PLoS ONE: SMURF1 Amplification Fremmer invasiv i pancreas Cancer

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen er en dødelig sygdom, og der er et presserende behov for nye terapeutiske mål. Vi har tidligere identificeret DNA-amplifikation ved 7q21-q22 i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Nu ved høj opløsning genomisk profilering af humane bugspytkirtelkræft cellelinjer og humane tumorer (indpodet i immundefekte mus at berige kræft epitelial fraktion), definerer vi en 325 Kb minimal amplikon spænder

SMURF1

, en E3 ubiquitinligase og kendt negativ regulator af transformerende vækstfaktor β (TGFp) vækstinhiberende signalering.

SMURF1

forstærkning blev bekræftet i primære humane pancreascancer ved fluorescens

in situ

hybridisering (FISH), hvor 4 af 95 tilfælde (4,2%) udviste forstærkning. Ved RNA-interferens (RNAi), knockdown af SMURF1 i en human bugspytkirtelkræft linje med fokal amplifikation (AsPC-1) ændrede ikke cellevækst, men førte til reduceret celleinvasion og forankringsuafhængig vækst. Interessant nok blev denne effekt ikke medieret gennem ændret TGFp signalering, analyseret ved transkriptionel reporter. Endelig overekspression af SMURF1 (men ikke en katalytisk mutant) førte til tab af kontaktinhibering i NIH-3T3 muse embryo fibroblastceller. Sammen identificere disse resultater

SMURF1

som en forstærket onkogen kørsel flere tumorigene fænotyper i bugspytkirtelkræft, og give en ny druggable mål for molekylært rettet terapi

Henvisning:. Kwei KA, Shain AH, Bair R, Montgomery K, Karikari CA, van de Rijn M, et al. (2011)

SMURF1

Amplification Fremmer invasiv i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 6 (8): e23924. doi: 10,1371 /journal.pone.0023924

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: December 14, 2010; Accepteret: August 1, 2011; Udgivet: 22 August, 2011

Copyright: © 2011 Kwei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH: CA112016 (JRP), CA09151 (KAK), GI Cancer SPORE CA62924 (AM); NIH /NCRR CTSA give UL1 RR025744 til Stanford Spectrum; og Lustgarten Foundation (J.R.P.). M.D.B. blev delvist understøttet af en Biotechnology oversøisk associateship fra Institut for Bioteknologi, Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Indiens regering. Forfatterne takker også familien af ​​Margaret Lee og Sol Goldman kræft i bugspytkirtlen Forskningscenter for støtte xenografting indsatsen på Johns Hopkins. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

pancreas duktalt adenokarcinom (herefter, kræft i bugspytkirtlen) er næsten altid dødelig, med en fem års overlevelse mindre end 5% [1]. Det er ofte formidles på diagnose, og kan metastaserer bredt. Tidlig opdagelse kan forbedre overlevelsen, men kirurgisk resektion er sjældent kurativ [2]. Kræft i bugspytkirtlen er også i høj grad modstandsdygtige over for konventionel kemoterapi. Derfor er der et akut behov for nye behandlingsformer. I særligt, vil det være vigtigt at opdage og validere nye mål for molekylært-rettet terapi.

De molekylære genetik bugspytkirtelkræft er delvist kendt [3], [4]. Somatic aktiverende mutationer af

KRAS

(undertiden forekommer med genamplifikation) findes i 90% af pancreascancer. Også almindelige er inaktivere mutationer /sletninger af tumorsuppressorer

CDKN2A

( 95% af kræft),

TP53

(50-75%), og

Smad4

(også kendt som

DPC4

) (55%), en effektor af TGFp-medieret vækstinhibering. Andre genmutationer, hver forekommer hos mindre end 5% af kræftformer, indvirkning disse og andre centrale kræft signalveje [5].

Genomisk profilering undersøgelser, ved matrix-baserede komparativ genomisk hybridisering (array CGH), er begyndt at katalogisere DNA amplificeringer og sletninger, indkredse og afslørende nye bugspytkirtelkræft gener (f.eks [6], [7]). Blandt ændret loci, vi og andre tidligere identificerede 7q21-q22 som et sted gentagne forstærket i bugspytkirtelkræft [8] – [13]. Her vil vi indsnævre at locus, og karakterisere SMURF1 som et onkogen produkt fremme celle invasion og forankringsuafhængig vækst.

