PLoS ONE: konstituerende androstan receptor ligander modulere antitumoreffektiviteten af ​​Paclitaxel i ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

Baggrund

Lunge tumorer er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden og paclitaxel har vist sig at være nyttig for patienter med lungecancer, dog erhvervet resistens er et stort problem. For at løse dette problem, en lovende mulighed er brugen af ​​konstituerende androstan receptor (CAR) ligander i kombination med kemoterapeutika mod kræftceller. Derfor ønsker vi at belyse effekten af ​​CAR ligander på den antineoplastiske effekt af paclitaxel i lunge kræftceller.

Metodologi /vigtigste resultater

Vores resultater fra cellelevedygtighedsassays udsætter CAR agonist eller inverse- agonist til mus og humane lungecancerceller modulerede den antineoplastiske virkning af paclitaxel. Bilen agonister øget effekten af ​​Paclitaxel i 6 af 7 lunge cancer cellelinjer, mens den omvendte-agonist havde ingen effekt på paclitaxel cytotoksicitet. Interessant nok mCAR agonisten TCPOBOP forøgede ekspression af to tumorsuppressorgener, nemlig WT1 og MGMT, som additivt blev forstærket i celler behandlet med CAR-agonist i kombination med paclitaxel. Også,

i silico

analyse viste, at både paclitaxel og CAR agonist TCPOBOP forankret i mCAR struktur, men ikke den omvendte agonist androstenol. Paclitaxel i sig selv øger ekspressionen af ​​CAR i cancerceller. Omsider, vi analyserede udtryk for CAR i to offentlige uafhængige undersøgelser fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). CAR udtrykkes i variable niveauer i NSCLC prøver og ingen sammenhæng med den samlede overlevelse blev bemærket.

Konklusioner /Betydning

Samlet set vores resultater viste, at CAR-agonister modulere den antineoplastiske effekt af paclitaxel i mus og humane cancercellelinjer. Denne effekt var sandsynligvis relateret ved fremme ekspressionen af ​​de to tumorsuppressorgener, nemlig. WT1 og MGMT. De fleste af NSCLC sager nuværende CAR genekspression dreje det muligt at spekulere brug af CAR modulation af ligander sammen med paclitaxel i NSCLC terapi

Henvisning:. Fukumasu H, Rochetti AL, Pires PRL, Silva ER, Mesquita LG, Strefezzi RF, et al. (2014) konstituerende androstan receptor ligander modulere antitumoreffektiviteten af ​​Paclitaxel i ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 9 (6): e99484. doi: 10,1371 /journal.pone.0099484

Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Center for Bioteknologi, Indien

Modtaget: August 6, 2013; Accepteret: 15. maj 2014 Udgivet: 24 Juni 2014

Copyright: © 2014 Fukumasu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne tak Fundação de Apoio en Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) om økonomisk støtte (proces numre:. 2008 /56.584-2; 2009 /11081-6, 2010 /00535-3, 2010 /05650-5, 2011 /05690- 0. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lunge tumorer er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden, og de er ansvarlige for anslået 1,2 millioner dødsfald om året [1]. i de sidste 30 år, flere fremskridt i lungekræft behandling er opstået med forbedring af immunterapi, strålebehandling og kemoterapi, men forstærkningen i overlevelsestiden for patienter med lungecancer fortsat være beskeden [2]. Behandlingen af ​​lungecancer afhænger af den histologiske type, tilstedeværelsen af ​​metastaser og patientens performance status. De mest almindelige behandlingsmetoder indbefatter en kombination af kirurgi (når tumorer er resektabel), strålebehandling og kemoterapi. Med hensyn til sidstnævnte er anvendelsen af ​​en eller flere cytotoksiske lægemidler på samme tid, såsom taxaner, platinforbindelser og /eller nukleosidanaloger er mest udbredt. Generelt first-line kemoterapi for avanceret ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) anvender en protokol med en taxan (paclitaxel eller docetaxel) i forbindelse med cisplatin eller gemcitabin [3].

