PLoS ONE: Fluorescens in situ-hybridisering og Immunhistokemi som Diagnostiske Metoder til ALK Positiv Ikke-småcellet lungekræft Patients

Abstrakt

Baggrund

anaplastisk lymfom kinase (ALK) positivitet repræsenterer en roman molekylær mål i en delmængde af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Vi udforsker Fluorescens

in situ

hybridisering (FISH) og Immunhistokemi (IHC) som diagnostiske metoder for ALK-positive patienter og beskrive dens udbredelse og udfald i en population af NSCLC patienter.

Metoder

NSCLC patienter, der tidligere screenet for epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) på vores institution blev udvalgt. ALK positive patienter blev identificeret ved FISH og værdien af ​​IHC (D5F3) blev undersøgt.

Resultater

nioghalvfems patienter blev identificeret. Median alder var 61,5 år (range 35-83), alle var kaukasiere, firs procent var adenokarcinomer, enoghalvtreds procent var mænd og otteogtredive procent var rygere. Syv (7,1%) patienter var ALK positive ved FISH, tretten (13,1%) var EGFR mutant, og 65 (65,6%) var negative /Wild Type (WT) for både ALK og EGFR. ALK positivitet og EGFR-mutationer var gensidigt udelukker hinanden. ALK-positive patienter tendens til at være yngre end EGFR muterede eller wt patienter. ALK-positive patienter var overvejende aldrig rygere (71,4%) og adenocarcinom (71,4%). ALK positive og EGFR mutant patienter har et bedre resultat end negativ /WT. Alle patienter med ALK FISH negative tumorer var negative for ALK IHC. Ud af 6 patienter positive for ALK FISH med mere væv til rådighed, 5 var positive for ALK IHC og en negativ.

Konklusioner

ALK-positive patienter udgør 7,1% af en population af udvalgte NSCLC. ALK positive patienter har forskellige kliniske funktioner og et bedre resultat end EGFR WT og ALK negative patienter. IHC er en lovende metode til påvisning af ALK-positive NSCLC patienter

Henvisning:. Martinez P, Hernández-Losa J, M

en Ángeles Montero, Cèdres S, Castellvi J, Martinez-Marti A, et al. (2013) Fluorescens

In Situ

hybridisering og Immunhistokemi som Diagnostiske Metoder til ALK Positiv ikke-småcellet lungekræft Patienter. PLoS ONE 8 (1): e52261. doi: 10,1371 /journal.pone.0052261

Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: Juni 25, 2012; Accepteret 31. oktober, 2012; Udgivet: januar 24, 2013 |

Copyright: © 2013 Martinez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-. dødsfald på verdensplan, der tegner sig for mere end 1 million dødsfald om året. [1] Selvom cytotoksisk kemoterapi fortsat grundpillen i behandling for de fleste patienter med fremskreden ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), [2] identifikationen af ​​specifikke genetiske læsioner, som driver proliferation af cancerceller har ført til udviklingen af ​​nye target behandlinger i en undergruppe af patienter med NSCLC [3], [4]. I de seneste år, anaplastisk lymfom kinase (ALK) omlejring, overvejende med pighuder mikrotubulus-associeret protein like 4 (EML4) genet, er blevet identificeret som et onkogent begivenhed i en undergruppe af NSCLC-patienter [4]. ALK translokation resulterer i konstitutiv ekspression af tyrosinkinasedomænet af ALK-protein, hvilket resulterer i tumor udvikling og vækst. Den onkogen afhængighed af denne begivenhed er demonstreret på det grundlag, at fjernelse ALK-aktivitet vender den maligne mønster og vækst [5]. For nylig resultaterne af en fase 1-studie evaluering af en ALK-inhibitor, Crizotinib, hos patienter med ALK positiv NSCLC demonstrerede opmuntrende resultater [6]. Kliniske forsøg med Crizotinib og andre ALK-hæmmere i denne delmængde population af ALKs positive NSCLC patienter pågår.

