnitlig opfølgningstid på 92 uger (der spænder fra 37 til 246 uger).