PLoS ONE: GRIM-19 forstyrrer E6 /E6AP Complex at redde p53 og inducere apoptose i Livmoderhalskræft Cancers

Abstrakt

Baggrund

Vores tidligere undersøgelser viste en nedregulering af GRIM-19 i primære humane livmoderhalskræft og restaurering af GRIM-19 induceret tumorregression. Induktionen af ​​tumorsuppressorprotein p53 ubiquitinering og nedbrydning af E6 oncoportein af høj risiko-HPV gennem dannelse af et stabilt kompleks med E6AP betragtes som et kritisk mekanisme for cervikal tumorudvikling. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme den potentielle rolle GRIM-19 med at redde p53 protein og fremkalde livmoderhalskræft celle apoptose.

Metodologi /vigtigste resultater

protein niveauer af GRIM-19 og p53 blev påvist i normale cervikale væv fra 45 patienter, som gennemgik hysterektomi til andre formål end neoplasier af enten livmoderhals eller endometrium, og livmoderhalskræft væv fra 60 patienter med ikke-metastatiske pladeepitelceller carcinomer årsager. Co-immunpræcipitationseksperimenter og GST pull-down assay blev udført for at undersøge samspillet mellem GRIM-19 med 18E6 og E6AP

in vivo og in vitro

hhv. Konkurrencen af ​​18E6 med E6AP i bindende GRIM-19 ved at udføre konkurrence- pull-down-analyser er designet til at undersøge afbrydelse af E6 /E6AP kompleks ved GRIM-19. Den augment af E6AP ubiquitinering af GRIM-19 blev påvist in vivo og in vitro ubiquitinering assay. Virkningerne af GRIM-19-afhængig p53 akkumulering på celleproliferation, cellecyklus, apoptose blev udforsket af MTT, flowcytometri og transmissionselektronmikroskopi hhv. Tumoren undertrykkelse blev opdaget xenograft musemodel af.

Konklusion /Betydning

Niveauerne af GRIM-19 og p53 blev samtidig nedreguleret i livmoderhalskræft. Restaureringen af ​​GRIM-19 kan fremkalde ubiquitinering og nedbrydning af E6AP, og forstyrre E6 /E6AP kompleks gennem interaktion mellem N-terminalen af ​​GRIM-19 med både E6 og E6AP, som beskyttede p53 fra nedbrydning og fremmet celle apoptose. Tumor xenografundersøgelser afslørede også undertrykkelse af p53 nedbrydning i tilstedeværelse af GRIM-19. Disse data antyder, at GRIM-19 kan blokere E6 /E6AP kompleks; og synergistisk undertrykke livmoderhalskræft tumorvækst med p53

Henvisning:. Zhou Y, Wei Y, Zhu J, Wang Q, Bao L, Ma Y, et al. (2011) GRIM-19 forstyrrer E6 /E6AP Complex at redde p53 og inducere apoptose i livmoderhalskræft. PLoS ONE 6 (7): e22065. doi: 10,1371 /journal.pone.0022065

Redaktør: Scott A. Coonrod, Cornell University, USA

Modtaget: April 18, 2011; Accepteret: 14 Juni 2011; Udgivet: 12 Jul 2011

Copyright: © 2011 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Basic Research Program Kina (973 Program): 2007CB914503 https://www.973.gov.cn, National Natural Science Foundation of China (nr 81.071.683, 81.001.168 81.072.127 og 91.029.710) http: //www.nsfc .gov.cn, “ellevte Five-Year” National Technology Support Programme (2008BAI57B03) https://kjzc.jhgl.org, National Institutes of Health giver CA105005, CA78282 og P30-CA134274 https://grants.nih.gov. Anhui Provincial Natural Science Foundation projekt (20090413117, 11040606M178) https://www.ahkjt.gov.cn, og Provincial Naturvidenskabelige Forskningsråd projekt af Anhui Provincial Højere universitetsuddannelser (KJ2010B375) https://www.ahedu.gov.cn/. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Højrisiko-humane papillomavirus (HR-HPV), såsom HPV18 og HPV16, er ikke kun en vigtig årsag til livmoderhalskræft [1], men også de patogener af en delmængde af andre tumorer såsom hoved og hals pladecarcinomer [2], lungekræft [3] øvre aerodigestive tarmkanalen kræft [4] og anogenital kræft [5]. Ekspressionen af ​​virale oncoproteiner E6 i HPV-positive cervikale carcinomer [6] kan interagere med E6-associeret protein (E6AP) til dannelse E6 /E6AP kompleks, som specifikt inducerer ubiquitinering og hurtig nedbrydning af p53, nuklear transskription faktor X-box binding 91 (NFX1-91) og PDZ domæne-holdige proteiner gennem proteasomforløb [7], [8], [9], [10]. p53 nedbrydning er en væsentlig forudsætning for overlevelse HR-HPV-inficerede tumorer; således blokerer E6 /E6AP kompleks medierende p53 nedbrydning kan være et attraktivt tilgang til behandling af kræft med HR-HPV-infektion [11], [12], [13], [14].