De første rapporter har vist, at ALK-positive NSCLC patienter tendens til at være yngre, overvejende ikke /lys rygere med en adenocarcinom histologi end den samlede NSCLC patienter population [7]. Disse klinisk-patologiske funktioner er også hyppig hos patienter med EGFR-mutationer, men begge genetiske begivenheder synes at være gensidigt udelukkende [8]. I uselekterede patienter med NSCLC Forekomsten af ​​ALK positivitet fra 1% til 7% [9], men mere end 30% hos patienter udvalgt til EGFR Wild-type (WT), adenocarcinom og ingen rygning historie [7]. Dens forekomst i et udvalgt europæisk bestand af NSCLC-patienter er det ikke endnu kendt.

Alligevel har ALK-positive NSCLC patienter og deres særlige characterictics blevet belyst, men en klar definition af ALK positivitet fortsat et udfordrende problem. De første rapporter om forekomsten af ​​EML4-ALK omlejringer anvendt RT-PCR til påvisning af patienter, som regel som en retrospektiv analyse af resektion prøver fra NSCLC patienter [4], [9]. Men denne metode er i stand til at opdage ukendte EML4-ALK varianter eller rearrangementer med andre partnere forskellige fra EML4. Nye platforme er udviklet til at levere denne mangel [10]. Til udvælgelse af patienter i Crizotinib forsøg, FISH med en pause fra hinanden sonde til ALK er den diagnostiske metode. FISH test muliggør påvisning af ALK translokationer, ingen spørgsmål partneren eller varianten, men ALK positivitet definition af FISH og begrænset brug til resektion eller biopsi prøver er begrænsninger [11]. Inmunoshistochemistry (IHC) er også blevet undersøgt. IHC analyser ved hjælp af antistoffer mod ALK protein anvendes i hæmatologiske malignances har vist dårlig følsomhed hos patienter med NSCLC, sandsynligvis på grund af de lavere ALK protein niveauer udtrykt i forhold til hæmatologiske malignances med ALK omlejringer. Den nye høj følsomhed monoklonalt antistof D5F3 synes at have nok nøjagtighed at identificere patienter, der skal gengives verdensomspændende måde [12], som alle patienter, hvor der var væv nok i fase 1 Crizotinib forsøg tidligere er valgt af FISH positivitet også positive ved IHC , mens kun to af tre dele af disse patienter var positive ved RT-PCR. FISK negative prøver og normale lungevæv ikke udtrykke ALK protein ved IHC [6]. For nylig er andre diagnosemetoder også blevet undersøgt [13], [14].

Formålet med denne undersøgelse er at undersøge forekomsten af ​​ALK positivitet i en europæisk kohorte af udvalgte NSCLC-patienter efter FISH, for bedre at definere de kliniske funktioner og resultater og for at udforske IHC som metode test diagnostisk for ALK i NSCLC patienter.

patienter og metoder

patienter

Alle inkluderede patienter havde fået behandling eller konsultation fra Medical Oncology service på Vall d’Hebron Universitetshospital. Alle NSCLC patienter, som tidligere screenet for EGFR mutation status mellem maj 2006 og januar 2010, var valgt. EGFR mutationsanalyser var blevet udført baseret på en medicinsk tilfælde pr sag indikation under hensyntagen køn, histologi og rygehistorie men uden faste parametre. Medicinske optegnelser blev revideret og basal klinisk-patologiske træk, behandlinger og resultater registreres. Hvis væv var til rådighed for ALK-analyser blev patienterne først testet af FISH derefter ved IHC. Den institutionelle etiske komité og godkendt denne undersøgelse.

Tumor prøver

Ufarvede dias fra formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) tumor prøver fra biopsier eller celle blokke rekonstruerede fra cytologi eller, i fraværet af dette, blev dias fra cytologi derefter analyseret.

EGFR mutations analyser

DNA Extraction.

prøver fås ved FNA og FFPE blev fordøjet i 48 timer med proteinase K og 180 pi G2 fordøjelse buffer ved 37

aC, derefter blev DNA’et ekstraheret med EZ1 DNA Tissue Kit med en BioRobot EZ1 arbejdsstation eluering prøverne i 50 pi efter producentens anvisninger. Koncentration og renhed af det ekstraherede DNA blev bestemt ved spektrofotometri og derefter DNA’et blev opbevaret ved -20 ° C.