Resultater

SMURF1

er fokalt forstærkes i bugspytkirtelkræft

Vi havde tidligere identificeret tilbagevendende forstærkning på 7q21-q22 i bugspytkirtelkræft cellelinjer, hjælp CGH på cDNA microarrays [12]. For yderligere at afgrænse amplikon, og lokalisere beboeren onkogen (r), vi nu gennemført yderligere genomisk profilering af en samling af 22 bugspytkirtelkræft cellelinjer og 58 tidlige passage bugspytkirtelkræft implanteret, ved hjælp af høj opløsning 244K Agilent CGH arrays. Den 7q21-q22 locus blev fokalt forstærket (tumor /normal nøgletal 3 gange) i 1 af 22 (4,5%) cellelinier (ASPC-1), og i en af ​​58 (2%) xenografter. Herunder lavere niveau gevinster (nøgletal 1,3 gange)., Gevinst /forstærkning spænder 7q21-q22 blev fundet i 6 ud af 22 (27%) cellelinjer, og i 19 af 58 (33%) xenografter

Fire prøver (aspC-1 cellelinie, og tre xenografter) havde genomiske profiler, der var særligt oplysende i afgrænsningen af ​​amplicon grænser inden 7q21-q22 (fig. 1A). Den mindste fælles region af gevinst spændte bare 325 Kb inden cytoband 7q22.1, og indeholdt kun to RefSeq [14] gener,

SMURF1

(SMAD specifik E3 ubiquitin protein ligase) og

KPNA7

( karyopherin alpha 7). SMURF1 er en kendt inhibitor af TGF signalering (ved at fremme nedbrydning af dets receptor TGFβRI, og signaler mediator Smad4 [15], [16]), en vej ofte forstyrret i kræft i bugspytkirtlen. Givet en oplagt forbindelse til bugspytkirtlen carcinogenese fokuserede vi derfor efterfølgende indsats på

SMURF1

.

(A) En minimal amplikon er defineret ved fire pancreas cancer prøver (ASPC-1 og tre xenotransplantater). Begyndende fra bunden: chr 7 ideogram; Heatmap af DNA-kopi nummer (rød angiver gevinst) for de fire prøver på tværs af 7q21-q22 regionen (91-101 Mb); Scatter plot af DNA-kopi nummer log

2 nøgletal på tværs 7q21.3-q22.1 (96-100 Mb), overlejret med cghFLasso [34] opfordrede nøgletal (rød linje); Skærmbillede af den tilsvarende locus fra UCSC genom browser. De stiplede linier beslag på 325 Kb minimal amplikon, som spænder

SMURF1

. (B)

SMURF1

er overudtrykt når vundet /forstærkes. Box plots viser 25

th, 50

th (median) og 75

percentil transkriptniveauer (analyseret af Agilent 44K vifte) for prøver med (rød) eller uden (grå) 7q21-q22 gevinst, for

SMURF1

og dets nærmeste gen naboer. Bemærk,

KPNA7

var ikke repræsenteret på array’et. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001 (Mann-Whitney U-test). (C) FISH afslører

SMURF1

forstærkning i primære pancreascancer. Vist er to pancreascancer med

SMURF1

forstærkning (

center

, og

højre

), sammen med en ikke-forstærket kontrol (BxPC3 celler,

venstre

).

SMURF1

locus sonde (rød); kontrol chr 7 centromer (CRP7) sonde (grøn).

I overensstemmelse med en onkogent rolle,

SMURF1

udskrift (målt ved microarray) var signifikant forhøjet i cellelinjer /xenografter med 7q22 .1 gevinst /amplifikation (som var flere co-amplificeret tilstødende gener) (fig. 1B). For at evaluere

SMURF1

forstærkning i primære pancreas tumorer, vi også udført FISH på et væv microarray indeholder 105 bugspytkirtlen kræfttilfælde. Fire af 95 (4,2%) evaluerbare sager udstillet

SMURF1

forstærkning (locus /centromer forholdet 2,5) (Fig 1C.), Der kan sammenlignes med vores CGH fund for tidlig passage xenografter. Vi var i stand til at identificere en passende antistof og farvning betingelser for at evaluere SMURF1 udtryk ved immunhistokemi.

