PLoS ONE: Virkningen af ​​3’UTR Varianter om differentieret ekspression af kandidatlandene Cancer Resistensundersøgelser Gener

Abstrakte

Varianter i regulatoriske regioner forventes at spille en vigtig rolle i sygdom modtagelighed almindelige sygdomme. Polymorfier mapping til microRNA (miRNA) bindingssteder er blevet vist at forstyrre evnen af ​​miRNA til at målrette gener resulterer i differentiel mRNA og proteinekspression.

blev identificeret Skin tumor modtagelighed 5 fotos (

Skts5

) som et sted, der giver modtagelighed for kemisk induceret hudkræft i NIH /Ola ved SPRET /Udavlede F1 tilbagekrydsninger. At afgøre, om polymorfier mellem stammer, der mappet til formodede miRNA bindingssteder i den 3′-utranslaterede region (3’UTR) af gener på

Skts5

påvirket udtryk, vi gennemført en systematisk evaluering af 3’UTRs af kandidatgener på tværs af denne locus. Ni gener havde polymorfier i deres 3’UTRs som passer liftkontakterne data og otte af disse indeholdte polymorfier mistænkes for at forstyrre eller indføre miRNA bindende. 3’UTRs af seks gener,

Bcap29

,

Dgkb, HBP1, Pik3cg, Twistnb

, og

Tspan13

forskelligt påvirket luciferase udtryk, men syntes ikke at være forskelligt reguleret af de evaluerede miRNA forudsagt at binde til kun én af de to isoformer. 3’UTRs fra fire yderligere gener valgt fra locus, der passer mindre strenge kriterier blev evalueret.

Ifrd1

ETV1

viste forskelle og indeholdt polymorfier forudsiges at forstyrre eller oprette miRNA bindingssteder men viste ingen forskel i reguleringen af ​​de testede miRNA. Sammenfattende flere 3’UTRs med formodede funktionelle varianter mellem modtagelige og resistente stammer af mus påvirket differentieret udtryk uafhængigt af forudsagt miRNA bindende

Henvisning:. Skeeles LE, Fleming JL, Mahler KL, Toland AE (2013) Den Virkningen af ​​3’UTR Varianter om differentieret ekspression af kandidatlandene Cancer Resistensundersøgelser Genes. PLoS ONE 8 (3): e58609. doi: 10,1371 /journal.pone.0058609

Redaktør: Akio Kanai, Keio Universitet, Japan

Modtaget: 16 oktober, 2012; Accepteret: 6 februar 2013; Udgivet: 5 mar 2013

Copyright: © 2013 Skeeles et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet delvist fra MGO RSG-07-083 fra American Cancer Society, CA134461 fra National Cancer Institute og OSU Comprehensive Cancer center. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Toland er en akademisk Redaktør af PLoS ONE. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Mus spretus

mus er resistente over for hudkræft i forhold til

mus musculus

mus. I tidligere bindingsstudier af dimethylbenz [a] anthracen (DMBA) /12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) – induceret hudcancer en række hudkræft modtagelighed loci blev identificeret i SPRET /udavlede af NIH /Ola F1 tilbagekrydsning mus [1] – [4]. Linkage undersøgelser blev også udført med SPRET /eij af FVB /N, SPRET /eij af NIH /Ola og STF /Pas af NIH /Ola F1 tilbagekrydsning mus, som identificerede yderligere modtagelighed loci. En af hudens følsomhed loci,

Skin tumor modtagelighed 5 fotos (

Skts5

), blev fundet i SPRET /udavlede af NIH /Ola krydser, men ikke i STF /Pas af NIH /Ola F1 eller SPRET /eij af FVB /N krydser [3], [4]. Lift resultater for SPRET /eij ved NIH /Ola var tvetydige for denne region. Sekvens analyser af 54 gener og kodning elementer på tværs af en 14-Mb peak kobling region på

Skts5 ført til identifikation af en række kodning ændringer i overensstemmelse med koblingen analyser (Mahler et al. 2008).

