PLoS ONE: proteomiske-Koblet-Network Analysis of T877A-Androgen receptor Interactomes kan forudsige klinisk prostatakræft Outcomes mellem White (ikke-spansktalende) og afroamerikanske Groups

Abstrakt

Den androgen receptor (AR) rester en vigtig bidragyder til den neoplastiske udvikling af prostatakræft (CaP). CaP progression er knyttet til flere somatiske AR mutationsændringer der udstyrer på de AR dramatiske gain-of-function egenskaber. En af de mest almindelige somatiske mutationer identificeret er Thr877-til-Ala (T877A), der ligger i det ligandbindende domæne, der resulterer i en receptor i stand til promiskuøs binding og aktivering af en række af steroidhormoner og ligander, herunder østrogener, progestiner, glucocorticoider, og flere anti-androgener. I et forsøg på yderligere at definere somatiske muteret AR gain-of-function egenskaber, som følge af sin promiskuøse ligandbinding, foretog vi en proteomisk /netværksanalyse tilgang til at karakterisere proteinet interactome af den mutante T877A-AR i LNCaP-celler under otte forskellige ligand-specifikke behandlinger (dihydrotestosteron, mibolerone, R1881, testosteron, estradiol, progesteron, dexamethason og cyproteronacetat). Ved at udvide analysen af ​​vores multi-ligand komplekser af mutant T877A-AR observerede vi signifikant berigelse af specifikke komplekser mellem normale og primære prostatatumorer, som desuden blev korreleret med kendte kliniske resultater. Yderligere analyse af visse mutant T877A-AR-komplekser udviste bestemte befolkningsgruppers præferencer adskiller primær prostata sygdom mellem hvide (ikke-spansktalende) vs. afrikansk-amerikanske mænd. Desuden er disse kræft-relaterede AR-proteinkomplekser demonstrerede, prædiktiv overlevelse resultater specifikt for CaP, og ikke for bryst-, lunge-, lymfom eller medulloblastom kræftformer. Vores undersøgelse, ved kobling af data genereret af vores proteomics til netværksanalyse af kliniske prøver, har været med til at definere reelle og nye biologiske veje i komplicerede gain-of-funktion AR komplekse systemer

Henvisning:. Zaman N, Giannopoulos PN , Chowdhury S, Bonneil E, Thibault P, Wang E, et al. (2014) proteomiske-Koblet-Network Analysis of T877A-Androgen receptor Interactomes kan forudsige klinisk prostatakræft Outcomes mellem White (ikke-spansktalende) og afrikansk-amerikanske grupper. PLoS ONE 9 (11): e113190. doi: 10,1371 /journal.pone.0113190

Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, USA

Modtaget: May 10, 2014; Accepteret: September 4, 2014; Udgivet: November 19, 2014

Copyright: © 2014 Zaman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle proteomiske data præsenteret i manuskriptet, vil blive uploadet på vores AR receptor database (https://androgendb.mcgill.ca/) som en excel-fil, sammen med de supplerende figurer /borde forbundet med dette manuskript.

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af de canadiske Institutes for Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca) driftstilskud MOP-106.477 (MT, MP, EW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

reelle fremskridt inden for genomisk sekventering metode har tilladt en bedre vurdering af omfanget af somatiske mutationer optjent i fælles neoplasmer [1], [2]. Vigtigere er erkendelsen af, at tumorer væsentligt varierer genetisk fra den ene patient til den anden og inden for en enestående patient der findes omfattende inter-tumoral heterogenitet og intratumoral heterogenitet [3], [4], [5]. Et betydeligt antal af disse genetiske ændringer er missense mutationer, der provokere nye gain-of-funktion egenskaber, der gør et særligt gen proaktiv til tumoral evolution og omtales som driver mutationer. En bedre forståelse af disse nye egenskaber vil føre til en bedre fortolkning af onkogenese, men dette er vanskeligt på grund af et stort antal forskellige mutationer, den uforudsigelige natur af gain-of-function egenskaber associeret med somatiske mutationer, den mulige omfattende samspil af forskellige somatiske mutanter og de efterfølgende udvælgelsesprocesser iværksat af mikromiljø eller terapi i sig selv. Sådanne komplekse “systemer” kræver en mere global “omics” tilgang og mere netværk analyse, snarere end den klassiske enkelt gen tilgang, til at samle mere kritiske oplysninger relateret til neoplastisk evolution.