Kræft normalt til stede som en heterogen population af maligne celler, med nogle, der er drug-følsomme og nogle, som er resistente. Cytotoksisk kemoterapi dræber narkotika-følsomme celler, men påvirker ikke resistente celler, der generelt i en sovende tilstand [4]. Når tumoren begynder at vokse igen, kemoterapi ofte mislykkes, fordi de resterende tumorceller primært lægemiddelresistent [5]. Paclitaxel, et bredt anvendt antineoplastisk lægemiddel til lungekræft, er et tubulin-bindende middel, der blokerer progression af mitose sidste ende fører til celledød ved apoptose [3]. Denne taxan har vist sig at være et nyttigt lægemiddel til patienter med lungecancer; Men som med andre kemoterapeutiske lægemidler, erhvervet resistens ved cancerceller er almindeligt forekommende.

Derfor er meget ønskeligt at forøge effektiviteten af ​​paclitaxel. Chen

et al

. [6] betragtes som en lovende mulighed involverer brug af CAR (konstituerende androstan Receptor, NR1I3) og PXR (pregnan-X-receptoren, NR1I2) ligander i kombination med kemoterapeutika, der aktiverer PXR og CAR at overvinde, eller i det mindste dæmpe multiresistens (MDR) i cancerceller. Interessant, paclitaxel er en potent aktivator PXR og inducer af P-gp-medieret lægemiddel-clearance [7]. Derudover er flere kemoterapeutiske stoffer moduleret eller metaboliseres af cytokrom P450-enzymet CYP3A4 [8], en kendt transkriptionel mål af aktiveret PXR og CAR [9], [10].

CAR og PXR er steroid nukleare receptorer kendt som master-xenosensors [11], der er i stand til at genkende strukturelt forskellige forbindelser [12]. Begge receptorer, når de aktiveres af ligander, translokere til kernen og inducerer transkriptionen af ​​adskillige gener involveret i stofskiftet lægemiddel og udskillelse, glucose og lipidmetabolisme og hormonel regulering [13], [14]. For nylig, er betydningen af ​​PXR i kræft patogenese og MDR af tumorer været et spørgsmål om forhandling, men der er opnået enighed om sin særlige rolle hidtil [15], [16]. Svarende til PXR, er også kontroversiel rolle CAR i kræft. På i den ene side blev CAR bestemmes at være essentiel for levertumor fremme af Phenobarbital [17], [18], og på den anden side CAR blev vist at være et hidtil ukendt terapeutisk mål for hjernen og hæmatopoietiske tumorer [19], [20 ]. Derfor er vores mål var at belyse betydningen af ​​CAR modulation ved selektivt ligander og at bestemme de efterfølgende virkninger på den antineoplastiske effekt af en af ​​de mest almindelige anvendte kemoterapeutiske lægemidler til lungekræft.

Materiale og metoder

Reagenser og cellelinjer

Paclitaxel, CITCO, TCPOBOP, androstenol og MTT blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Medier og reagenser til cellekultur blev erhvervet fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Trizol, oligodT primere, Hævet II-enzymet og Power SYBR Green mastermiksens var fra Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Andre reagenser var af analytisk kvalitet. Cellelinierne anvendt i dette forsøg var den musecellelinie E9 [21] og det humane cellelinjer A549, H2023, H460, H2030, H1792 og H23 [22]. Alle disse cellelinjer var en gave fra Dr. Lucy M. Anderson fra Laboratoriet for sammenlignende Carcinogenese på Frederick Nationallaboratoriet for Cancer Research (USA).

Cell eksperimenter med mus og human lungecancer celle linjer

mus lungecancer-cellelinie E9 kommer fra en spontan transformation af immortaliserede ikke neoplastiske lunge epiteliale celler isoleret fra BALB /c mus [23]. Disse celler blev dyrket i CMRL 1066-medium (Invitrogen, New York, NY), suppleret med 10% føtalt kalveserum (Invitrogen), 200 mM L-glutamin (Invitrogen) og antibiotisk cocktail (100 enheder /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin; Invitrogen) i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 7% CO

2. Humane lungecancer-cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, New York, NY), med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) plus 2% L-glutamin (Invitrogen) og 1% pen-strep (Invitrogen) i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2.

Bestemmelse af mCAR ligander virkninger på cellelevedygtighed.