GRIM-19 blev oprindeligt identificeret som en tumor-undertrykkende protein, der var involveret i celledød [15] gennem foreningen og undertrykkelse af STAT3 [16], [17]; Dens udtryk er nedreguleret i nyre-, prostata og livmoderhalskræft [16], [17], [18], [19], [20]. Desuden GRIM-19 undertrykker onkogen-induceret remodellering af cytoskelettet og cellemotilitet [21]; og cellecyklusprogression ved interaktion med tumorsuppressor p16INK4a [22]. Således GRIM-19 udøver distinkte mekanismer i en række forskellige celletyper. Her rapporterer vi, at GRIM-19 inducerer p53 ophobning gennem en afbrydelse af E6 /E6AP kompleks og en induktion af auto-ubiquitinering af E6AP i livmoderhalskræft celler. Denne undersøgelse viser en roman funktion og en molekylær mekanisme, hvormed GRIM-19 hæmmer HR-HPV-induceret tumorigenese ved at beskytte p53 fra nedbrydning.

Resultater

GRIM-19 og p53 er samtidig nedreguleres i livmoderhalskræft kræftformer

Vores tidligere undersøgelse viste, at GRIM-19 inducerer cervikal tumor regression i en mus xenotransplantationsmodel, hvilket tyder på en mulig rolle GRIM-19 i tumorvækst regulering [20]. Da p53 tumor suppressor også er lavt udtrykt i cervikale tumorer, vi undersøgt, om der er en korrelation mellem niveauerne af GRIM-19 og p53. Niveauerne af GRIM-19 og p53 var signifikant (

s

0,01) lavere i tumorerne, og direkte korreleret med hinanden i 99% af cervikale tumorer (Fig. 1). I overensstemmelse med et lavt p53 i tumorerne, en velundersøgte p53 målgen, PUMA, blev også nedreguleret i tumorerne sammenlignet med normalt væv (fig. 1). Disse resultater viste, at GRIM-19 og p53 niveauer samtidigt blev undertrykt, hvilket tyder på en potentiel sammenhæng mellem GRIM-19 og p53 i livmoderhalskræft.

(A) I alt cellulære ekstrakter (50 ug) fra primære cervikale tumorer (T ) og normale cervikale væv (N) blev undersøgt for ekspression af GRIM-19, p53 og PUMA ved Western blotting. De repræsentative resultater af Western blotting er vist. T1-T4 var fra individuelle patienter med cervikal cancer. T1 og T2 blev diagnosticeret som scenen IIa; og T3 og T4 blev diagnosticeret som stadie Ia planocellulære epitel karcinom. (B) Kvantitativ analyse af proteinet ekspression som målt ved optisk tæthed af hvert bånd. Forholdet mellem massefylden fra GRIM-19, p53, PUMA over tilsvarende GAPDH (45 tilfælde af normalt væv og 60 tilfælde af tumorvæv) blev beregnet.

GRIM-19 forøger p53 proteinniveauer i cervikale tumorceller

for yderligere at undersøge forholdet mellem GRIM-19 og p53, HeLa celler med enten overekspression (pG19) eller knockdown (siG19) af GRIM-19 blev anvendt, og niveauet for GRIM-19 og p53 blev evalueret ved Western blotting (figur 2A). Interessant, sammenlignet med den tilsvarende kontrol (p /Sicon) celler, p53 og dets målgener PUMA og p21 steg i HeLa /pG19 celler (Fig. 2A, venstre paneler) og faldt i HeLa /siG19 celler (figur 2A, højre paneler ). Derudover to andre cervikale cancercellelinier, SiHa og CaSki, blev transficeret med enten en GRIM-19-ekspressionsplasmid eller dsRNA målretning GRIM-19 og sammenlignet med deres respektive kontroller. Resultater svarende til dem observeret i HeLa blev opnået i disse celler også (fig. 2B). Desuden har tests på andre HPV-fri tumorcellelinier (A549 og HO8910) ikke afsløre de samme resultater som observeret i HeLa (Fig S1). Således niveauerne af GRIM-19 direkte korreleret med de p53 i livmoderhalskræft celler