SMURF1

forstærkning fremmer celle invasion og forankringsuafhængig vækst

For at vurdere mulige onkogene funktioner SMURF1, vi først brugt RNAi til knockdown SMURF1 udtryk i den relevante kontekst af genamplifikation, hjælp AsPC-1 celler. Transfektion af fire forskellige små interfererende RNA’er (siRNA’er) eller en pulje af de fire sammen, førte hver til reducerede SMURF1 proteinniveauer (ved Western blot), sammenlignet med en ikke-targeting siRNA pool (Fig. 2A). Knockdown af SMURF1 ændrede ikke celleproliferation, målt ved WST-1 assay (fig. 2B, C), og ved BrdU-inkorporering (fig. 2D), men medførte signifikant nedsat celleinvasion gennem Matrigel, målt ved Boyden kammer assay (Fig . 2E). Nedsat invasion blev set med hver af de fire siRNA’er rettet mod forskellige

SMURF1

sekvenser, mens væksten af ​​cellerne forblev uændret i samme periode (fig. 2C), der kraftigt støtter specifikke rolle SMURF1 i invasiv fænotype.

(a) fire forskellige siRNAs målretning

SMURF1

, og en pulje af alle fire, føre til reducerede SMURF1 niveauer (ved Western blot) sammenlignet med en ikke-targeting kontrol siRNA pool ). Resterende SMURF1 niveauer, her normaliseret til GAPDH, er angivet. (B) SMURF1 knockdown (ved hjælp af siRNA pool) reducerer ikke celledeling /levedygtighed, målt ved WST1 assay, og udført i tre eksemplarer (middelværdi +/- 1SD vist). (C) SMURF1 knockdown med fire forskellige siRNAs ændrer ikke signifikant celleproliferation /levedygtighed, målt tre dage efter transfektion. Udført i tre eksemplarer (gennemsnit +/- 1SD vist). (D) SMURF1 knockdown reducerer ikke cellecyklusfremadskriden (S-fase), målt ved BrdU-inkorporering (1,5 time og 4 timer puls mærkning), udført tre gange (gennemsnit +/- 1 SD vist). (E) SMURF1 knockdown (ved hjælp af siRNA pool og individuel siRNA’er) hæmmer celle invasion gennem Matrigel. Boyden kammer assay udført tre gange og høstet tre dage efter transfektion (gennemsnit +/- 1SD vist); *,

P

0,05 (t-test). (F) SMURF1 knockdown ikke forbedre TGFp vej-medieret transkription. AsPC-1-celler blev co-transficeret med siRNAs og p3TP-Lux reporter, udført i tre eksemplarer, og ildflue /Renilla luciferase-forhold vist (middelværdi +/- 1SD vist). Panc1 celler (med vildtype

Smad4

) +/- TGFP tjene som en positiv kontrol.

På grund af dets kendte, antagonistiske funktion i TGF-vejen, vi søgte også at vurdere effekten af SMURF1 knockdown på TGFp signalering, anvendelse af en TGFp responsiv transkriptionel reporter (p3TP-Lux) [17]. Knockdown af SMURF1 forstærkede ikke TGFp forløb-medieret transkription i AsPC-1-celler (fig. 2F). Af note, dog AsPC-1 celler (ligesom de fleste pancreascancer) huser en muteret

Smad4

, her Smad4 (R100T) [18], kendetegnet at inaktivere [19], [20]. Derfor AsPC-1-celler sandsynligvis ude af stand til en TGFp pathway transkriptionel respons. Mere generelt disse resultater tyder på, at den vigtigste effekt (er) af

SMURF1

amplifikation /overekspression er sandsynligvis medieret gennem veje adskiller sig fra TGF-signalering.

For at evaluere langsigtede fænotyper, vi også stabilt transficeret en kort hårnål RNA (shRNA) målretning

SMURF1

. Stabil knockdown af SMURF1 i aspC-1 celler, bekræftet ved Western blot (fig. 3A), reducerede signifikant forankringsuafhængig vækst (blød agar kolonier), sammenlignet med en ikke-målrettet shRNA kontrol (fig. 3B).

(a) en stabilt transducerede shRNA målretning SMURF1 fører til reducerede SMURF1 niveauer (ved Western blot) sammenlignet med en ikke-målrettet kontrol shRNA. Resterende SMURF1 niveauer, her normaliseret til GAPDH, er angivet. (B) Stabilt SMURF1 knockdown reducerer vækst forankring-uafhængig (dvs. blød agar kolonier). Assay udført tre gange (gennemsnit +/- 1SD vist); *,

P

. 0,05 (t-test)

Vi søgte også at vurdere effekten af ​​siRNA knockdown i andre bugspytkirtelkræft cellelinjer. Vi valgte to cellelinier, BxPC-3-celler, som (ligesom AsPC-1-celler og mest pancreatiske tumorer) har muteret

Smad4

(her ved homozygot deletion) [21], og HS700T celler, som er vildtype for

Smad4

og har et intakt TGFp vækstinhiberende pathway (fig. S1). Især ingen af ​​disse linier rummer fokal amplifikation af