E9 celler blev podet ved 2000 /brønd i 96 brønds plader (Corning, USA ) indeholdende 100 pi suppleret medium som beskrevet. Efter 24 timer blev mediet hældt ud og udskiftet med nye medier tilsat forskellige koncentrationer af CAR agonist (TCPOBOP) eller CAR invers agonist (androstenol) fra 10

-4 uM til 10 uM. Otteogfyrre timer senere, 11 pi 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT – 5 mg /ml) blev tilsat til hver brønd og formazankrystaller blev produceret over en 2 timer inkubationsperiode. Medium blev fjernet fra hver brønd og 100 pi 0,4 N HCI i isopropilic alkohol blev tilsat for at opløse krystallerne. Optisk densitet ved 540 nm blev målt i en Fluorstar Optima (BMG Labtech, Tyskland).

Bestemmelse af halvmaksimal inhiberende koncentration af Paclitaxel (IC50).

E9 celler blev anvendt med den samme protokol beskrevet ovenfor med koncentrationer fra 1 nM til 1600 nM paclitaxel.

Evaluering af virkningerne af mCAR ligander på paclitaxel cytotoksicitet.

E9 celler blev anvendt med den samme protokol beskrevet ovenfor, hvor ligander var tilsat samtidigt med IC50 for Paclitaxel og cellelevedygtighed blev evalueret som beskrevet.

Bestemmelse af HCAR ligander virkninger på cellelevedygtighed, beregning af IC50 for Paclitaxel og co-eksponering eksperimenter.

Alle disse blev udført eksperimenter med humane cancer cellelinjer som beskrevet for mus E9 cancerceller med specifikke betingelser for cellekultur som beskrevet.

Gen-ekspression analyse af mCAR

E9 celler blev podet ved 3,10

5 celler /plade i T25-plader (Corning, USA) under de samme betingelser som beskrevet ovenfor med tilsætning af TCPOBOP (10 uM), androstenol (10 uM), TCPOBOP (10 uM) plus paclitaxel (IC50), androstenol (10 uM) plus paclitaxel (IC50) eller DMSO-kun til kontrol. Totalt RNA blev ekstraheret fra fem gentagelser af hver behandling og kontrol med Trizol efter producentens anvisninger. De RNA-prøver blev derefter kvantificeret (Biophotometer, Eppendorf, Tyskland) og 260/280 ratio blev observeret. Kun prøver, som præsenteres 1.7-2.0 og påvistes god kvalitet (ikke nedbrudt) efter elektroforese analyse i en agarosegel (1,5%, Tris-bufret saltvand) blev anvendt. Således 1 ug totalt RNA blev revers transkriberet med oligodT primere og hævet II til cDNA. Alle primere blev udformet med Primer-3 software [24] og blev kørt i BLAST [25] for at verificere fravær af lokale alignments med DNA og andre muse RNA transcript sekvenser. Power SYBR Green blev anvendt til real-time PCR med primere til mCAR (NM_009803.5; F: 5′-GGGCCTCTTTGCTACAAGAT-3 ‘; R: 5′-AGGTTTTTATGGAAGTGGAGGA-3′). Husholdning anvendte gen var 18 s ribosomale RNA (NR_003278.3; F: 5’-CCTGCGGCTTAATTTGACTC-3 ‘; R: 5′-CTGTCAATCCTGTCCGTGTC-3’). Reaktionerne blev udført i en ABI Prism 7500 thermocycler (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) med Power SYBR green Master Mix reagens og analysen af ​​relativ genekspression data blev udført ifølge Delta-Delta-CT-metoden [26 ].

PCR vifte RT

2 profiler analyse

RT

2 Profiler Mouse onkogener og tumorsuppressorgener PCR Array (PAMM-502Z, SABiosciences, USA), der indeholder 84 gener, der fremmer onkogenese, plus husholdning gener og kontrol, blev brugt til at analysere virkningerne af TCPOBOP plus paclitaxel-relateret genekspression i E9 celler. Celler blev podet og behandles som beskrevet ovenfor, blev totalt RNA ekstraheret med RNeasy Mini kit (Qiagen, USA) og tre gentagelser per behandling, hvor poolet til analyse (eksperiment udført to). Pooled RNA blev revers-transkriberet med First Strand kit (SABiosciences), kombineret med SYBR Green /ROX PCR Master Mix (SABiosciences), og tilsat til hver brønd i RT2 Profiler PCR-plade indeholdende afdelt gen-specifik primer sæt. Reaktionen blev kørt på en ABI Prism 7500 thermocycler. Dataanalyse var baseret på Ct-metoden, med normalisering til fire forskellige husholdning gener. Fold ændringer i 2X (op eller nedregulering) blev anset for analyse.