Differential genekspression postuleres at være så vigtigt, hvis ikke vigtigere, for sygdom modtagelighed som ikke-synonyme kodning ændringer [5]. Genekspression forskelle på grund arvelige faktorer kan være forårsaget af variationer i enhancer eller promotor- bindingssteder, variationer i epigenetisk regulering påvirker methylering eller chromatin modifikationer, variationer i ekspression af trans-virkende faktorer eller forskelle i regulering af microRNA (miRNA) [6] – [9]. Single nucleotide (SNP’er) henhørende specifikt i 3′-utranslaterede region (3’UTR) af gener kan påvirke mRNA-stabilitet og translation gennem virkninger på polyadenylering og regulatorisk protein-mRNA og miRNA-mRNA-interaktioner [10] – [12]. Foreløbige undersøgelser på mennesker har identificeret variationer i 3’UTR af gener, der synes at påvirke kræftrisiko ved at forstyrre normal miRNA bindende [13], [14]. En sådan variant i

KRAS2

gen øger risikoen for lungekræft og kræft i æggestokkene ved at ændre evne miRNA

Lad-7

at binde [15], [16]. En anden undersøgelse i mus så på miRNA supplerende lokaliteter i tre miRNA, der blev indført eller forstyrret af SNP’er ved allel-ubalance sekventering [17]. Forskelle i udtryk passer med RNA-sekvensdata de blev observeret for en stor procentdel af formodede målgener, hvilket tyder på, at variationer i 3’UTRs har en central rolle i genekspression forskelle mellem individer.

For at hvis polymorfier i bestemme formodede miRNA bindingssteder blev påvirker genekspression og kunne være funktionelle kandidater til

Skts5

, vi udførte en systematisk analyse af 3’UTR regioner for generne i hele locus. Vi identificerede sekvens varianter i ni gener, der passer med koblingsanalyse (var polymorfe mellem SPRET /udavlede og NIH /Ola og ikke forskellige mellem STF /PAS og NIH /Ola eller SPRET /eij og FVB /N). SNPs fra otte af disse 3’UTRs blev forudsagt at kortlægge til formodede microRNA bindingssteder. Yderligere 18 gener var polymorfe mellem SPRET /udavlede og NIH /Ola og SPRET /eij og FVB /N men ikke mellem STF /PAS og NIH /Ola. Her beskriver vi virkningerne af varianter fra disse kandidat modtagelighed gener på udtryk.

Materialer og metoder

Animal materiale og cellelinjer

Ingen levende dyr blev anvendt i denne undersøgelse ; eksisterende DNA og væv blev leveret af samarbejdspartnere eller via kommercielle kilder. Den UCSF og University of Roswell Park Institutional Animal Care og Brug udvalg (IACUC) godkendte den oprindelige dyr arbejde, som producerede prøverne anvendt i denne undersøgelse. Laboratorie oprindelsen af ​​hver af stammerne af mus i undersøgelsen er som følger: STF /PAS (indavlede linje vedligeholdes af Institut Pasteur), SPRET /eij (indavlede linje vedligeholdes af Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), udavlede

spretus

(SPRET /udavlet, udavlede linje vedligeholdes af Hiroki Nagase, Roswell Park Institute), FVB /N (indavlede linje vedligeholdes af Jackson laboratorier) og NIH /Ola (indavlede linje vedligeholdes af Allan Balmain). NIH /Ola og SPRET /udavlede er homozygote tværs

Skts5

. Væv til NIH /Ola mus blev leveret af Dr. Allan Balmain og væv til SPRET /udavlede mus blev leveret af Hiroki Nagase. DNA blev isoleret fra hale eller milte fra SPRET /udavlede og NIH /Ola mus under anvendelse af standardmetoder [18]. SPRET /eij og FVB /N-DNA og væv blev indkøbt fra Jackson Laboratories. STF /PAS-DNA var en gave fra Xavier Montagutelli, DVM, PhD af Institut Pasteur. C5N blev en ikke-immunogen murin keratinocytcellelinje opnået fra Allan Balmain, vedligeholdes i 1x Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin antibiotikum.