PCR-amplifikation og direkte sekventering.

PCR blev udført i 30 pi volumener ved anvendelse 50 ng template-DNA, 0,75 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin-Elmer, Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ), 3 pi PCR-buffer (Perkin-Elmer), 0,8 mmol /l deoxynukleotidtriphosphat (Promega), 0,5 umol /L af hver primer, og koncentrationer af MgCl2, Exon 19 og 21 blev amplificeret ved PCR. Primersekvenser blev opnået som beskrevet i supplerende data. PCR-programmet blev udført ved 35 cyklusser af denaturering ved 94 ° C i 45 s, primerannealing ved 58 ° C i 30 s, og forlængelse ved 72 ° C i 30 s. En endelig ekstension forløb ved 72 ° C i 10 min. Båndene af PCR-produkter blev visualiseret ved elektroforese i gel med BRET. Hver prøve blev sekventeret i to eksemplarer på både fremad og bagud ved hjælp af BigDye Terminator Kit 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) og en ABI prisme 310 (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. Sekvenserne blev derefter sammenlignet med GenBank-arkiverede humane sekvens for

EGFR

(tiltrædelse nummer AY588246) ved kulørtheder Pro Software.

EGFR bestemmelse ved real time PCR.

Alle sager blev analyseret ved hjælp af TheraScreen EGFR PCR Kit (Qiagen. Manchester Ltd) at følge producentens anvisninger for at opdage mutationer i real-time PCR-reaktioner. Real-time PCR blev udført ved hjælp af en ABI7500Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA) under følgende betingelser:. Data blev analyseret ved hjælp af 7500-softwaren (version 2)

Fluorescens

in situ

hybridisering (FISH)

Vi forberedte 4 um paraffinindlejrede histologiske snit til FISH-analyse. Den kommercielle Vysis LSI

ALK

Dual Color, Break Apart omlejring Probe (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) blev anvendt i overensstemmelse med producentens anvisninger. Resultater blev analyseret i et fluorescensmikroskop (Nikon 501) under anvendelse af Isis fluorescensafbildning systemsoftware. Mindst 100 kerner blev scoret. En FISH positiv sag blev defineret som at have mere end 15% tumorceller viser adskilt grønne og røde signaler eller enlige røde signaler identificeret celler med omarrangeret

ALK

. FISH blev udført og analyseret af to forskellige patologer.

Immnunohistochemistry

Kort 3 um-tykke snit blev skåret fra vævsprøver og placeret på poly-L-lysin-coatede objektglas. Alle objektglas blev farvet med ALK-antistof (klon D5F3 Cell Signalling Technology) fortyndet 1:50 ved hjælp af en Ventana Ultraview DAB afsløring kit i en Ventana BenchMark XT processor (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Antigen-genvinding var en standard automatiseret proces på Ventana BenchMark XT ved 37 ° C i 16 minutter. Alle objektglas blev analyseret af to forskellige patologer og klassificeret. Prøver blev anset for at være IHC-positiv, hvis en tumor-specifik farvning af enhver intensitet i ≥10% af tumorcellerne var til stede.

Statistiske analyser

Medmindre andet er angivet, for analyserne af kliniske og molekylære markører på patientprøverne blev Fishers eksakte test anvendes til at vurdere sammenhængen mellem kategoriske variable, og Students t-test blev anvendt til at vurdere association mellem fordelingerne af behandlingsresultatet. Alle rapporterede p-værdier er tosidet, medmindre andet er angivet, og vi betragtes som en test, som statistisk signifikant, hvis p ≤ 0,05. For at sammenligne korrelationen mellem FISH og IHC at opdage ALK-positive patienter, vi brugte en kappa metode.