I silico

analyse for docking af mCAR ligander og paclitaxel i mCAR struktur

Computational analyse blev udført ved anvendelse af krystalstrukturen af ​​CAR receptor co-krystalliseret med androstenol (pdb 1XNX) [27] og TCPOBOP (pdb 1XLS) [28]. Receptor mål- og docking ligander blev fremstillet ved anvendelse af Chimera [29]. Den molekylære overflade af målet blev genereret baseret på algoritmen udvikling [30]. Sfære generation blev udført under anvendelse af sphgen algoritmen; sfærerne blev distribueret med dock6 og vælges med “spheres_selector”. Grid generation blev opnået ved hjælp af Grid, som er fordelt som tilbehør til dock [31]. Fleksibel Dock blev anvendt til at verificere interaktioner mellem mål-CAR-receptoren og kemikalier [32]. Resultater opnået ved docking blev visualiseret og analyseret på Chimera-version 1.4.1 (build 30.365).

cBioPortal analyse af kræft Genome Atlas datasæt

cBioPortal, et værktøj udviklet af beregninger Biology center på Sloan Kettering, blev åbnet på https://www.cbioportal.org/public-portal/[33], [34]. To datasæt blev anvendt i dette arbejde: “Lung adenocarcinom (TCGA, i trykken)” med 230 tilfælde og den “Lung pladecellecarcinom (TCGA, Foreløbig)” med 489 sager på tidspunktet for analysen, marts 2014. Begge undersøgelser var anvendes til at vurdere tilstedeværelsen af ​​genmutation og kopiantal ændringer (CNA) illustreret ved “oncoprints”, ændret mRNA-ekspression og /eller DNA methylering og samlet overlevelse kurver inden for disse ændringer. For at bestemme hvilken prøve præsenteret ændret genekspression Z-score blev sat til 1,96.

Statistisk analyse

Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse, medmindre andet er angivet. Graphpad Prism 5 til vinduer (Graphpad Software, USA) blev anvendt til alle statistiske analyser udført med parametriske test som Mann-Whitney og Spearman. To-vejs ANOVA blev anvendt til sammenligninger mellem forskellige ligander virkninger på cellernes levedygtighed. Samlet overlevelse fra TCGA data blev estimeret med Kaplan-Meier kurver og Logrank p-værdier ved cBioPortal for Cancer Genomics [33], [34]. Signifikante forskelle blev anset når p. 0,05

Resultater

Bilen ligander er ikke cytotoksisk for mus eller humane lunge kræftceller

I første omgang vi evaluerede de cytotoksiske virkninger af mCAR ligander, herunder agonisten TCPOBOP og omvendt agonist androstenol, på E9 muse lungecancerceller. Udsættelse for TCPOBOP i 48 timer havde ingen effekt på E9 cellelevedygtighed, selv ved en høj koncentration (figur 1). På den anden side, den inverse-agonist androstenol inducerede en dosisafhængig stigning i celleproliferation, med mere end 60% celler end kontrolgruppen i høj koncentration (p 0,0001;. Figur 1). Disse resultater antyder, at anvendelsen af ​​mCAR agonister i muse cancerceller kan resultere i forskellige virkninger på cellelevedygtighed, selv stigende celleproliferation som observeret for androstenol.