Sequence analyse

3’UTRs af 39 gener kortlægning til

Skts5

som vi ikke havde sekvensdata for alle stammer, der anvendes i koblingen analyser blev identificeret ved hjælp af Ensembl databasen bygger 35-48 . Vi har designet PCR primere bruger Integrated DNA Technologys SciTools PrimerQuest web-baseret program [https://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest; San Diego, CA]. PCR-produkter blev behandlet med Exo /SAP-IT (USB, Cleveland, OH) for at fjerne enkeltstrenget DNA. Automatiseret sekventering af PCR-produkter blev udført på et ABI 3700 (Applied Biosystems /Life Technologies, Carlsbad, CA) ved standardmetoder. Primere anvendt til PCR blev også anvendt til sekventering. Frem og omvendt rækkefølge læser blev analyseret og sammenlignet ved hjælp Lasergene /DNAstar 3.0 (DNASTAR, Madison, WI). De sekvens spor blev inspiceret visuelt, når en nukleotid substitution blev angivet.

identifikation af potentielle microRNA bindende steder i

​​3’UTR polymorfier, der blev observeret kun mellem NIH /Ola og SPRET /udavlede blev vurderet til afgøre, om de forstyrret eller indføres

i silico

forudsagte microRNA bindingssteder. Fire programmer blev anvendt: Miranda (www.microRNA.org) [19], MicroInspector (https://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/) [20], Patrocles finderen (www.patrocles.org) [21] og MicroSNiPer (https://cbdb.nimh.nih.gov/microsniper/getSeqByNM.php) [22]. Miranda tilladt os at forudsige, om vores SNPs af interesse forstyrret miRNA bindingssteder i muse henvisningen stammen, som var meget lig NIH /Ola 3’UTRs. De øvrige tre programmer tillader unikke sekvenser, der skal analyseres for microRNA bindingssteder. For lokaliteter forudsagt af MicroInspector, vi først overvejet dem, der havde en forudsagt minimum fri energi (MFE) er større end -15 kcal /joule i en form og en MFE på mindre end -20 kcal /joule i anden form. Når revurderet, kun dem, der blev anslået til at have en MFE på mere end -18 kcal /joule i en form og en MFE -22 kcal /joule eller derunder i anden form, som det tidligere er blevet anvendt til

Mus musculus

[20], blev yderligere testet eksperimentelt. -22 Kcal /J eller mindre blev betragtet stærk binding og -18 kcal /J eller højere blev betragtet ingen eller meget svag binding. Patrocles og MicroSNiPer tillader sammenligning af to unikke sekvenser for forskelle i forudsagte bindingssteder. MicroSNiPer kræver SNP’er til optagelse i forudsigelsen programmet, så dette værktøj ikke var i stand til at forudsige sites oprettet eller forstyrret af indsættelser eller sletninger. Brug MicroInspector, Patrocles, og MicroSNiPer, vi plukket kandidat miRNA, der blev forudsagt at binde sig til kun musen stamme (NIH /Ola eller SPRET /udavlede), der viste lavere udtryk som målt ved vores 3’UTR luciferaseassaykit udtryk og som indeholdt en polymorfi i miRNA bindende site, der passer med musen linkage resultater.

Kloning

En del af hver kandidat gen 3’UTR som omfattede polymorfe sites, der passer med musen kobling og blev forudsagt til interferere med miRNA binding blev klonet i Ciontech pGL3 kontrol vektor (Mountain View, CA) (tabel S1). Vektoren blev lineariseret ved omvendt PCR (IPCR) under anvendelse Advantage HD Polymerase Mix (Clontech) ifølge producentens protokol. IPCR primere blev designet ved hjælp IDT PrimerQuest software. Lineære blev separeret fra cirkulær vektor ved anvendelse af QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Frederick, MD). PCR-primere til kloning ved hjælp Clontech In-Fusion HD kloning kit protokol blev udformet under anvendelse IDT PrimerQuest software (tabel S2). PCR-produkter blev amplificeret fra NIH /Ola og SPRET /udavlede DNA, oprenset og klonet ind i vektoren 3 ‘for luciferasegenet ved rekombination under anvendelse Clontech In-Fusion HD kloning kit, ifølge producentens protokol. Plasmid-DNA blev analyseret ved restriktionsfordøjelse og kloner blev sekvensen verificeret ved Sanger-sekventering.

stedorienteret mutagenese

For gener, hvor NIH /Ola eller SPRET /udavlede 3’UTR var vanskeligt at klon, polymorfe sites, der passer med musen binding blev ændret ved steddirigeret mutagenese (SDM) ved anvendelse plasmider indeholdende 3’UTR på den anden stamme som skabelon. SDM primere blev udformet under anvendelse af Stratagenes QuikChange Primer Design Program, og SDM blev udført under anvendelse Strategene s QuikChange Lightning Multi steddirigeret mutagenese kit ifølge producentens anbefalede betingelser (Agilent, Santa Clara, CA). Muterede plasmider blev sekvensen verificeret.