Resultater

Mellem maj 2006 og januar-2010 er i alt 99 patienter, der tidligere screenet for EGFR mutationer med væv tilgængelig for ALK-analyser ved hjælp af FISH blev identificeret. Tilgængeligheden af ​​væv til FISH og IHC analyser blev vurderet som positivt af eksistensen af ​​en FFPE blok eller dias fra cytologi i arkiverne i vores institution. Efter procedurerne undersøgelse var der ikke nok væv til at udføre en gyldig FISH assay i 14 patienter. For IHC-analyse var dette tal højere, nemlig 19 patienter.

Basale egenskaber ved patienterne er sammenfattet i tabel 1 (tabel 1). Patienterne var overvejende adenokarcinomer (80%) og aldrig /tidligere rygere (62%) med ligelig fordeling af køn.

Af de 99 tumorprøver screenet, 13 patienter (13,1%) nærede en aktiverende EGFR-mutation , 7 patienter (7,1%) var ALK positive og 65 patienter (65,7%) var EGFR WT og ALK negativ, og hos 14 patienter (14,1%) var der ikke nok væv til at udføre en gyldig FISH assay for ALK (tabel 2). EGFR mutation og ALK positivitet var gensidigt udelukkende.

ALK-positive patienter tendens til at være yngre (56 år) end EGFR mutant (63 år) eller EFGR WT /ALK negative (62 år) patienter, men disse forskelle var ikke statistisk forskellige. Der var ikke nogen klar køn prævalens for ALK-positive patienter (4 tæver og 3 hanner). Fem af dem var aldrig rygere (71%) og 2 var rygere på tidspunktet for diagnosen. Alle ALK-positive patienter havde en ikke skællede histologi, 5 af 7 patienter var adenokarcinom og de andre 2 patienter havde en ikke andetsteds specificeret (NOS) NSCLC. Fire af de 5 ALK positive adenocarcinom patienter viste en solid og acinære vækstmønster og desuden fire af de fem viste et mønster med signerede ring celler var til stede. (Figur 1)

FISH-analyse ved anvendelse af en pause fra hinanden probe. Positive celler udviser en fusion af de røde og grønne signaler svarende til det intakte kromosom, og de opdelte signaler, der indikerer ALK omlejring (pile). Immunhistokemi for ALK i en NSCLC hjælp D5F3 antistof. Tumorcelleresistens show cytoplasmatisk ekspression af proteinet, mens resten af ​​cellerne er helt negativ (20 ×).

EGFR mutant patienter havde også en overvejende adenocarcinom histologi (100%) og var overvejende aldrig rygere (71 %), men med en klar køn disposition for kvinder (77%).

EGFR vægt /ALK negativ gruppen og EGFR vægt /ALK ukendt gruppe adskilte sig ikke i deres basale egenskaber og var sammenlignelige med de særlige kendetegn ved hele kohorte af 99 patienter.

Vi udforskede også den bedste kliniske respons med en EGFR TKI eller platinbaseret kemoterapi regime i metastatisk eller recidiverende patienter i henhold til EGFR og ALK-status. Som forventet, ALK-positive patienter behandlet med erlotinib havde nogen objektivt respons; har dog kun to ALK-positive patienter blevet behandlet med EGFR TKI s. Ingen svar til EGFR vægt /ALK negative patienter blev set blev behandlet med en EGFR TKI. Derimod blev en 75% af svarene ses i gruppen af ​​EGFR mutant patienter. Svar på første linje platinbaseret kemoterapi var 29% for ALK-positive patienter, 60% for EGFR mutant patienter og 40% for EGFR WT /ALK negativ. (Tabel 3)

På tidspunktet for analysen, median opfølgning af de 65 patienter med fremskreden /recidiverende NSCLC var 9,5 måneder blandt patienterne stadig i live; på det tidspunkt havde 57 patienter døde. Vi analyserede samlet overlevelse (OS) af patienter i henhold til ALK og EGFR genotype. Median OS til EGFR vægt /ALK negative patienter var 4,5 måneder, for EGFR mutant patienter var 15,7 måneder (p = 0,018) og havde været ikke nået til ALK-positive patienter (p = 0,103). I ALK positive gruppe var der fire patienter (af i alt syv), som havde fået crizotinib som en del af deres behandling på engang i løbet af deres sygdom. (Figur 2)