I overensstemmelse med den nyligt definerede mutations landskab af tumorer, prostatacancer (CAP) har også omfattende genetiske ændringer, der spænder fra enkelt missense-mutationer, kopiantal variation, splejsningsvarianter, genetiske omlejringer og korte DNA ændringer i et stort antal gener [1], [2], [6] [7], herunder androgen receptor (

AR)

gen. Det er ikke uventet, at AR-mutationer kan føje til proteinet repertoire af kraftfulde nye funktioner [8], [9], og disse gain-of-function attributter kan tillade AR skal fungere i et afvigende måde. En række somatiske CaP AR mutanter, især de mest almindeligt forekommende CaP AR mutation, Thr877Ala (T877A), har unikke gain-of-function egenskaber: de kan binde adskillige klasser af steroider promiskuøst (f.eks østrogener, progestiner, glucocorticoider) med efterfølgende transaktivering eller være hyperaktiveret af normale ligander [10]. Klassiske anti-androgen behandlinger [fx flutamid, cyproteronacetat (CPA) eller bicalutamid] har genereret, gennem selektionspres, specifikke somatiske AR mutationer, f.eks Trp741Cys (W741C) og His874Tyr, hvilket resulterer i undergravende AR’er, der er fuldt aktive med disse lægemidler [11]. Selv den næste generation af anti-androgen medicin eksemplificeret ved enzalutamide (MDV-3100) har fremprovokeret specifikke AR mutationer [12], [13]. Denne observation korrelerer også med et dramatisk fald i PSA-niveauer efterfølgende til anti-androgen tilbagetrækning [11]. De T877A-AR-mutationer, som også er til stede i prostatacancer LNCaP, er blevet beskrevet af forskellige enkeltpersoner at forekomme i 25 til 33% af androgen-uafhængige eller kastrere-resistente tumorer [11], [14], [15] , [16].

for nylig vores eget arbejde tyder kraftigt, at AR-funktionen er større end dets klassiske rolle som en transkriptionsfaktor og omfatter de hidtil ukendte egenskaber af RNA-splejsning, DNA-methylering, proteasomalaktivitet interaktion og proteintranslation ved polyribosomer selv [17]. Endvidere den store funktionel diversitet af komponenterne af AR komplekser eksemplificerer den indviklede karakter af protein-protein interaktioner forbundet med at generere den passende AR biologiske output. Disse roman AR funktioner kan mediere cellulære processer og tilbyde nye områder, hvor somatiske AR CaP mutanter kan “forkæle” og fremme CaP onkogenese.

I et forsøg på at beskrive nye gain-of-funktion egenskaber forbundet med mutant CaP AR’er , udførtes en proteomik-koblet netværk analyse. Flere proteomik-massespektroskopi undersøgelser blev udført for fuldt ud at karakterisere protein sammensætning af T877A-AR “komplekser” (interactome) under forskellige klasser af hormon /ligand betingelser der afspejler promiskuitet af ligand binding forbundet med T877A. Kritisk kan mutant CaP ARs har deres egen unikke evne til at gennemgå og definere nye interaktioner. Koblingen af ​​de data, der genereres af vores proteomics skærmen til system biologi analyse har været nyttigt at definere reelle og nye biologiske endepunkter i AR komplekse systemer inden for en klinisk sygdom perspektiv.

Materialer og metoder

cellelinier

LNCaP prostatacancercellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC), Rockville MD.