Transfektioner /luciferaseassays

C5N celler blev co-transficeret med pGL3 In-Fusion produkter, pRL-TK Renilla ildflue-luciferase vektor (Promega, Madison, WI) , og præ-miRNA eller Mirvana mimic miRNA forstadier (Ambion /Life Technologies, Grand Island, NY) for miRNA assays. Transfektioner blev udført ved hjælp af Lipofectamine med Plus Reagens (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island NY) for 3’UTR DNA transfektioner og Lipofectamine 2000 (Invitrogen) for transfektioner hjælp plasmider (600 ng /brønd af hver plasmid) og miRNA forstadier eller scrambled kontroller ( 13 pmol /brønd i en 12-brønds plade). Fireogtyve timer efter transfektion protein blev isoleret ved hjælp af M-PER (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL), og RNA blev isoleret under anvendelse Ribozol (ISC Bioexpress, Kaysville, UT). For luciferase målinger blev en D-Luciferin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blanding indeholdende DTT og glycylglycin tilsat til 30 pi isoleret protein i en Vertias Microplate Luminometer hjælp af Veritas Luciferase Assay programmet (Promega, Madison, WI). For at aktivere reaktionen en ATP mix, med DTT, glycylglycin, EGTA, magnesiumsulfat

4, og K2PO

4, blev tilføjet. En kontrol reporter assay inkluderet native Coelenterizine (Nanolight Technologies, Pinetop, AZ) med ATP, DTT, glycylglycin, EGTA, magnesiumsulfat

4, og K2PO

4, tilføjes 30 pi isolerede protein efter Promega Renilla-protokollen. Luciferase relativ lys enhed læser blev normaliseret til Renilla luciferase. Luciferase-forhold i forhold til mock-transficerede celler er vist. Transfektioner og luciferase assays blev udført mindst to gange for hver 3’UTR sæt af konstruktioner og miRNA assay med undtagelse af

MIR-3064-3p

(

Pik3cg

), som kun blev testet gang og viste overbevisende resultater af nogen forskelle. Student t-test blev anvendt til at beregne betydningen af ​​udtryk forskelle.

Yderligere eksperimentelle betingelser blev testet for transfektioner med

Twistnb

3’UTRs sammen med

miR-3074-5p

og /eller

miR-691

. Eksperimenter blev udført som beskrevet ovenfor, bortset fra at C5N celler blev høstet ved 24, 48 og 72 timer under anvendelse af en højere koncentration af miRNA (26 pmol) eller begge miRNA sammen (26 pmol hver). En lavere dosis af transficerede miRNA (7 pmol) eller begge miRNA sammen (7 pmol hver) blev også evalueret for en effekt af

Twistnb

3’UTRs efter 24 og 48 timer. Yderligere forsøg på at vurdere virkningerne af

miR-3074-5p

på

Twistnb

isoformer inkluderet transfektioner i C5N celler med en anti-miRNA for

miR-3074-5p

eller en negativ kontrol-hæmmer efter 24 og 48 timer efter transfektion ved to koncentrationer (13 pmol og 30 pmol).

bekræftelse af miRNA transfektion ved kvantitativ PCR (qPCR)

for at bekræfte miRNA transfektion, RNA var isoleret som beskrevet ovenfor. Revers transkription (RT) blev udført under anvendelse Applied Biosystem s Multiscribe RT kit ifølge producentens anbefalede protokol (LifeTechnologies /Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Taqman qPCR prober for miRNA blev købt fra Applied Biosystems.

Sno202

blev anvendt til at beregne relative udtryk. qPCR blev udført tre gange for hver prøve. Eksperimenter inkluderet no-RT og kontroller uden skabelon. Cycle tærskel (CT) værdier blev midlet tværs tredobbelte og delta CT-værdier blev beregnet mellem hver test miRNA og mock kontrol.