. (A B) De protein niveauer af GRIM-19 og p53 i ubearbejdet livmoderhalskræft. Western blotting med de angivne antistoffer blev udført ved anvendelse lysater fra de angivne cellelinjer. (C) Effekt af GRIM-19 på p53 mRNA-ekspression. MRNA af GRIM-19 (venstre panel) signifikant høj i HeLa /pG19 celler (*

s

0,01), det højre panel viser p53 mRNA-ekspression. Forskellene er ikke statistisk signifikante. (D) GRIM-19 påvirkede ikke p53-promotor-aktivitet. En p53-Luc reporter blev anvendt. De viste data er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg med tredobbelte prøver i hver test. (E) GRIM-19 forøger halveringstiden af ​​p53. Celler blev behandlet med CHX (100 ug /ml) i de angivne tidsperioder, og lysater blev underkastet til Western blotting med de angivne antistoffer. Repræsentative resultater fra en ud af tre uafhængige forsøg er vist (venstre panel). Den resterende værdi for p53 blev beregnet som forholdet mellem de densitometriske værdier af p53 i løbet GAPDH i hver prøve (højre panel). De resterende gennemsnitlige værdier fra tre uafhængige forsøg blev afbildet. (F) GRIM-19 hæmmede p53 nedbrydning

in vivo

. Før høst af cellerne blev behandlet med MG132 i 4 timer, og immunpræcipitering med p53-antistof blev udført. Western blotting af IP-produkter var ved hjælp ubiquitin antistof. GAPDH antistoffer blev anvendt til at bestemme den tilsvarende belastning.

For at undersøge om GRIM-19 steg p53 via transkriptionel regulering, blev p53 mRNA-niveauer undersøgt ved kvantitativ RT-PCR og luciferase reporter assay blev udført i HeLa /PCON og HeLa /pG19 celler. Niveauet af p53-mRNA var upåvirket af overekspression af GRIM-19 (fig. 2C). Derudover gjorde p53-promotor-drevet luciferase reporter ikke afsløre væsentlige ændringer i p53 promoter aktivitet i HeLa /PCON og HeLa /pG19 celler (fig. 2D), hvilket tyder på, at GRIM-19 ikke er involveret i den transskriptionelle aktivering af p53.

i cervikale tumorer, er p53 sjældent muteret [23], og det hurtigt nedbrydes af E6 /E6AP [6], [24], vi næste undersøgt, om stigningen i p53-niveauer skyldes forøget halveringstid af proteinet . HeLa /pG19 og HeLa /PCON celler blev behandlet med cycloheximid og p53 proteinniveauer blev overvåget over tid. Faktisk halveringstiden af ​​p53-protein var signifikant (

s Restaurant 0,01) forlænget i HeLa /pG19 celler sammenlignet med HeLa /PCON celler (Fig 2E.).

In vivo

ubiquitinering assay viste også, at ubiquitinerede p53 i HeLa /pG19 celler dramatisk blev reduceret i forhold til HeLa /PCON celler (figur 2F).

Tilsammen disse resultater antydede, at GRIM-19 restaurerede p53 niveauer gennem stabilisering protein snarere end transkriptionel opregulering i cervikale tumorer.

GRIM-19 stabiliserer p53 protein ved at interagere med E6 og E6AP proteiner

E6 /E6AP-medieret p53 nedbrydning anses som en vigtig mekanisme i initiering og udvikling af cervikale karcinomer [23], [25]. Da GRIM-19 binder til 16E6 [26], vi hypotese, at GRIM-19 interfererer med E6 /E6AP kompleks og dermed beskytte p53 fra nedbrydning. Brug immunopræcipitationsanalyser med cellelysater fra HeLa-celler, fandt vi samspillet mellem GRIM-19 med E6AP