Celledyrkning, steroidhormoner, ligander og stimulering eksperimenter

LNCaP-cellelinien blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med FBS (10%), ved 37 ° C, 5% CO

2 i T-75 plastic dyrkningskolber. Når sammenflydende blev mediet ændret til RMPI suppleret med 10% trækul-dextran strippet FBS og inkuberet i yderligere 24 timer. Den følgende dag blev mediet ændret til frisk RMPI /kul-dextran strippet FBS natten over hormon /ligand stimulation undersøgelser for en 18 timers periode. Steroider hormoner blev anvendt ved følgende slutkoncentrationer, 10 nM dihydrotestosteron (DHT), 10 nM mibolerone (MB), 10 nM R1881, 10 nM testosteron + 10 uM finasterid, 10 nM 17β-estradiol, 10 nM progesteron, 10 nM dexamethason, og 100 nM cyproteronacetat (CPA).

Affinitetsoprensning og Western blotting

LNCaP helcellelysater blev fremstillet ved frysning-optøning metoden med 1X PDG puffer indeholdende det passende hormon /ligand [18] . Lysater blev derefter overført til α-AR co-immunopræcipitationer [AR (N20), Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA] natten over ved 4 ° C. En 50% Protein A Sepharose opslæmning blev tilsat til hver prøve og inkuberet ved stuetemperatur i 90 min. Perlerne blev vasket tre gange med vaskebuffer (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Tween 20) og resuspenderet i 100 pi 1X SDS-gel loading buffer. Prøver blev denatureret ved kogning og opløst på en 10% SDS-polyacrylamidgel før sølvfarvning ifølge producentens retningslinjer (BioRad) eller overførsel til en nitrocellulosemembran for Western blot-analyse ved anvendelse af monoklonalt antistof AR (441) (NeoMarkers, Fremont, CA) .

Massespektrometri og peptid sammenligning

TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphin) blev tilsat til de proteinprøver at nå koncentration på 5 mM. Prøver blev inkuberet ved 37 ° C i 30 min. Et ug trypsin blev tilsat, og prøverne fordøjet natten over ved 37 ° C, derefter tørret ned i en SpeedVac og resolubiliseres i 50 pi ACN 5% /myresyre (FA) 0,2%.

Alle MS-analyser var udføres med en LTQ-Orbitrap hybrid massespektrometer med en nanoelektrospray-ionkilde (ThermoFisher, San Jose, CA) kobles med en Eksigent nano-LC 2D pumpe (Dublin, CA) udstyret med et Finnigan AS autosampler (Thermo Fisher, San Jose, CA ). Tyve pi af hver prøve blev injiceret på en C18 præsøjle (0,3 mm i.d. x 5 mm) og prøver separeret på en C18 analytisk søjle (150 um i.d. x 100 mm) under anvendelse af en Eksigent nanoLC-2D system. En 76-minutters gradient fra (A /B) 10-60% (A: myresyre 0,2%, B: acetonitril /0,2% myresyre) blev anvendt til at eluere peptiderne med en strømningshastighed andrager 600 nL /min. Den konventionelle MS spektre (undersøgelsen scan) er erhvervet i profil tilstand ved en opløsning på 60.000 ved m /z 400. Hver fulde MS-spektrum blev efterfulgt af tre MS /MS spektre (fire scanningsfunktioner hændelser), hvor de tre mest udbredte formere ladede ioner blev udvalgt til MS /MS-sekventering. blev udført Tandem MS eksperimenter ved hjælp kollision-induceret dissociation i den lineære ion fælde.

De sammenligninger af peptid overflod på tværs af de forskellige eksperimentelle paradigmer blev opnået ved hjælp af etiket-fri kvantitative proteomics [19], [20]. Kort fortalt blev rå datafiler fra Xcalibur software konverteret til peptid kort filer repræsenterer alle ioner i henhold til deres tilsvarende m /z-værdier, opholdstid, intensitet og opladningstilstand. Peptid overflod blev derefter vurderet ved hjælp af “peak top” intensitetsværdier. Intensiteter af peptider eluerer over adskillige fraktioner blev summeret, og kun en varianskoefficient (CV), der tillader den maksimale ion transmission blev anset for at beregne peptid intensitet. Gruppering af peptidkort tværs af forskellige prøvesæt blev udført på peptid-associeret Mascot indtastning med hierarkisk clustering med specifikke tolerancer (+/- 15 ppm peptidmasse og +/- 1 min peptid retentionstid). Normalisering af retentionstiden blev udført på den oprindelige peptid klynge ved anvendelse af en dynamisk og ulineær korrektion som indeslutter retentionstiden distribution til mindre end 0,1 min i gennemsnit. Reproducerbarhed ændringer i overflod på tværs betingelser blev bestemt ved hjælp af en to-tail homoscedastic