Identifikation af microRNA kandidater

For at forfine vores liste over kandidat microRNA (miRNA) analyserede vi både NIH /Ola og SPRET /Udavlede former af disse bindingssteder i to minimale fri energi (MFE) forudsigelsesværktøjer, RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/) [23] og RNAcofold (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAcofold.cgi) [24]. Vi yderligere forfinet vores liste over kandidat 3’UTRs til dem, hvis SNPs blev forudsagt at fremkalde en 5 kcal /J eller større forskel i miRNAbinding MFE mellem NIH /Ola og SPRET /udavlede af både forudsigelsesværktøjer (Tabel S3).

Evaluering af mRNA-ekspression af qPCR

for at identificere gener, der viser forskellen udtryk, RNA blev isoleret fra haler af NIH /Ola og SPRET /Udavlede mus ved hjælp Trizol (Invitrogen) i henhold til producentens anbefalede betingelser. Et mikrogram af RNA fra hvert dyr blev vendt transkriberet under anvendelse iScript cDNA syntesekit (Bio-Rad, Hercules, CA). For at vurdere mRNA udtryk for kandidat

Skts5

gener, Taqman sonder blev købt fra Applied Biosystems (Life Sciences Technologies). Hver prøve blev målt i tre eksemplarer. Tre kontrol gener,

L19

,

PPIA

og

HPRT

, blev brugt til at beregne relative udtryk og den gennemsnitlige forskel i udtryk blev beregnet på tværs af alle tre kontroller. Eksperimenter inkluderet vand blanke og ingen-RT kontrol. Betydningen af ​​differentieret udtryk blev bestemt ved Student T-tests.

Resultater

Identifikation af kandidat 3’UTRs for undersøgelsen

Skts5

er en tumor hud modtagelighed locus tidligere identificeret i F1 tilbagekrydsning mus mellem modtagelige NIH /Ola og SPRET /Udavlede stammer [4], [25]. Forbindelse til dette locus blev ikke fundet i F1 tilbagekrydsninger mellem NIH /Ola og STF /PAS eller mellem FVB /N og SPRET /eij, andre hud resistente stammer af Mus spretus tyder på, at potentielt funktionelle sekvens varianter, der var til stede i SPRET /udavlede, men ikke i STF /PAS eller SPRET /eij, kunne betragtes som kandidat varianter. I tidligere undersøgelser, vi sekventeret kodning exoner for 54 gener på det minimale

Skts5

kobling region i stammer af mus modtagelige for hudkræft (NIH /Ola og FVB /N) og mus resistente til hudkræft (SPRET /udavlede , SPRET /eij, STF /PAS) [4]. I vores indledende undersøgelse, vi ikke fuldføre genotypning af hele 3’UTRs for alle gener i alle stammer af mus, der anvendes i undersøgelsen. For at generere manglende sekvensdata, vi sekventeret den længste 3’UTR udgave af 39 gener for de stammer, som vi manglede data, primært STF /PAS. Af de gener, vurderede, at der var 24 3’UTR polymorfier fra ni gener, der passer til de mest konservative sammenkædning af data i, at de var kun polymorfe mellem NIH /Ola og SPRET /udavlet, men var ikke polymorfe mellem STF /PAS og NIH /Ola eller mellem FVB /N og SPRET /eij (tabel 1).

Effekt af 3’UTR varianter på udtryk

Vi forventede, at kun en delmængde af de 24 3’UTR polymorfier ville forudsiges at ændre miRNA binding. For at identificere disse SNPs, vi indtastet både NIH /Ola og SPRET /Udavlede sekvenser i to miRNA bindende forudsigelse programmer, MicroInspector [20] og Miranda [19]. Femten polymorfier blev forudsagt at påvirke miRNA binding.

Cbll1

var det eneste gen med en 3’UTR variant montering af binding, der ikke har mindst én kandidat SNP forudsagt at forstyrre eller indføre et miRNA websted (tabel 2 Tabel S3, figur S1).

for at afgøre, om 3’UTRs polymorfier påvirket udtryk, vi klonede fragmenter af 3’UTRs på 245 til 1652 bp i størrelse, som indeholdt varianter af interesse for de otte gener med polymorfier montering af sammenkædning af data og forudsagde at interferere med miRNA-binding (tabel S1). Det 3’UTR for