Endelig har vi foretaget en ALK IHC med D5F8 antistof i de 80 patienter, hvor der var materiale stadig er til rådighed efter EGFR og FISH analyser (Figur 3). Alle 73 patienter er negative for ALK ved FISH var også negative for IHC. Af seks ALK FISH positive patienter testet for IHC, 5 var positiv og en negativ. Dette resulterer i en positiv prædiktiv værdi for IHC med D5F8 antistof på 100% og en global god aftale (Kappa 0,783, interval 0,642-0,924) (tabel 4).

Diskussion

ALK-aktivering er blevet identificeret som en chauffør onkogen ændring i en delmængde af NSCLC patienter. Omlejringer involverer ALK-genet er et eksempel på onkogen afhængighed. ALK positive patienter viser overvejende en adenocarcinom histologi, aldrig /lys rygning historie og yngre alder ved diagnose. Developement af nye lægemidler rettet mod denne ændring førte til imponerende tumor respons i denne undergruppe af patienter. [6] For nylig crizotinib, et lille molekyle, som inhiberer tyrosin kinase aktivitet af ALK, er blevet godkendt til behandling af patienter med fremskreden ALK positiv NSCLC efter imponerende resultater i tidlige studier. Samtidig har en diagnostisk molekylær FISH-test blevet godkendt af Food and Drug Administration til påvisning ALK-positive patienter. Tilsammen disse to forhold, viser, hvor vigtigt er i en tid med target behandlingsformer til at identificere og validere en biomarkør for udvælgelse af de patienter, mere egnet til at opnå en fordel, selv da den tidligste udvikling.

I vores rapport, vi vælge en delmængde af patienterne på det grundlag, at tidligere bestemmelse af EGFR status lad os til at identificere en population af patienter mere egnede til at huse en ALK ændring. Denne kriterier, ved hjælp af en biomarkør, ville lade os med at identificere en beriget population af NSCLC patienter, hvor molekylære funktioner blev anset klinisk relevant. I denne kohorte, forekomsten af ​​EGFR-mutationer var 13,1%, hvilket er tæt på den frekvens, rapporteret af den spanske Lung Cancer Group i en lignende population [15], der indirekte indikerer, at vores valgte befolkning udgør det samlede beløb af patienter hvad vælger for EGFR screening i rutinemæssig praksis. ALK-positive patienter med FISH repræsenterer i vores undersøgelse en 7,1% af den samlede, hvilket er samstemmende med publikationer andre efterforskere i denne population af patienter [7] – [9], [16] og er den første ALK forekomsten rapport i en kohorte af overvejende metastatiske europæiske NSCLC patienter.

Som tidligere rapporteret, ALK-positive patienter var overvejende adenokarcinomer, med lav tidligere rygning historie og tendens til at være yngre end den mængde NSCLC patienter. Derfor har ALK-positive patienter ikke vise svar på EGFR TKI s men en tilsvarende fordel af kemoterapi end ALK negative patienter. Selvom tidligere rapporter har tyder på, at pemetrexed kunne være den foretrukne kemoterapeutiske agent for ALK-positive patienter [17], [18], på grund af den lille størrelse af vores ALK positive population var vi ikke i stand til at udføre denne analyse. Interessant, to af ALK-positive patienter i vores serie var rygere i øjeblikket for diagnosen.