t

-test på prøve replikerer at identificere peptid klynger med

s

-værdier 0,1 med fold ændringer større end 7 standard afvigelser. Peptid klynger opfylder disse udvælgelseskriterier blev inspiceret manuelt for at validere identifikation og ændringer i overflod. Ekspressionssystemer analyser blev udført på proteiner identificeret ved hjælp af mindst to forskellige peptidsekvenser. Ekspressionsniveauer værdier og relativ standardafvigelse blev opnået ved midling af intensitetsforskelle og standardafvigelser af de fire mest intense peptid tripletter efter fjernelse perifere peptid klynger. Normaliseret proteom data findes i tabel S1.

datasæt for netværk konstruktion og genekspression analyse

Alle AR interaktionskandidater fik NCBI gen-id’er. Humant protein interaktion oplysninger blev indsamlet fra forskellige data ressourcer og annotation databaser såsom Biomolekylær Interaction Network Database (BIND), Database af interagerende proteiner (DIP), humant protein reference Database (HPRD), intakt og Molekylær interaktion database (MINT), hvoraf de fleste indeholder kurateret interaktionsdata og high-throughput data. Vi genererede en metadata af protein interaktioner ved at flette disse data med vores egen manuelt kurateret menneskelige signalering netværk indeholdende 4.000 proteiner og 22.000 signalering forbindelser [21], [22], [23].

Et protein interaktion netværk blev konstrueret for hvert hormon ved hjælp af vores manuelt kurateret human signalnet og protein-til-protein-interaktion netværk. Vi har kun betragtes proteiner, der var ≥ 2,5 gange hormonet tilstand overflod (signal) vs. køretøjet kontrol overflod fra MS datasæt, der skal overvejes markant til stede. I netværket, en node og link repræsenterer proteinet og interaktion hhv. For at finde de tæt forbundne områder af nettet, for hvert hormon, vi scorede hvert par af interaktion baseret på antallet af naboknuder deres fælles. Dette gav os en matrix med alle de score mellem alle interaktion par. Hierarkisk klyngedannelse blev anvendt til matricen og en tærskel score beregnes på grundlag af den partition tæthed tillader os at identificere de stærkt sammenkoblede regioner (klynger) for hver af de hormon-netværk.

Dernæst brugte vi disse protein klynger og identificeret Go-vilkår (https://www.geneontology.org/), der er signifikant forbundet med hver af protein klynger (p-værdi 0,05, hyper-geometrisk). Vi brugte også Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) definerede veje og udførte GSEA hvis 25% af proteinet klyngens gener var i vejen. For veje og go-vilkår, der var betydelig fra GSEA resultater (p-værdi 0,05), gjorde vi også overlevelse analyse. Vi brugte gener forbundet med disse GO-vilkår og udførte GSEA hjælp GSE21034 [24].

RNA ekstraktioner og microarray analyse

LNCaP celler blev stimuleret med panel af ligander, som beskrevet ovenfor, og total RNA blev ekstraheret ved anvendelse TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA-prøver blev derefter behandlet af Quebec Genome Innovation Centre (McGill University, Montreal, Canada), for microarray analyse med Illumina human HT-12 Expression Beadchip v4 (Illumina, San Diego, CA). Rå data blev behandlet ved hjælp af R [22], [25].

To globale heatmaps blev foretaget. Den første Heatmap indeholder de mest differentielt udtrykt gen for hvert hormon anvendelse af t-test (p-værdi 0,05), hvor hvert hormon sammenlignes med alle andre. Den anden Heatmap omfatter top 10, 20, 50 og 100 gener med den højeste varians. T-testen finder de differentielt udtrykte gener, som er specifikke for hver hormon, hvorimod variansen hjælper os iagttage gener, som udtrykkes differentielt på tværs af flere hormoner. GSEA analyse blev udført ved hjælp GSE21034 [24], af de 10, 20, 50 og 100 gener, der viste den højeste varians.