Cbll1

blev også klonet. Efter kloning af 3’UTR fragmenter af

Bcap29

,

Cbll1

,

Dgkb

,

HBP1

,

Meox2

,

Pik3cg

,

Stxbp1

,

Tspan13

, og

Twistnb

, ind i pGL3-kontrol luciferase vektor, vi transficeret konstruktionerne i C5N normale keratinocytceller og måles luciferase niveauer af de to isoformer. Vi antager, at hvis varianten i 3’UTR blev forudsagt til at vise miRNA binding kun i én stamme, bør der være mindre luciferaseekspression forhold til varianten ikke forudsiges at binde miRNA. De uoversatte regioner for

Bcap29

,

Dgkb

,

HBP1, Pik3cg

,

Stxbp1

, og

Twistnb

havde polymorfe steder, der blev forudsagt at både indføre og forstyrre formodede miRNA bindingssteder. Således for disse seks gener, var det ikke klart, hvordan polymorfi kan påvirke udtryk. Af de ni 3’UTRs vurderede, seks viste statistisk signifikant differentiel luciferaseekspression mellem stammerne (figur 1 og data ikke vist). De mest markante forskelle i luciferase udtryk var i 3’UTRs af

HBP1

Bcap29

(figur 1). For mange af de gener, både 3’UTR isoformer viste nedsat luciferase udtryk i forhold til pGL3-vektoren tyder på, at miRNA eller andre reguleringsmekanismer har virkninger på begge 3’UTR former.

Repræsentative relative luciferaseenheder normaliseret at spotte for der fremkommer pGL3 luciferase vektor (mørkegrå), NIH 3’UTR (sort) og SPRET /udavlede 3’UTRs (lysegrå) i seks gener. P-værdier for forskellen udtryk mellem NIH /Ola og SPRET /udavlede er angivet. A.

Bcap29

; B.

Dgkb

; C.

HBP1

; D.

Pik3cg

; E.

Twistnb

; F.

Tspan13

.

Identifikation af varianter, der påvirker formodede microRNA bindingssteder

Som varianter i 3’UTR regioner har vist sig at påvirke miRNA binding og efterfølgende gen og protein udtryk [15], [16], vi hypotese, at 3’UTR varianter montering af sammenkædning af data kunne påvirke genregulering og dermed påvirke forskellen i kræft modtagelighed mellem NIH /Ola og SPRET /Udavlede mus. Seks af de ni 3’UTRs evalueret,

Bcap29

,

Dgkb

,

HBP1

,

Pik3cg

,

Twistnb

Tspan1

viste forskellen luciferaseekspression mellem NIH /Ola og SPRET /udavlet, men da mange af disse havde flere SNPs, der blev forudsagt at påvirke binding, vi ønskede at prioritere hvilke SNP’er og miRNA var mest tilbøjelige til at gøre dette. Hertil kommer, som nogle SNPs tidligere blev bestemt til både indføre og forstyrre potentielle bindingssteder, vi ønskede at bruge vores luciferase data til at vælge miRNA, der ville passe udtrykket data. For yderligere at forfine vores kandidat SNP listen og vælge potentielle miRNA for undersøgelsen, sekvens fra 3’UTRs af gener med kandidat varianter blev vurderet ved hjælp af yderligere miRNA bindende forudsigelse programmer Patrocles, og MicroSNiPer. Vi har også brugt MicroInspector, at identificere bindingssteder med en MFE på mindre end -22 kcal /J i en form (stærk bindende) og større end -18 kcal /J i anden form (svag eller ingen binding), som anbefales til Mus musculus [20]. For alle forudsagte miRNA bindingssteder, bestemmes vi i hvilket omfang polymorfismen blev forudsagt at påvirke styrken af ​​bindingen. Brug RNAhybrid og RNAcofold, vi beregnet en fri energi af binding af de formodede miRNA. Vi testede udtryk forskelle i alle miRNA interaktioner, der viste forudsagt forskelle på mere end 5 kcal /J mellem de to variant former i begge forudsigelsesværktøjer. Alle seks gener med varianter, som passer liftkontakterne data og påviste forskelle i luciferaseekspression havde varianter med betydelige forskelle i forudsagt fri energi binding af miRNA, hvoraf nogle indeholdt SNP’er i den forudsagte frø region (tabel 2, fig S1).