in vivo

(fig. 3A). Vi derefter undersøgt den GRIM-19-E6AP interaktion

in vitro

med GST pull-down-analyser. E6AP koder tre forskellige protein isoformer (I, II og III), der afviger i deres N-terminale haler, som alle har evnen til at stimulere E6-medieret ubiquitin-afhængige nedbrydning af p53 protein [27]. Fordi flere funktionelle domæner af E6AP tidligere var blevet identificeret [28], der genereres vi tre rekombinante plasmider udtrykker His-mærkede E6AP-III isoform-baserede sletninger: pE6AP-Δ1 (1-286 aa), pE6AP-Δ2 (287-521 aa) og pE6AP-Δ3 (522-872 aa). E6 bindingssteder var placeret mellem aa 287-521 af E6AP-III, mens HECT domæne for ubiquitin bindingssteder blev placeret i segment fra 522-872 aa (fig. 3C) [29]. Vi fandt, at kun E6AP-Δ3 bundet til GST-mærket GRIM-19 GST pull-down assay (fig. 3B-C), men ikke den katalytisk inaktive E6AP indeholdende en mutation på Cys i position 840 (fig S2), Disse resultater støttet vores konklusion, at GRIM-19 kan binde HECT domæne E6AP. At kortlægge den nøjagtige interagerende region GRIM-19 med E6AP, vi ansat GST-mærkede GRIM-19 sletninger pGST-G19-Δ1, pGST-G19-Δ2 og pGST-G19-Δ3; Og fandt at aminosyrer 1-35 af GRIM-19 var tilstrækkelige til binding E6AP proteiner (fig. 3D).

(A) Co-immunopræcipitationsanalyser blev udført for at bestemme interaktionen mellem GRIM-19 med E6AP

in vivo

. Cellelysaterne fra HeLa-celler blev immunfældet med normal IgG og anti-GRIM-19-antistoffer og Western blottet med anti-E6AP. Input (preIP) lane udgør 10% af ekstrakten anvendes ved immunoudfældning reaktionen. HC = IgG tung kæde. blev udført (B) GST pull-down eksperimenter for at undersøge interaktionen af ​​His-mærket E6AP sletninger med GST-sammensmeltet GRIM-19 protein

in vitro

. (C) Skematisk diagram af E6AP indikerer forskellige funktionelle domæner, herunder bindingssteder for GRIM-19. (D) Samspillet mellem GST-GRIM-19 sletninger med E6AP. * Angiver placeringen af ​​båndet med korrekte molekylære størrelse. (E) Co-immunopræcipitationsanalyser blev udført for at bestemme interaktionen mellem GRIM-19 med 18E6. Cellelysaterne fra HeLa-celler transficeret med p18E6-Flag blev underkastet IP med de angivne antistoffer. Input (preIP) lane udgør 10% af ekstrakten anvendes ved immunoudfældning reaktionen. LC = IgG let kæde. (F) Samspillet mellem GST-GRIM-19 sletninger med 18E6. * Angiver placeringen af ​​båndet med korrekte molekylære størrelse. (G) Sletning kortlægning af E6 eller E6AP bindingssteder på GRIM-19.

Vi har rapporteret samspillet mellem GRIM-19 med 16E6 før [26], vi derefter udforskes sammenslutningen af ​​GRIM -19 og 18E6. På grund af den lave ekspression af E6 og dårlig reaktivitet over tilgængelige E6 antistoffer, der er blevet rapporteret af en række publikationer [30], [31], [32], [33], vi kunne opnå en tilfredsstillende 18E6 Western blot fra cellelysater. Derfor blev et plasmid p18E6-Flag, der udtrykker en Flag-mærket 18E6 protein konstrueret. Gennem immunopræcipitationsanalyser i HeLa-celler transficeret med p18E6-Flag, fandt vi 18E6 co-udfældet med GRIM-19

in vivo

(fig. 3E). At kortlægge den nøjagtige interagerende region GRIM-19 med 18E6, vi beskæftigede bindingsstedet for GRIM-19 med 18E6 ved hjælp GST-mærket GRIM-19 sletninger (pGST-G19-Δ1, pGST-G19-Δ2 og pGST-G19- Δ3); Og fandt, at aminosyrerne 1-35 af GRIM-19 var tilstrækkelige til at binde 18E6 proteiner

in vitro

(fig. 3F).

Vi konkluderede derfor, at GRIM-19 kan binde både 18E6 og E6AP

in vivo og in vitro

, som kunne spille en rolle i ophobning p53 protein.