De seneste data tyder på, at i mangel af ALK målrettet agenter ALK positivitet er en skadelig prognostisk faktor for NSCLC patienter [19 ]. Men hos patienter med fremskreden, ALK-positive NSCLC, er crizotinib terapi forbundet med forbedret overlevelse sammenlignet med crizotinib-naive kontroller [20]. I vores undersøgelse, vi analized overlevelse baseret på molekylær status uanset bliver behandlet med crizotinib eller anden ALK-inhibitor og finde, at de, ALK positive NSCLC-patienter tendens til at leve længere end EGFR vægt /ALK-negative patienter. Vi har ikke foretaget en analyse af overlevelse for ALK-positive patienter justering for crizotinib behandling på grund af den lille størrelse af kohorten. Alligevel fire af ALK-positive patienter var blevet behandlet med crizotinib på tidspunktet for overlevelse analyse. Tilsammen indikerer disse resultater, at i en tid med de ALK mål behandlingsformer, ALK positiv NSCLC patienter har et bedre resultat end EGFR WT /ALK negative patienter. Disse resultater bør dog analized med forsigtighed,, en af ​​selektionsbias i denne undersøgelse er, at patienter med en dårligere performance status end den samlede lungekræftpatienter var blevet inkluderet. Den væsentligste årsag til, at bias er, at patienter med bedre ydeevne var blevet ansat i kliniske forsøg og EGFR blev ikke testet på vores lokale laboratorium. En anden mulig skævhed er, at patienter med dårlig performance o større co-morbiditet EGFR mutationsstatus blev analyseret som disse patienter ikke var egnet til at modtage anden form for behandling end EGFR TKI er hvis en EGFR mutation blev demonstreret. Begge fordomme kan beriget vores kohorte med patienter med fattigere resultater og dermed kun 15 af patienterne EGFR vægt /ALK negative patienter blev behandlet med en platinun kemoterapi.

Et vigtigt spørgsmål for klinikerne er at identificere de patienter, der er egnede til behandling med crizotinib. FISH-analyse er standardmetoden. Imidlertid IHC er blevet undersøgt af forskellige grupper i et forsøg på at identificere en mere global egnet fremgangsmåde til screening og diagnosticering af ALK-positive patienter. Første antistoffer, der tidligere blev anvendt til diagnosticering af haemathological malignances, viste har ikke nok følsomhed, der skal anvendes i ALK-positive patienter [12]. Siden dem, har to højfølsomme strategier blevet udforsket. En af dem er at forbedre test følsomhed og at udvikle en IHC score for udvælgelse af patienter til FISH-analyse [21], [22]. En anden tilgang er at udviklede høj følsomhed og specificitet ALK-antistoffer, der førte identificere ALK-positive patienter af sig selv [23], [24]. I vores undersøgelse, brugte vi en ny stor følsomhed og specificitet monoklonalt antistof D5F3 i en kohorte af udvalgte patienter med NSCLC parallelt med FISH til at identificere ALK-positive patienter. Vi fandt, at alle ALK-positive patienter med IHC var også positive ved FISH. Men en FISH positive patient resulterede negativ ved IHC. At falsk negative patient havde ikke mere tilgængeligt væv til at gentage analysen, men tidligere er blevet rekrutteret i en crizotinib forsøg med en anden FISH positive analyse i den centrale laboratorium af undersøgelsen. Taget sammen, vi kunne for at konkludere, at en positiv IHC analyse med D5F3 monoklonale antistof bør være nok til at vælge en patient for at modtage behandling med en ALK inhibitor som ingen patienter positive for IHC blev fundet at være negative med FISH. Når en kliniker bør overveje at udføre en FISH-analyse i en patient med et negativt resultat ved IHC, eller omvendt, er et spørgsmål, der bør behandles i fremtiden. Endnu mere, hvad er meningen med en FISH-test positivitet i mindre end 15% af cellerne, eller hvad der skal ske med disse patienter uden overensstemmende resultater med IHC og FISH er nogle af de hensyn spørgsmål, der skal standardiseres i fremtiden.

for at konkludere, i vores undersøgelse viste vi, at forekomsten af ​​ALK-positive patienter er 7,1% i en kaukasisk udvalgt population af NSCLC med FISH. I en tid med ALK målrettede behandlinger ALK positive patienter har forskellige kliniske funktioner og en bedre prognostisk end EGFR WT og ALK negative patienter. IHC med D5F3 monoklonalt antistof mod ALK er en præcis metode til påvisning af ALK-positive NSCLC patienter.