Effekt af microRNA på udtryk

for at afgøre, om de forudsagte miRNA kan påvirke luciferaseekspression forskelle i

Bcap29

,

Dgkb

,

HBP1

,

Pik3cg

,

Twistnb

og

Tspan13

, vi co-transficeret C5N celler med NIH /Ola eller SPRET /Udavlede luciferase konstruktioner og en forløber miRNA forventes at binde til varianterne overensstemmelse med binding og vores indledende luciferaseekspression data (tabel 2). Vi valgte 13 kandidatlande miRNA til evaluering. Vi begyndte vores studier ved kun at vurdere isoformen forventes at være bundet af miRNA og evalueret både isoformer, da vi så en effekt i den forventede retning af miRNA på luciferase niveauer. miRNA til

Pik3cg Hotel (

miR-707

),

HBP1 Hotel (

miR-127

,

miR-183

, og

miR-873

),

Twistnb Hotel (

miR-718

, og

miR-691

), og

Dgkb

(

miR-489

) havde ingen effekt på luciferase udtryk (figur 2A og data ikke vist).

MIR-1940

med

Tspan13

3’UTR og

miR-31

med

HBP1

3’UTR faldt luciferase ekspression af begge isoformer tilsvarende antyder, at disse miRNA bandt 3’UTRs i samme grad (Figur 2B og data ikke vist). Andre miRNA,

miR-128 (Bcap29), miR-3064-3p (Pik3cg)

,

miR-3074-5p Hotel (

Twistnb

) og

miR -485 (Dgkb)

faldt luciferase ekspression af pGL3-kontrol tom vektor i samme grad som vektoren indeholdende det klonede 3’UTR (figur 2C og data ikke vist). Disse data tyder på, at miRNA vi valgte til analyse ikke var ansvarlige for de observerede forskelle i luciferase udtryk mellem SPRET /udavlede og NIH /Ola.

Repræsentative eksperimenter viser ingen effekt af miRNA på luciferase udtryk og lignende virkninger af miRNA på begge isoformer er vist. A.

Dgkb

3’UTR med

miR-489

; B.

Tspan13

3’UTR med

MIR-1940; C. Dgkb med miR-485

. pGL3, pGL3 luciferase vektor uden indsats; NIH, NIH /Ola 3’UTR; SPRET, SPRET /udavlede 3’UTR; NC, scrambled kontrol miRNA; Mørkegrå barer, pGL3 luciferase vektor; Sorte bjælker, pGL3-vektor med NIH /Ola 3’UTR; Lys grå søjler, pGL3 vektor indeholdende SPRET /udavlede 3’UTR.

For at udelukke den mulighed, at vi mangler forskellige virkninger af miRNA på luciferase udtryk på grund af de anvendte forsøgsbetingelser, vi evalueret

Twistnb

3’UTR brug af yderligere doser af miRNA

miR-3074-5p

miR-691

og yderligere tidspunkter efter transfektion. Dette 3’UTR blev valgt til mere detaljeret undersøgelse, fordi den indeholdt varianter forudsagt at binde til frøet region begge disse miRNA (figur S1). Vi observerede ingen forskelle i virkningen af ​​miRNA sammenlignet med vores oprindelige eksperimenter (figur 3A, 3B og data ikke vist). Som miRNA kan handle i kombination, vi også vurderet

miR-3074-5p

MIR-691

i kombination på

Twistnb

3’UTR NIH /Ola og SPRET /udavlede isoformer og fandt, at resultaterne for kombinationen af ​​

miR-691

miR-3074-5p

var identiske med de af

miR-3074-5p

alene (figur 3A, 3B og data ikke vist). Disse resultater tyder på, at vores data er ikke sandsynligt, at være en artefakt af de eksperimentelle betingelser, der anvendes.

Repræsentative eksperimenter viser ikke-specifik effekt af

miR-3074-5p

og /eller

miR-691

på begge isoformer af

Twistnb

er vist ved en dosis transfektion af miRNA forstadier lav. A.

Twistnb

3’UTRs på 24 timer efter transfektion med

miR-3074-5p

,

miR-691

eller begge miRNA. B.

Twistnb

3’UTRs på 48 timer efter transfektion med

miR-3074-5p

,

miR-691

eller begge miRNA. pGL3, pGL3 luciferase vektor uden indsats; NIH, NIH /Ola 3’UTR; SPRET, SPRET /udavlede 3’UTR; NC, scrambled kontrol miRNA; Mørkegrå barer, pGL3 luciferase vektor; Sorte bjælker, pGL3-vektor med NIH /Ola 3’UTR; Lys grå søjler, pGL3 vektor indeholdende SPRET /udavlede 3’UTR.