(A) Cellelevedygtighed efter 48 timers forskellige koncentrationer af mCAR agonisten TCPOBOP eller mCAR invers-agonist androstenol. TCPOBOP har ingen virkning på cellelevedygtighed, selv ved den højeste koncentration. På den anden side, androstenol forøger antallet af E9 cancerceller dosisafhængigt (* p 0,05 – To-vejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest for behandlingseffekt). (B) Virkningerne af mCAR ligander på anti-tumor effekt af paclitaxel (IC50). TCPOBOP forøger anti-tumor effektivitet af paclitaxel ved signifikant fald cellelevedygtighed ved 1-10 uM mod kun paclitaxel-behandlede celler (p 0,05 – To-vejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest for behandlingseffekt). Den androstenol delvis afskaffer antitumoreffektiviteten af ​​paclitaxel (p 0,05 – To-vejs ANOVA efterfulgt af Tukeys multiple sammenligningstest for behandlingseffekt). (C) Genekspression af mCAR i celler behandlet med ligander alene, paclitaxel alene, eller i kombination. Ligander ændrede ikke mCAR genekspression. Bemærk, at alle paclitaxel behandlede-grupper præsenterede forøget mCAR genekspression sammenlignet med kontrolgruppen (* p 0,05 – En måde ANOVA).

Næste, vi udførte lignende forsøg i seks humane lunge cancer cellelinjer. Vi testede hvis den specifikke menneskelige CAR agonist, CITCO, og det inverse agonist androstenol fremlagde nogen cytotoksiske virkninger i disse cellelinjer. Ingen effekt blev noteret for CITCO eller androstenol selv ved den højeste testede koncentration (p . 0,05 for alle cellelinjer, Fig S1).

Bilen agonister TCPOBOP og CITCO forbedre antineoplastiske effekt af paclitaxel i mus og menneske lunge kræftceller

Vores hypotese var, at CAR modulation af dets ligander kunne ændre den anti-tumor effekt af paclitaxel, et antineoplastisk stof almindeligt anvendt til lungekræft kemoterapi hos mennesker. Først bestemte vi koncentrationen af ​​paclitaxel, som inhiberede 50% af cellelevedygtighed for hver cellelinje (IC50, tabel 1). Ved hjælp af denne koncentration, vi næste evalueret virkningerne af CAR-agonister på anti-tumor effekt af Paclitaxel ved at udsætte kræftceller til paclitaxel plus forskellige koncentrationer af en CAR agonist eller omvendt-agonist.

Når vi co -exposed muse lungecancerceller til forskellige koncentrationer af TCPOBOP plus paclitaxel på den inhibitoriske koncentration (IC50), RCA agonist forbedret paclitaxel antitumorvirkning dosisafhængigt, reducerende cellelevedygtighed med næsten 40% i sammenligning med den i celler behandlet med paclitaxel alene (p 0,05;. figur 1). På den anden side, den omvendte agonist androstenol reduceret de cytotoksiske virkninger af paclitaxel i E9 celler (p 0,05;. Figur 1). Disse resultater indikerer, at specifikke modulering af CAR ved agonisten TCPOBOP forbedrer antitumoreffektiviteten af ​​paclitaxel i E9 cancerceller.

Vi udførte dette eksperiment i seks humane lungecancer-cellelinjer, hvor co-eksponering af humant CAR ligander blev evalueret for dets virkning på citotoxicity af paclitaxel. CAR agonist CITCO signifikant forøget paclitaxel effekt i fem af de seks humane lunge cancer testede celler (p 0,05, fig. 2). På den anden side, at CAR invers-agonist androstenol medførte ingen signifikante forskelle i de cellelinier (p 0,05;. Figur 2). Disse resultater viser, at CAR agonister forbedre det antineoplastiske virkning af paclitaxel i størstedelen af ​​lungekræft cellelinier (mus og mennesker), hvilket gør dem et interessant fokus til yderligere karakterisering.

Cellelevedygtighed efter 48-agonist androstenol i kombination med paclitaxel. CITCO øger paclitaxel cytotoksicitet betydeligt i fem af seks cellelinier (* p 0,05 – To-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligning test for behandlingseffekt). På den anden side, androstenol i kombination med paclitaxel ikke har nogen virkning i sammenligning med paclitaxel-behandlede celler.

Paclitaxel forbedrer mCAR ekspression

Vi næste evalueret wheter paclitaxel ændret mCAR genekspression. Til dette formål har vi udsat E9 celler til følgende forskellige behandlinger: 10 um af TCPOBOP, 10 pM af androstenol, IC50 for paclitaxel eller en kombination af disse. Vores resultater viste, at en enkelt behandling med TCPOBOP eller androstenol havde ingen virkning på mCAR mRNA-ekspression (fig. 1). Men når celler blev behandlet med paclitaxel alene eller i kombination med TCPOBOP eller androstenol, blev en stigning i mCAR ekspression set uafhængig af liganden (p = 0,0102;. Figur 1).