SMURF1

(AsPC-1-celler er de eneste etablerede linie med fokal amplifikation) eller forhøjede SMURF1 proteinniveauer (fig. 4A). Knockdown af SMURF1 (valideret af Western blotting,. Figur 4B) førte til moderat reduceret celleproliferation i BxPC-3-celler (Fig 4C.), Og endnu mere i TGFp-vækstinhiberende pathway-intakt HS700T celler (Fig 4D.). SMURF1 knockdown resulterede også i reduceret celleinvasion i BxPC-3-celler (fig. 4E), men ikke signifikant så. Men da

SMURF1

hverken fokalt forstærkes eller overudtrykt i disse linjer, en enkel forklaring på de disharmoniske fænotyper (sammenlignet med AsPC-1) er, at SMURF1 ikke kan fungere som et onkogen driver på disse celle sammenhænge.

(a) Western blot-analyse af endogene SMURF1 proteinniveauer i et panel af pancreascancer cellelinier. Bemærk at SMURF1 er højt udtrykt kun i 7q22.1-amplificerede AsPC-1-cellelinien. To forskellige engagementer i SMURF1 blot vises; GAPDH tjener som en loading kontrol. (B) Western blot verifikation af SMURF1 knockdown (ved SMURF1-targeting siRNA pool, sammenlignet med ikke-targeting kontrol siRNA pool) i BxPC-3 og HS700T celler. (C) Celleproliferation /levedygtighed analyseret (ved WST-1) i BxPC-3-celler efter SMURF1 siRNA-medieret knockdown (sammenlignet med ikke-targeting kontrol). Assay udført tre gange (gennemsnit +/- 1SD vist); *,

P

0,05 (t-test). (D) Celleproliferation /levedygtighed analyseret i HS700T celler, som ovenfor. (E) Cell invasion analyseret (ved Boyden kammer) i BxPC-3 celler efter SMURF1 knockdown (sammenlignet med kontrol ikke-targeting). Assay udført tre gange (gennemsnit +/- 1SD vist). Bemærk, den reducerede proliferation observeret med SMURF1 knockdown i HS700T celler udelukket en analyse af celle invasion (hvor invaderede celletal på 72 timer er påvirket ved at fordoble gange).

Endelig komplementære overekspression undersøgelser, transficerede vi

SMURF1

cDNA (udtrykkes fra en CMV-promotor) i NIH-3T3 musefibroblaster. Overekspression af SMURF1, bekræftet ved Western blot (fig. 5A), førte til et betydeligt tab af kontakt hæmning (dvs. øget foci), sammenlignet med en vektor kontrol (fig. 5B). Især havde transfektion af en katalytisk inaktiv mutant af SMURF1 (C699A) [22] ikke reducere kontaktinhibering (fig. 4B), hvilket indikerer, at dette oncogen aktivitet er afhængig af E3 ubiquitin protein ligase aktivitet af SMURF1.

(a) Transfektion af SMURF1 cDNA eller en katalytisk mutant af SMURF1 (C699A) (SMURF1

m), fører til overekspression (ved Western blot) sammenlignet med tom vektor kontrol. SMURF1 overekspression niveauer, normaliseret til GAPDH, er angivet. (B) SMURF1 (men ikke SMURF1

m) overekspression i NIH-3T3-celler fører til tab af kontaktinhibering (dvs. øget foci-dannelse). Assays udført tre gange (gennemsnit +/- 1SD vist); *,

P

. 0,05 (t-test)

Diskussion

Her er vi i gang med at lokalisere og opdage onkogen kørsel 7q21-q22 amplifikation i bugspytkirtelkræft. Høj opløsning genomisk profilering af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer og tidlig passage xenografter defineret en 325 Kb minimal amplikon spænder

SMURF1

. Udskrift niveauer af

SMURF1

blev forhøjet i prøver med gevinst /forstærkning, og ved FISH vi bekræftede

SMURF1

forstærkning i primære pancreascancer. Brug komplementære metoder af knockdown (i fokalt-forstærket AsPC-1 celler) og overekspression (i NIH-3T3-celler), vi bestemt, at

SMURF1

forstærkning /overekspression ændrer ikke celledeling, men fremmer celle invasion, forankring -uafhængige vækst, og tab af kontaktinhibering, hvoraf mindst den sidste afhænger af dens katalytiske aktivitet.