Progression og Survival Analysis

Gene udtryk profiler, patientdata overlevelsesdata, og demografiske oplysninger til de 267 kliniske prostata prøver (29 normal, 181 primær og 37 metastatiske tumorer) blev opnået fra GSE21034 [24]. Bryst-, lunge-, lymfom og medulloblastom datasæt blev opnået fra Broad Institute (https://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi) [26]. Vi undersøgte de post-radikal prostatektomi prognostiske værdier af et undernetværk baseret på genekspressionsprofiler af primære tumorer, og udførte Kaplan-Meier-analyse ved at gennemføre Cox-Mantel log-rank test med R som tidligere [22] beskrevet, [25]. Hvis p-værdien er mindre end 0,05, blev delnettet behandlet som statistisk signifikant at klassificere tumorerne i ikke-metastatiske og metastatiske tumorer. Vi stratificeret tilbagevendende vs. ikke-tilbagevendende CaP kræft baseret på følgende kriterier: PSA (≥4 ng /ml), Gleason (≥7), Tumor Stage (≥3) og kombineret (PSA + Gleason + Tumor)

.

struktur Forberedelse til MD simulering

Crystal struktur af DHT (1I38) og CPA (2OZ7) bundet til T877A mutant AR-LBD og testosteron (2AM9) og R1881 (1E3K) bundet til vildtype AR- LBD er tilgængelige i Protein data Bank (PDB). De komplekser af forskellige ligander bundet til T877A mutant AR-LBD’erne blev yderligere forberedt til MD simuleringer med Xleap [27] i AMBER10 [28]. Den generaliserede AMBER kraftfeltet (Gaff) og ff99SB [29] parametre blev anvendt til otte forskellige ligander. Komplekset blev solvatiseret i et trunkeret oktaeder TIP3P [30] vandbeholderen. Afstanden mellem væggen af ​​kassen og den nærmeste atom af det opløste stof var 12,0 Å, og den nærmeste afstand mellem opløst stof og opløsningsmiddel atomer var 0,8 Å. Modioner (Cl

-) blev tilsat for at opretholde elektroneutralitet af systemet. Hvert system blev minimeret, først ved at anvende harmoniske begrænsninger med kraft konstanter 10 kcal /mol /Å

2 til alle opløste atomer; sekunder, ved opvarmning 100-300 K over 25 ps i den kanoniske ensemble (NVT); og endelig ved ækvilibrering at justere solvent tæthed under 1 atm tryk over 25 ps i isotermiske-isobarisk ensemble (NPT) simulering. De harmoniske begrænsninger blev derefter gradvist reduceret til nul med fire runder af 25-ps NPT simuleringer. Efter yderligere 25-ps simulation, blev en 15-ns produktionsforløb opnået med snapshots indsamlet hver 1 ps. For alle simuleringer, blev 2 fs tid skridt og 9 en ikke-bundet cut-off anvendes. Partiklen mesh Ewald metode [31] blev anvendt til behandling langtrækkende elektrostatik og obligation længder involverer obligationer til brintatomer blev begrænset af SHAKE [32].

Resultater

Sammenlignende netværk karakterisering af T877A AR komplekser: interactome og genekspressionsstudier

Vores evne til at indfange både ligand-bundne og ikke ligandholdigt fuldlængde vildtype AR ved affinitetskromatografi under fysiologiske betingelser har tidligere tilladt os at forfølge en proteomics tilgang for at karakterisere komponenterne af vildtype-AR-komplekser. Dette blev gjort ved at underkaste sådanne komplekser til tryptisk fordøjelse efterfulgt af massespektrometri (MS) til at tildele proteinidentifikation i realiteten skaber AR interactomes initieret af ligandbinding [33]. Til vores MS data, er nu blevet anvendt en etiket-fri kvantitativ metode på tværs af de forskellige eksperimentelle paradigmer (se materialer og metoder) [19], [20], som tilladt os at indhente data vedrørende identifikation protein, sammen med overflod, og dermed giver mulighed for direkte sammenligninger mellem stimulation betingelser.