GRIM-19 forstyrrer E6 /E6AP kompleks og forøge E6AP ubiquitinering og nedbrydning

i betragtning af at både 18E6 og E6AP-Δ3 kan interagere med aminosyrerne 1-35 af N-terminalen af ​​GRIM-19 (fig. 3G), bestemte vi, om 18E6 konkurrerede med E6AP i bindende GRIM-19 ved at udføre konkurrence- pull-down-analyser. I nærvær af oprenset GST-G19-protein og stigende mængde E6AP-Δ3, bindingen af ​​18E6 til GRIM-19 faldt efterhånden som E6AP-Δ3 forøget (fig. 4A). Selvom E6AP-Δ2 undladt at interagere med GST-G19, er det velkendt, at denne region huser E6-bindingssteder [28]. Derfor testede vi, om GST-G19 og E6AP-Δ2 konkurrere i binding med 18E6. I nærvær af E6AP-Δ2, GST-G19-bundne 18E6 faldt sammenlignet med 18E6 præsenteret alene (fig. 4B). Desuden har vi ikke observere en sammenslutning af E6AP-Δ2 med GST-G19 i overværelse af 18E6, hvilket tyder på, at proteiner ikke kan danne et heterotrimert kompleks af 18E6 /E6AP-Δ2 /GST-G19.

(A ) Kompetitive assays blev udført for at analysere bindingen af ​​18E6 til GST, GRIM-19-fusionsprotein i nærværelse af stigende mængder af E6AP-Δ3 spænder fra nu 0-6 ug. (B) Pull-down eksperimenter for at bestemme bindingen af ​​18E6 til GST GRIM–19-proteiner. Hvor angivet E6AP-Δ2 proteiner (10 ug) blev tilføjet i GST Pull-down reaktion. (C) GRIM-19 augmented E6AP nedbrydning

in vivo

. Før høst af cellerne blev behandlet med MG132 i 4 timer, og immunpræcipitering med E6AP antistof blev udført. Western blotting af IP-produkter var ved hjælp ubiquitin antistof. GAPDH antistoffer blev anvendt til at bestemme den tilsvarende belastning. (D)

In vitro

E6AP ubiquitinering assay. Human rekombinant ubiquitin, E1, E2 (Ubch5c), batereria-udtrykt og oprenset GST og GTS-GRIM-19, blev E6AP (vildtype eller katalytisk inaktiv mutant CA) fra hvedekimekstrakt blandet i

in vitro

E6AP ubiquitinering assay og immunblottet med ubiquitin antistof. (E) Helcellelysater fra HeLa-celler, der udtrykker de angivne ekspressionsplasmider var Western blottet med de angivne antistoffer.

Det er blevet veletableret, at E6AP kan målrette sig for ubiquitinering, hvilket udgør en mekanisme til kontrol sin egen halveringstid [7], [34]. Vi udforsker derefter, hvis forekomsten af ​​GRIM-19 kan påvirke nedbrydningen af ​​E6AP, i overværelse af overudtrykt GRIM-19, ubiquitinerede E6AP væsentligt øget sammenlignet med HeLa /PCON celler (fig. 4C). In vitro ubiquitinering viste assay, der GRIM-19 forøgede autoubiquitination af vildtype E6AP, men ikke sin dominerende negative CA mutant med såvel oprenset E1 og E2 (Ubch5c), bakterier-udtrykte GRIM-19 og vildtype E6AP og CA mutant E6AP oversat i hvedekimekstrakt (fig. 4D). Faktisk fandt vi E6AP protein blev reduceret i celler med overekspression GRIM-19 (fig. 4E, S1).

Sammenfattende konkluderer vi, at GRIM-19 forhindrer p53 nedbrydning ved at hindre E6 /E6AP kompleksdannelse og fremmer ubiquitinering og nedbrydning af E6AP.

GRIM-19 forsinkelser G0 /G1 overgang, hæmmer celledeling og inducerer apoptose, og fremmes p53 ophobning in vivo

Da induktioner af cellecyklus anholdelse og cellevækst undertrykkelse er de vigtigste funktioner af p53, vi næste evalueret effekten af ​​GRIM-19-afhængig p53 stabilisering af cellecyklus. Cellecyklusfordeling analyser viste en signifikant forsinket G0 /G1 overgang i HeLa /pG19 celler sammenlignet med HeLa /PCON celler (tabel 1). Derudover, som vist ved MTT-assayet, celleproliferationen af ​​HeLa /pG19 celler var signifikant (p 0,05). Undertrykkes på dag 3 og dag 4 (. Figur 5A) sammenlignet med HeLa /PCON celler