TCPOBOP og paclitaxel ændre tumorsuppressor og onkogen ekspressionsniveauerne

Yderligere eksperimenter blev udført kun med musen lungekræft cellelinje E9. Vi evaluerede virkningerne af TCPOBOP og paclitaxel på genekspressionsprofilen af ​​84 onkogener og tumorsuppressorgener. Først blev fem gener afskåret fra analysen, fordi de præsenterede CT-værdier større end 35 og /eller blev påvist tilstedeværelsen af ​​mere end ét PCR-produkt. Fra de 79 resterende gener, paclitaxel behandling ændrede ekspressionen af ​​10 gener, med fold ændringer på mere end 2 (tabel 2). Ifølge de funktionelt gen grupperinger fra Rt2 Profiler PCR array, de fleste af gener opreguleret paclitaxel var tumorsuppressorgener, gener relateret til apoptose onkogener eller gener, der er til stede egenskaber af onkogener og tumorsuppressorgener (tabel 2). Salg

eksponeringen af ​​E9 celler til muse CAR ligand TCPOBOP øgede ekspression af to tumorsuppressorgener: MGMT og WT1 (tabel 2). Interessant, da vi evaluerede genekspressionen af ​​celler behandlet med TCPOBOP plus paclitaxel (med den samme koncentration som øger paclitaxel cytotoksicitet), ekspressionen af ​​disse to gener blev yderligere forstærket, end når kun paclitaxel eller TCPOBOP blev administreret, hvilket tyder på en additiv virkning på genekspression af disse gener. Desuden kombinationen af ​​TCPOBOP plus paclitaxel resulterede i nedregulering af to onkogener, ZHX2 og ESR1 (tabel 2). Desuden ser det ud, at den kombinerede eksponering af E9 celler til TCPOBOP og paclitaxel forstærkede den paclitaxel-induceret genekspression signatur (tabel 2). Tilsammen disse resultater er i overensstemmelse med de ovenfor beskrevne og forklare modulerende egenskaber af mCAR agonist TCPOBOP på den anti-tumor effekt af paclitaxel i mus lunge kræftceller.

I silico viser analyse, paclitaxel og TCPOBOP passe ind i mCAR struktur

Justering af 1XLS og 1XNX struktur viste, at positioneringen af ​​agonisten TCPOBOP og den inverse-agonist androstenol i mCAR struktur er forskellige (fig. 3). Kupering af TCPOBOP blev udført som en kontrol, og det viste en god overlejring af TCPOBOP i krystalstrukturen af ​​1XLS (fig. 3). Docking hjælp af 1XLS struktur afslørede, at den inverse-agonist androstenol ikke kunne binde ved positionen af ​​agonisten TCPOBOP; androstenol viste en positiv energinet (51,82), der er ugunstig at binde inde receptoren. Energien gitter af TCPOBOP og paclitaxel er henholdsvis -49,34 og -125,53. På den anden side, at docking hjælp af 1XNX struktur vejlede den bedste energi til receptor-ligand interaktion pegede på en mulig andet sted i RCA receptoren for TCPOBOP binding (fig. 3) med en positiv energi gitter (-32,01), lignende til den, der opnås for androstenol (-40,44). Paclitaxel viste også den mest gunstige energi og lukket bindende værdier af binder i begge strukturer, hvor TCPOBOP eller androstenol blev anvendt som en docking guide ligand (tabel 3), hvilket indikerer, at paclitaxel også kunne være en mCAR ligand.

A , D-androstenol; B, E-Paclitaxel; C, F-TCPOBOP; G og H * androstenol og TCPOBOP superposition: G- overflade visning og H- wire visning af ligander. Bemærk, at paclitaxel forankret i begge mCAR strukturer.