Formålet med differentierede hormonstimulation betingelser vil give os mulighed for at afgøre, om sygdommen ætiologi af T877A-AR-mutation er afhængig af ligand og co-faktor status. Derfor brugte vi LNCaP celler, der endogent udtrykker T877A-AR mutation til at karakterisere ligand promiskuøse protein interactome komplekser under forskellige hormonelle forhold, for at fremhæve de mulige forskellige komplekser, der kan være forbundet med sygdomsprogression. LNCaP-celler blev stimuleret med de følgende hormoner, fire androgener: DHT, mibolerone (MB), R1881, eller testosteron (i nærværelse af finasterid (for at forhindre omdannelsen af ​​testosteron til DHT), eller 17β-estradiol, progesteron, dexamethason, eller anti-androgen cyproteron actetate (CPA), alene eller med no-ligand kontrol /alkohol-køretøj. Hormone stimuleret T877A-AR komplekser blev immunooprenset med en N-terminal specifikt AR antistof, som ikke ville forstyrre hormon binding til AR ligand -bindende domæne. Eluater fra alle forsøgsbetingelser blev analyseret ved LC-MS /MS. for at øge vores prøve frekvens for peptid detektion i vores MS-analyse blev hver eksperimentel betingelse udføres fire gange. vores proteomics data er en samling af kun fuldt karakteriserede proteiner, med fuld gen ontologi og funktion.

Kvantitativ MS-data for hver af de otte hormonstimulering betingelser blev anvendt til at skabe en protein-interaktion kort (figur 1A). proteinet interaktion netværk kort, giver mulighed for en visuel analyse af forholdet af interaktionen af ​​hvert protein med mutanten AR. Det er mest sandsynligt, at ikke alle proteiner interagerer direkte med mutant AR, men kan via mellemliggende proteiner. Yderligere ontologisk funktion klassifikation (se Materialer og fremgangsmåder) er baseret på denne interaktion netværk kort, af kræsne væsentlige klynger af interagerende proteiner baseret på antallet af protein-protein-interaktion forbindelser. Af T877A-AR protein viser de otte hormon stimulation, vi så systemisk anvendt hierarkiske clustering analyse til de eksperimentelle betingelser. Hierarkiske klyngedannelse varme-kort, der repræsenterer den sammenslutning af mellem hel T877A-AR agonist og antagonist eksperimentelle behandlinger blev derefter genereret (figur 1B). Mellem de forskellige eksperimentelle betingelser (hormon behandlinger), blev en sammenlignende netværksanalyse anvendes [21], [22], [23], og selv om fire forskellige androgener blev brugt (DHT, testosteron, MB og R1881), de proteomiske profiler af disse androgen ligander ikke segregerer sammen, og vi observeret, at progesteron og dexamethason AR komplekser har proteomiske profiler, der ligner R1881 og MB hhv. Desuden protein-interaktion kompleks for AR-estradiol-stimulerede komplekser var mest ligner AR-DHT respons interactome.

A. Kvantificeret protein-interaktion netværk af DHT stimulerede LNCaP-celler. Værdien af ​​hvert protein, defineret af vores label-fri kvantitative MS, udmærker sig ved både farve og størrelse, og sub-gende protein-protein interaktioner. AR er udpeget af den sorte cirkel. At bestemme forholdet mellem protein-interaktion og genekspressionsmønstre, hierarkisk klyngedannelse af multi-panel hormonstimuleret LNCaP-celler blev udført. B. interagerende proteiner identificeret ved massespektrometri. C. Mest variabelt udtrykte gener upon ligand stimulation. Selv om det er blevet foreslået, at alle hormoner, der anvendes er i stand til at aktivere androgenafhængig gentranskription med T877A-AR mutant receptor, er der forskelle mellem AR proteinkomplekser og AR genekspressionsmønstre. Denne klyngeanalyse illustrerer, at selv de syntetiske androgener som Mibolerone (MB) og R1881, har lignende genekspressionsprofiler, deres protein-interaktion komplekser er mere ligner dexamethason (DEX) og progesteron (PGR), henholdsvis end til enten naturlige androgener testosteron og DHT. Desuden kan endog naturlige androgener (DHT og testosteron) holdes adskilt af deres protein-komplekser. Dette tyder på, at der er funktioner for AR over gen-transaktivering. Protein og genekspression værdier er angivet som et forhold mellem kvantificeret protein af hver stimulering vs. køretøj kontrol stimulation.