(A ) en MTT assay blev udført i de angivne celler. MTT-assayet blev udført som i Materialer og Metoder. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SE for 8 prøver. (B) De morfologiske karakteristika HeLa /PCON og HeLa /pG19 celler blev undersøgt ved transmission elektronmikroskopi. Kromatin kondensering, ekspansion og udvidede nukleare membran huller, vag struktur kernemembranen blev brud på kernemembranen og endoplasmatisk reticulum ekspansion angivet med pile. ER, endoplasmatisk reticulum; NM, kernemembranen. (C) Den fulde længde og spaltes form af caspase-3 og PARP i HeLa /PCON og HeLa /pG19 celler blev bestemt ved Western blot-analyser. (D) HeLa /Con og HeLa /G19 celler blev transplanteret ind 6 uger gammel kvinde athymiske nøgne mus (10 mus for hver cellelinie) og dyrket i 6 uger. Tumorer blev høstet, og vægte blev målt. Dataene præsentere middelværdien af ​​10 tumorer i hver gruppe. (E) Ekspressionen af ​​GRIM-19, p53, p21, PUMA, p27 og E6AP i tumorerne afledt fra mus som bestemt ved Western blot-analyser, og repræsentative resultater er vist. (F) En model for samarbejdet mellem GRIM-19 og p53. Når GRIM-19 er til stede i høje niveauer, det interagerer med E6 /E6AP kompleks, fremmer deres ubiquitinering dermed forhindrer p53 nedbrydning. Tabet af GRIM-19 tillader angreb af E6 /E6AP kompleks på p53 og dets nedbrydning gennem proteasomet.

Fordi fremme celle apoptose er en anden vigtig funktion af p53, vi udførte celle apoptose assays herunder transmissionselektronmikroskopi (TEM) og Western blotting med caspase 3 og PARP antistoffer. En række tidlige apoptose karakteristika blev angivet i HeLa /pG19 celler, herunder nuklear chromatinkondensation, udvidet kløften kernemembranen, vag struktur kernemembranen, brud på kernemembranen og endoplasmatiske reticulum ekspansion; Imidlertid blev disse fænomener ikke observeret i HeLa /PCON celler (Fig. 5B pile). Desuden blev spaltningen af ​​caspase 3 og PARP steg i HeLa /pG19 celler sammenlignet med HeLa /PCON celler (fig. 5C).

Vi fandt også tumorvægte i mus transplanteret med HeLa /pG19 celler var signifikant reduceret sammenlignet med dem for kontrolgrupperne (

s Restaurant 0,05) (. figur 5D). GRIM-19 og p53, sammen med p21, blev PUMA og P27 proteiner signifikant forøget, men E6AP blev reduceret i tumorerne afledt af HeLa /pG19 celler sammenlignet med tumorer fra HeLa /PCON celler (Fig. 5E).

Endelig er baseret på vores observationer blev en model for GRIM-19-induceret celle apoptose ved at forstyrre E6 /E6AP kompleks og stabiliserende p53 spekuleret (fig. 5F). Denne model antyder, at tilstedeværelsen af ​​GRIM-19 fremmer auto-ubiquitinering og nedbrydning af E6AP ved at interagere med disse proteiner og bidrager til p53 stabilisering, vækststandsning og apoptose.

Discussion

Højrisikobetonet menneskelige papillomavirus (HR-HPV), såsom HPV18 og HPV16, der er forbundet med 99,7% af livmoderhalskræft [35], som er de mest almindelige gynækologiske tumorer i udviklingslandene [36]. De virale oncoproteiner E6 og E7 er udtrykt i HPV-positive cervikale carcinomer [6], mens det virale E2 protein undertrykker transkription af E6 /E7 oncogener og aktiverer viral DNA-replikation sammen med det virale E1 helicase [37], [38], [39]. Den E6 /E6AP medieret nedbrydning af p53 betragtes som en vigtigste mekanisme i initiering og udvikling af livmoderhalskræft [6], [11], [12], [25], [40], [41]. Nylige undersøgelser antydet, at interferens af E6 /E6AP komplekset kan dræbe cervikale tumorer ved at øge niveauet af p53-protein [11], [12], [40]. I vores undersøgelse præsenterer vi en ny tilgang til at forhindre p53 nedbrydning ved restaurering af GRIM-19, der forstyrrer E6 /E6AP kompleks.