For yderligere at vurdere effekten af ​​

miR-3074-5p

på pGL3 og NIH /Ola og SPRET /udavlede

Twistnb

3’UTRs, vi transficeret en inhibitor for

miR-3074-5p

og sammenlignet udtryk for en negativ kontrol-hæmmer og

miR-3074-5p

. Hvis miRNA var direkte rettet mod den forudsagte SPRET /udavlede

Twistnb

isoform og den observerede effekt på pGL3-vektor og NIH /Ola

Twistnb

var ikke-specifikke effekter (figur 3A og B) ville man forvente, at tilsætning af inhibitoren ville have den største effekt på pGL3-vektoren med SPRET /udavlede 3’UTR. Tilsætning af anti

MIR-3074-5p

viste den største fold stigning i luciferase ekspression af pGL3-vektoren og viste uspecifikke stigninger i ekspression af SPRET /udavlede og NIH /Ola isoformer tyder på, at den reducerede luciferase udtryk er uspecifik (data ikke vist).

Det er muligt, at endogene miRNA kan udøve maksimal knock-down og tilsætning af miRNA forløber for vore C5N celler ville fremprovokere yderligere fald i luciferase udtryk. For at evaluere denne mulighed målte vi miRNA ekspression af vores RNA høstet fra C5N celler, der var mock-transficeret. Notatet alle de miRNA evaluerede viste tegn på udtryk i den ikke-transficeret af qPCR, men de fleste af disse blev udtrykt ved relative niveauer på 1% eller mindre af den kontrol,

sno-202

. Således, for de fleste af de miRNA i denne undersøgelse, endogene niveauer af ekspression i C5N celler er usandsynligt, at forårsage maksimal knockdown af den forudsagte target 3’UTR. MikroRNA’er viser højere niveau af endogen udtryk inkluderet

miR-31 Hotel (252% af kontrol),

miR-183

(12,5% af kontrol),

miR-675-3p

(2,2% af kontrol) og

miR-3074-5p Hotel (3,7% af kontrol).

mRNA ekspressionen af ​​kandidat målgener

En af følgerne af miRNA binding til mRNA er nedbrydning af mRNA produkt og nedsat ekspression. Gener kortlægning til

Skts5

blev vurderet af qPCR at bestemme, om der var forskelle i halen mRNA mellem NIH /Ola og SPRET /udavlede. Af de testede gener indeholder kandidat 3’UTR varianter vi fundet signifikante forskelle i mRNA-ekspression i

Bcap29

,

HBP1

,

Pik3cg

,

Twistnb og Tspan13

, men ingen signifikante forskelle i udtryk for

Dgkb

og

Meox2

(figur 4 og data ikke vist). Udtryk for

Stxbp6

var for lav til sammenligning. Gener, der viste ensartede resultater mellem de Luciferaseekspression assays og qPCR er

Bcap29

(højere udtryk i NIH /Ola),

HBP1

(højere udtryk i SPRET /udavlede),

Meox2 Hotel (ingen signifikant forskel i udtryk),

Twistnb

(højere udtryk i NIH /Ola) og

Tspan13

(højere udtryk i SPRET /udavlede).

Bcap29

viste den højeste grad af forskel, cirka 15 gange højere udtryk i NIH /Ola end SPRET /udavlede (figur 4).

Dgkb

viste ingen signifikant forskel i mRNA-ekspression, men højere luciferase ekspression af NIH 3’UTR.

Pik3cg

viste højere udtryk for SPRET /udavlede mRNA, men lavere luciferase udtryk. Således fem af de syv gener vurderes af qPCR viste konsistente ekspressionsmønstre mellem mRNA og virkningen af ​​3’UTR på luciferase-ekspression. Som miRNA arbejde på to måder, den ene ved at forøge mRNA nedbrydning og den anden ved at interferere med translation, er det muligt, at nogen forskel i mRNA-ekspression ville være overholdt, også når forskellen miRNA binding finder sted [26], [27].

Kvantitativ PCR af syv gener evalueret for forskellen luciferaseekspression mellem SPRET /udavlede og NIH /Ola 3’UTR vises.