Vi fortsatte også at karakterisere de genekspressionsmønstre af multi-panel hormon stimulerede LNCaP celler. Analyse af de fleste variabelt udtrykte gener mellem hormon betingelser gav en hierarkisk klyngedannelse mønster, der var meget anderledes end den T877A-AR protein-interaktion profil (figur 1C). Helt klart, vi igen observeret, at de forskellige androgener anvendes i disse stimulation profiler ikke segregerer sammen, og at syntetiske androgener, såsom R1881 og MB, ikke har de samme AR-stimuleret transaktiveringsassays profiler som de naturlige ligander som testosteron og DHT. Herudover vil de funktionelle ontologiske egenskaber mellem protein-interaktion vs. genekspressionsprofiler af vores differential ligand stimulerede celler også vises være meget forskellige. Kræsne indvirkningen på sygdomsprogression fra disse profiler var af særlig interesse.

At etablere statistisk signifikante biologiske funktioner, vi implementeret indarbejdelsen af ​​Gene Ontologisk (GO) /veje vilkår ved hjælp af DAVID (Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery, https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Brug af protein-interaktion data fra alle de ligand stimulationsforholdene, de store ontologiske funktioner er: RNA pol II-afhængig transskription, protein biosyntese, med komponenter af den translationelle maskineri (translationsinitiering, forlængelsesfaktorer, ribosomale proteiner og andre regulatoriske proteiner), RNA metabolisme (specifikt RNA-splejsning), DNA-reparation (gennem en interaktion med medlemmer af DNA-reparation kompleks), og proteasomet /ubiquitinering veje (se tabel S2). I modsætning hertil ligand-afhængig genekspression mønster ontologiske klasser inkluderet involverede veje i DNA-replikation, steroid /sterol biosyntese, og apoptose (se tabel S3). Selv om den AR er klassisk beskrevet som en transkriptionsfaktor, ville dens proteom profil tyder på, at AR er i stand til funktioner ud over hvad der oprindeligt blevet beskrevet som et gen aktivator.

Strukturel analyse af hormon-binding til T877A AR

for at udforske de mulige mekanismer, som ligander binder til mutant AR oprette forskellige sæt af AR interagerende proteiner, opnåede vi den detaljerede kropsbygning af receptoren, ved hjælp af 15 ns molekylær dynamiske (MD) Simuleringsundersøgelserne (se materialer og fremgangsmåder) af de otte forskellige ligander anvendes. Brug af docking program WILMA (figur 2), opnåede vi strukturelle data for mutant AR bundet med progesteron, østrogen, dexamethason og MB. De strukturelle data for mutant AR med testosteron, DHT, R1881 og cyproteronacetat er allerede tilgængelige, og som sådan, tjente disse strukturer som udgangspunkter for MD simulation studier.

Docking program WILMA blev anvendt til at undersøge strukturelle ændringer af det ligandbindende domæne af T877A mutationen ved binding på ligandbinding. Illustreret er den gennemsnitlige struktur T877A-AR mutation ligandbindingsdomæne med otte forskellige ligander. A. testosteron, B. DHT, C. R1881, D. MB, E. østrogen (EST), F. progesteron (PGR), G. CPA, H. dexamethason (DEX). En rød kasse fremhæver ændringerne i helix α 11 loop efter binding til hver hormon ligand.