Menneskelig CAR karakterisering i ikke-småcellet lungekræft prøver fra to uafhængige undersøgelser

Vi karakteriseret status HCAR i NLSLC fra to studier med offentligt tilgængelige data igennem TCGA. I adenocarcinom undersøgelse fra 230 prøver, 17,8% af tilfældene (41/230) præsenterede genetiske ændringer af HCAR, herunder Copy Number Alterations (CNA), mutationer eller ændret gen-ekspression (fig. 4). Disse ændringer var ikke associeret med total overlevelse (OS, p = 0,40, fig. S2). Størstedelen af ​​prøverne fra denne undersøgelse præsenteret med øget HCAR methylering ifølge HM450 analyse (fig. 4). Der bekræfter disse data, kun 8% af tilfældene (19/230) præsenteret med opregulering af HCAR mRNA.

(A) Genetiske ændringer og hyppigheden af ​​HCAR i Lung Adenocarcinom undersøgelsen til rådighed fra TCGA. (B) Samme data fra Lung pladecellecarcinom undersøgelsen til rådighed fra TCGA. (C) DNA-methylering vs genekspression af HCAR fra lungeadenocarcinom prøver fra TCGA. (D) DNA methylering vs genekspression af HCAR fra Lung pladecellekræft prøver fra TCGA. Begge datasæt præsenteres meget DNA methylering og variable niveauer af mRNA-ekspressionen af ​​NR1I3

Næste, vi brugte oplysninger fra en anden undersøgelse fra TCGA på lunge pladecellekræft (LSCC, TCGA, foreløbig data -. 26/04 /2014). Hyppigheden af ​​HCAR ændringer herunder mutationer, CNAs eller ændret gen-ekspression (fig. 4), var 8,2% (40/489), som ikke var associeret med OS (p = 0,81, Fig. S1). Svarende til adenocarcinom undersøgelsen, at størstedelen af ​​prøverne præsenteret med øget DNA-methylering af HCAR (fig. 4). Dette kan forklare, hvorfor kun 7,4% af alle tilfælde præsenteret med opregulering af HCAR mRNA (36/489).

På baggrund af resultaterne fra begge undersøgelser, er det muligt, at størstedelen af ​​prøverne fra lunge adenocarcinom og LSCC patienter præsenterer ingen ændringer i HCAR udtryk i forhold til den parrede, ikke-kræft væv, hvilket kan forklares med de høje niveauer af methylering fundet i begge undersøgelser.

diskussion

Lungekræft fortsætter med at være et stort problem for sundhedssystemer i hele verden, som de fleste tilfælde involvere patienter med omfattede lungefunktion, metastase, multiresistens og dårlige resultater. Overlevelsen af ​​lungecancerpatienter efter tumor opdagelse er typisk mindre end 5% ved fem år [35]. For nylig har beviser begyndt at vise, at CAR kan have en rolle i behandlingen af ​​kræft [19], [20]. Her demonstrerer vi, at specifikke CAR modulation af agonister, men ikke af inverse agonister, øget anti-tumor effekt af paclitaxel i både murine og humane lungecancerceller. Denne virkning blev ledsaget af potentiering af en paclitaxel-induceret genekspression signatur, når anvendelse af en kombination af paclitaxel og TCPOBOP. Desuden er en enkelt eksponering af cancerceller til TCPOBOP forøgede ekspression af to tumorsuppressorgener (WT1 og MGMT), der kunne bekræfte den forbedrede virkningsfuldhed af paclitaxel i cancercellelinier. Paclitaxel behandling forøget CAR genekspression og kuperet i den molekylære struktur af CAR

i silico

. Endelig har vi analyseret profilen af ​​HCAR i to TCGA undersøgelser og bemærkede, at CAR kunne være et interessant mål for NSCLC patienter, der fik paclitaxel behandling siden HCAR udtrykkes i tumorprøver og har ingen forbindelse med OS.

Chen

et al.

nylig anset CAR ligander for at være en lovende mulighed for kombineret kemoterapi, med det formål at overvinde MDR i cancerceller [6]. Vores resultater støtter dette forslag, da CAR ligander ikke forårsagede cytotoksiske virkninger per se i kræftceller; men når CAR agonister blev anvendt i kombination med paclitaxel, en interessant modulerende virkning opstået. Denne øgede cytotoksisk effekt blev også set i fem af seks forskellige humane cancer cellelinjer siden CITCO, den HCAR agonist, viste en lignende effekt på paclitaxel effekt. Derfor støtter vi hypotesen om Chen

et al.