Det er blevet rapporteret, at GRIM-19 kan undertrykke transkriptionsaktivitet af STAT3 gennem protein- protein interaktion, og hæmme kræft vækst [16], [17]. STAT3 er blevet vist at inhibere p53 ekspression via en transkriptionel repression i SRC onkogen-induceret signaleringsveje i visse gnaver cellelinjer [42]. Nogle undersøgelser i kræft cellelinjer viste en korrelation mellem høje konstitutive STAT3 aktivitet og p53 genmutationer, selvom årsag og virkning relationer ikke er etableret [43]. I visse hoved og hals pladecellecarcinomer, har p53 status vist nedregulerer NF-KB og STAT3 induceret genekspression [44]. Vi har vist i vores tidligere publikation, GRIM-19 tab korrelerer med en høj STAT3 aktivitet i primære livmoderhalskræft [20]. Selv om sådanne observationer tyder på en mulighed for, at tab af GRIM-19 fremmer høj STAT3 aktivitet, som i sidste ende transkriptionelt ned kunne regulere p53 udtryk, vores undersøgelser ikke afsløre (fig 2C . D) eventuelle ændringer i ekspressionen af ​​luciferase reporter drevet af menneskelig p53 promotor og af endogent p53-mRNA. Derfor kan STAT3 deregulering ikke en direkte konsekvens af p53-ekspression i vores model. Således to bistert 19 uafhængige veje: 1) en aktivering af STAT3 og 2) en nedregulering af p53 samtidigt forekomme i HPV transformeret cervikale carcinomer til fremme tumorigenese efter tab af GRIM-19-ekspression. Endnu vigtigere, Interferens med STAT3 udtryk ved hjælp RNA

jeg

eller dens funktion ved hjælp dominerende negative tilgange (Fig S3) ændrede ikke signifikant Grim-19 effekter på p53 stabilisering. Derfor p53 protein stabilisering af GRIM-19 synes at forekomme uafhængigt af STAT3.

I dette papir, vi også testet, om GRIM-19 hæmmer p53 nedbrydning i fravær af E6. To HPV negative celler HO8910 og A549, som begge indeholdt vildtype p53 [45], blev undersøgt for deres p53-ekspression efter overekspression af GRIM-19. Selvom GRIM-19 var i stand til at øge nedbrydningen af ​​E6AP i disse to celler, protein niveauer af p53 forblev uændret (figur S1), hvilket antyder, at GRIM-19 er i stand til at forhindre E6-afhængig p53 nedbrydning.

nylige rapporter har vist, at GRIM-19 kan interagere med nogle andre vigtige fysiologiske proteiner, såsom HtrA2 [46]; Desuden kan virale proteiner, såsom U95 og vIRF1 også binde til GRIM-19 [21], [26], [47]. Vi har tidligere vist en association mellem 16E6 og GRIM-19 [26]; her, vi fandt også samspillet mellem GRIM-19 med 18E6 og E6AP

in vivo

in vitro

, og induktion af autoubiquitination nedbrydning af E6AP ved GRIM-19. I HR-HPV-infektion cervikale cancerceller, GRIM-19 var i stand til at inducere akkumulering af p53-proteinet og øge p53 target gener, såsom p21 og PUMA. Derudover blev der observeret signifikante ændringer på cellecyklussen profil, celleproliferation, og de karakteristiske morfologiske tegn på apoptose i HeLa-celler overekspression af GRIM-19. Således kan GRIM-19 og p53 synergistisk undertrykke livmoderhalskræft vækst kræftcelle.

E6AP er en kritisk regulator af p53 nedbrydning i humane livmoderhalskræft i en E6 afhængig måde. Bortset fromp53 har E6 /E6AP kompleks blevet rapporteret at forstyrre flere cellulære funktioner [48], herunder transkriptionelle aktivatorer såsom IRF3, co-aktivatorer sådan ASP300, apoptose induktorer såsom Bak, GADD34, procaspase-8 og dens adapter FADD, proteinkinaser såsom Tyk2, celleadhæsion associeret molekyler såsom paxillin, og NFX1-91, en molekyler der dæmper telomeraseaktivitet. I de fleste af disse tilfælde E6 /E6AP komplekse mål disse proteiner til nedbrydning for at tillade onkogen transformation [48]. E6 interaktion med E6AP er blevet rapporteret at være vigtigt for hudkræft i transgene musemodeller [49], [50]. E6AP er også rettet mod proteiner i en E6-uafhængig måde. Faktisk er der rapporteret adskillige substrater, såsom medlemmer af Src-familien af ​​proteinkinaser [51], Polycomb protein Ring1B [52] og promyelocytisk leukæmi (PML) protein [53]. Naturligt forekommende sporadiske E6AP mutationer er associeret med Angelman syndrom, en alvorlig form for mental retardering, hvor akkumulering af ikke-nedbrudte proteinaggregater er blevet rapporteret [52], [54], [55], [56]. Således E6AP protein i association med E6 og i nogle situationer på eget spiller en central rolle i proteinnedbrydning kontrollerer adskillige humane patologier.