Mutant AR MD simuleringer blev udført over 15 ns produktionsserier. At inspicere den lokale fleksibilitet af hvert protein /hormon-kompleks, vi beregnet udsvingene root-mean-squared afvigelse (RSMD) af rygradsatomer af hver aminosyrerest for hver mutant AR kompleks. I undersøgelsen af ​​globulære protein konformationer, én sædvanligvis måler ligheden i den tredimensionelle struktur af RMSD af de centrale carbonatomer i aminosyrer, efter optimal stift legeme superposition. De væsentligste udsving svarer til loop regioner mellem α3 /α4, α9, α10 /α11 og α11 /α12 og spiraler α11 og α12 sig af LBD af AR (figur 3). Det kan ses, at løkken mellem α9, α10 og α11 er den mest fleksible område i alle komplekser (figur 3B). Blandt de otte forskellige AR ligand-bundne komplekser, den testosterone- og østradiol-bundne komplekser demonstrerer den højeste fleksibilitet, med nogle loop rester med RMSD udsving så høje som 2,4 Å. Selv om disse loops er fjernt fra hormonbindende lomme, bliver de udsat for overfladen og kan tjene en rolle som potentielle bindingssteder til andre proteinpartnere.

A. Overlejrede gennemsnitlige strukturer af alle otte ligand bundet receptor komplekser. B. Regioner i T877A AR-LBD loop mellem Helixα9 og Helixα10 viste maksimal fleksibilitet. C. Udvidet visning af Helix α11 og Helix α12 regioner T877A AR-LBD bundet til otte forskellige ligander undersøgt i denne undersøgelse. Rester af α11 og α12 og loop mellem dem viste større fleksibilitet i forhold til andre regioner af receptoren, hvor T877A er placeret. Farve svarer til følgende ligander:. Green – testosteron, Cyan- DHT, gul-R1881, Pink-MB, Rose- EST, Grey- PGR, Orange-CPA, Purple-DEX

andre store forskelle observeret mellem de mutante AR komplekser er positionerne af α11 og 12, som vides at være kritisk for dikterer hormon binding og co-aktivator interaktioner. Rester af α11 og α12 og sløjfen mellem dem viste højere fleksibilitet (figur 3C). Den T877A-AR-mutation beliggende i α11 giver mulighed for en mere rummelig hormon-bindende lomme og vil rumme steroider med forskellige udvidelser inden for D-ring.

Undersøgelsen af ​​arten og størrelsen af ​​opløsningsmidlet tilgængelige overfladeareal (SASA ) af proteiner er et vigtigt redskab til at måle potentiel interaktion tilbøjelighed med tilstødende proteiner. Vi beregnede gennemsnitlige SASA af hver AR kompleks fra 15 ns MD bane. Ingen store forskelle blev observeret blandt de beregnede SASAs forskellige AR mutant komplekser, der lå mellem 12.124 til 12,390 Å

2. Disse resultater viser, at forskellene meste er forbundet med α11-α12 regioner af AR-LBD, hvor T877A mutationen er placeret. Derfor besluttede vi at sammenligne dynamikken blandt de otte forskellige komplekser, specielt i denne region, ved hjælp RMSD matricer (tabel 1). De matricer, som i det væsentlige fange ekstreme bevægelser, afslører regioner med høj fleksibilitet, især for CPA og dexamethason, sammenlignet med andre AR-ligand-komplekser.

datamodellering er også blevet udført for en række andre AR somatiske mutationer i ligand-binding domæne (LBD), og viser følsomhed over for en bred vifte af hormon-ligander, herunder, AR-W741L [34], -L701H [35], [36], [37], [38] , -H874Y [39], [40], [41] og -F876L [13]. Bestemmelse af LBD struktur mellem AR-WT og -H874Y (stede i 22Rv1 celler), når de bindes til testosteron i nærværelse af den N-terminale FXXLF motiv peptid eller TIF2 coaktivator peptid, fandt, at alle strukturer, var i overensstemmelse med den kanoniske nukleare receptor LBD fold [41]. Desuden -H874Y DHT og R1881 strukturer tilpasset til -T877A og -W741L LBD bundet til steroid og nosteroid ligander [34], [42]. De dobbelte AR-mutant cellelinier MDA-PCa-2a og MDA-PCa-2b, besidder den L701H og T877A somatiske mutationer, disse celler viser lignende AR transaktivering og LBD strukturelle egenskaber til fælles AR-T877A mutant LNCaP-celler til et bredt spektrum af steroidligander og anti-androgener, men også vise en øget følsomhed cortisol steroider [35], [36].