At CAR modulation kan faktisk være vigtigt for cancer kemoterapi [6].

Den nøjagtige rolle CAR i carcinogenese og kræft terapi er stadig en spørgsmål om debat. På den ene side, bil er afgørende for leveren tumorpromotion af phenobarbital i mus [18], og det regulerer tumorigenese som reaktion på miljøfremmede stress [36]. På den anden side, Wang et al. beskrev CAR som en ny terapeutisk mål, der letter cyclophosphamid (CPA) -baseret behandling af hæmatopoietiske maligniteter [20], og hvor de konkluderede, at CAR aktivering letter CPA kemoterapi ved selektivt at fremme sin bioaktivering. I en anden undersøgelse blev CITCO vist at målrette hjernetumor stamceller, inhibering deres vækst og ekspansion [19]. Begge papirer antyder, at anvendelse af CAR-agonister til behandling af blod maligniteter og hjernecancere henholdsvis.

Som tidligere nævnt, paclitaxel inducerer apoptose i prolifererende celler. Her, paclitaxel inducerede celledød i alle mus og humane cancercellelinjer, med unikke IC50-værdierne for hver af dem. Selv efter at, at disse celler nuværende forskelle i deres modstand mod Paclitaxel (≈3600x), bilen agonister forbedret effekten af ​​paclitaxel i næsten alle kræft cellelinjer (6/7). På den anden side, havde den inverse-agonist androstenol ikke resultere i nogen virkning på cytotoksiciteten af ​​paclitaxel i størstedelen af ​​cellerne, og det svækkede den cytotoksiske af paclitaxel i en cellelinie. Disse resultater fører til den konklusion, at kun CAR-agonister bør overvejes at forbedre NSCLC kræftbehandling.

Virkningerne af CAR-agonister på anti-tumor effekt af paclitaxel var ens i både mus og humane celler. Således fokuserede vi vores eksperimenter på musemodellen af ​​to grunde: vi har mere erfaring med denne model [37], [38] og alle de teknikker, der anvendes i musemodellen var rutine i vores laboratorium. Desuden er der etableret brug af musen lunge epitel kræft cellelinjer i mere end 30 år nu og har fremlagt lignende resultater til dem, der opnås med humane cellelinjer [23]. Således har vi også påvist i denne

in vitro

musemodel at paclitaxel stiger CAR genekspression ved IC50, uafhængig af sin tilknytning til CAR-ligander. Man kunne forvente, at mCAR ligander skal modulere mCAR genekspression, men vores resultater viste ikke denne effekt. CAR aktivering ved specifikke ligander ikke altid ændrer CAR genekspression eller proteinniveauer, men det kan stadig resultere i en stigning i dens transkriptionsaktivitet.

CAR ekspressionsanalyse i muse cancerceller behandlet med CAR ligander alene, paclitaxel alene eller en kombination af begge, afslørede, at Paclitaxel øgede genekspressionen af ​​CAR uafhængig af dets association med TCPOBOP eller androstenol. Følgelig Enighed med dette resultat,

in silico

docking analyse af TCPOBOP, androstenol og Paclitaxel i CAR proteinstruktur demonstreret at paclitaxel passer ind i ligandbindende lomme af mCAR receptor, som kan øge CAR ekspression ved positiv feedback. Ingen effekt på CAR-genekspression blev bemærket efter CAR ligander eksponering, en kendsgerning, at bekræfter med fraværet af cytotoksicitet ved disse ligander.

Et andet interessant resultat støtter modulerende virkning af CAR-agonister på paclitaxel virkningsfuldhed blev deres potensering af paclitaxels genekspression signatur, øge ekspressionen af ​​visse tumorsuppressorgener og mindske ekspression af to onkogener. Interessant behandling med TCPOBOP alene inducerede også ekspressionen af ​​to tumorsuppressorgener MGMT og WT1. MGMT promotor methylering er en stærkere prognostisk faktor end alder, scene, og tumor lønklasse for gliomer [39].