Fordi E6AP også fungerer som en dobbelt funktion coaktivator for steroidhormonreceptorer (SHR’er), herunder progesteronreceptor, østrogenreceptor, androgen receptor, glucocorticoid receptor, retinoinsyre receptor-α og thyroidhormonreceptor [29], [57], og aminosyrerne fra 170 til 680 er det aktiverende domæne af E6AP [29], interaktionen af GRIM-19 med E6AP (522-872 aa) kunne forudsige, at GRIM-19 sandsynligvis regulerer SHR-afhængig gentranskription.

sammenfattende vores studier for første gang viser en ny mekanisme, som GRIM-19 blokke E6 /E6AP kompleks; og samarbejdet mellem to forskellige tumor suppressor proteiner i reguleringen cellevækst.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle cervikale væv blev opnået fra patienter, som gennemgik hysterektomi fra januar 2008 og november 2009 på Anhui Provincial Hospital tilknyttet Anhui Medical University, Hefei, Kina. Undersøgelsen blev gennemgået og godkendt af den etiske gennemgang bestyrelse Anhui Provincial Hospital. Skriftligt samtykke blev opnået fra hver patient.

Alle dyr eksperimentelle procedurer udført i denne undersøgelse er blevet godkendt af Laboratory Animal fra den etiske komité i Anhui Provincial Hospital Tilknyttet til Anhui Medical University under tilladelsens nummer 201000179, og var i overensstemmelse med retningslinjerne for dyr pleje fastsat af dette udvalg.

Tumorer

En del af frisk udskårne væv blev paraffinindlejrede, skåret i 5- til 7-um-tykke sektioner for patologisk diagnose, og resten af ​​vævet blev nedfrosset ved -80 ° C til yderligere anvendelse for at ekstrahere proteiner og RNA. Kliniske stadier blev bestemt af en certificeret gynækologisk patolog ifølge en modificeret International Federation of Gynækologi Obstetrik (FIGO) iscenesættelse for livmoderhalskræft i 2000. De 60 ikke-metastatiske planocellulære epitel karcinom undersøgt i disse studier var HPV16 eller HPV18 positive og tilhørte skrive la (13 patienter), Ib (9 patienter) og IIa (38 patienter). Derudover 45 normale cervikale væv fra patienter, som gennemgik hysterektomi til andre formål end neoplasi af enten livmoderhalsen eller endometriet årsager blev indsamlet og anvendt som normale kontroller i denne undersøgelse.

Cell kultur og transfektion

Menneskelig cervikale cancercellelinier HeLa, SiHa og CaSki og den humane lunge adenocarcinom cellelinie A549 fra American Type Culture Collection (ATCC) blev dyrket DMEM med 10% føtalt bovint serum. Den menneskelige æggestokkræft cellelinje HO8910 blev købt fra celle bank af det kinesiske Academy of Sciences [58], [59] og dyrket i komplet RPMI-1640. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) blev anvendt til transfektion. Den stabilt transficeret cellelinier HeLa /PCON og HeLa /pG19 udtrykke styrevektor og human GRIM-19 henholdsvis blev beskrevet tidligere [20].

tumorxenoplantater

Dyrene blev opdrættet under standard laboratorium betingelser. To grupper (10 i hver gruppe) af 6 uger gammel kvinde athymiske nøgne mus (Beijing forsøgsdyr center) blev implanteret subkutant på højre flanke af mus med enten HeLa /pG19 eller HeLa /PCON celler (1 x 10

7) i 0,1 ml PBS indeholdende 50% matrigel. Alle mus blev holdt i et patogenfrit miljø. Ved slutningen af ​​forsøget (6 uger efter implantation) blev musene aflivet, tumorerne blev opsamlet og vejet. En del af hver tumor blev forarbejdet til immunohistokemiske og biokemiske analyser, og resten blev frosset ved -80 ° C indtil anvendelse.

Plasmider

Plasmiderne LZRSpBMN-linker-IRES-EGFP-STAT3C (STAT3C), der udtrykker en konstitutivt aktiv mutant STAT3 og LZRS pBMN-linker-IRES-EGFP-STAT3DN (STAT3DN), der udtrykker en dominerende negativ mutant STAT3 var gaver fra Dr. Hodge DR som tidligere [60] beskrevet. De tomme vektor pIRES-Puro2-myc (PCON) og pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc (pG19), der udtrykker en Myc-mærket GRIM-19 blev beskrevet tidligere [20].