SMURF1 var oprindeligt en spændende onkogen kandidat på grund af dens kendte forbindelse til TGFp signalering. Den TGFp vej, i det mindste tidligt i tumor udvikling, er væksten undertrykkende [23]. Normalt TGFp binder til dens receptorer (TGFβRI, TGFβRII), der fører til phosphorylering af signaltransducere SMAD2 /SMAD3, som derefter shuttle til kernen og i kompleks med Smad4 mediere transkription. Vigtige transkriptionelle reaktioner inkluderer induktion af

CDKN2B

(p15Ink4b) og

CDKN1A

(p21Cip1), og undertrykkelse af

MYC

sammen fører til G

1 celle-cyklus arrestere. Den TGFp Væksten undertrykkende vej er almindeligt forstyrret i bugspytkirtelkræft, oftest gennem mutation /sletning af

Smad4

, men også gennem inaktivering /tab af

TGFβRI

og

TGFβRII

[ ,,,0],4].

SMURF1 er en HECT-domæne E3 ubiquitin ligase (E3 ubiquitin ligaser udfører den tredje og substrat-specifikke trin i protein ubiquitinering). SMURF1 fremmer nukleare eksport af TGF pathway inhibitor SMAD7 (øge sin tilgængelighed), og ødelæggelse af TGFβRI og Smad4 (gennem ubiquitinering-medieret nedbrydning) [15], [16]. Alle disse aktiviteter bør tjene til at modvirke TGFp signalering, og sammen giver en stærk begrundelse for

SMURF1

amplifikation /overekspression i kræft i bugspytkirtlen. Det var bemærkelsesværdigt da, at SMURF1 knockdown i AsPC-1 celler ikke forbedre TGFp-pathway transskription (men måske ikke overraskende i betragtning af den inaktiverende mutation af

Smad4

). Derfor skal de onkogene aktiviteter SMURF1 handle i det mindste delvist uafhængigt af sine funktioner i TGFp signalering (i det mindste på vej niveau Smad4). Til dette formål har SMURF1 også vist sig at opløse tætte overgange (ved nedbrydning af RhoA) under epitel-mesenkymale overgang [24], og fokale adhæsioner (ved nedbrydning af talin hoveder) at potensere cellemigration [25]. Yderligere undersøgelser skal klarlægge de vigtigste SMURF1 substrater knyttet til invasiv og forankringsuafhængig vækst i pancreascancer med 7q22 forstærkning.

Under forløbet af dette arbejde, to andre undersøgelser præget 7q21-q22 amplicon i kræft i bugspytkirtlen. Suzuki

et al.

[26] af genomisk profilering af cellelinier identificeret amplikonet i AsPC-1-celler, med amplikonet peak dækker 11 gener. Yderligere indsats fokuseret på to gener,

TRRAP

og

SMURF1

, med signifikant forhøjede udtryk, når forstærkes. i modsætning til vores undersøgelse, at de rapporterede dog, at knockdown af SMURF1 hæmmede AsPC-1 celleproliferation. Især dog de evaluerede kun én siRNA. I betragtning af vores resultater, at fire uafhængige siRNA’er slået ned SMURF1 niveauer sammenligneligt og faldt invasion uden at påvirke celleproliferation, foreslår vi, at deres konklusion kan afspejle en ikke-specifik eller specifik off-target RNAi effekt. Faktisk væksthæmning er en almindelig ikke-specifik virkning, udløst af et type I-interferon respons på siRNA [27]. Suzuki

et al.

Gik på at vise, at SMURF1 overekspression i to bugspytkirtelkræft cellelinjer forbedret koloni vækst på vævskultur plast. Ikke desto mindre vores resultater baseret på knockdown i fysiologisk relevant kontekst af fokal

SMURF1

forstærkning tyder på, at den vigtigste onkogene funktion af SMURF1 vedrører fremme celle invasiv snarere end spredning.

I en anden undersøgelse for nylig , Laurila

et al.

[28] af FISH-analyse af cellelinjer afgrænset den 7q21-q22 amplikon til 0,77 Mb spænder 10 gener (herunder

SMURF1

), men fokuserede deres indsats om

ARPC1A

ARPC1B

, underenheder af ARP2 /3-kompleks funktion i actin polymerisering. Brug af RNAi, fandt de, at knockdown af enten reduceret cellemotilitet, og knockdown af

ARPC1A

også reduceret celleinvasion. Selvom vores minimal amplikon udelukket

ARPC1A

og

ARPC1B

, det ikke desto mindre muligt, at deres forstærkning bidrager til motilitet /invasion i tumorer, hvor de forstærkes. Det er ikke ualmindeligt at finde flere driver onkogener inden tumor amplikoner (fx ref. [29]). Faktisk behøver vores egne undersøgelser ikke løse, om

KPNA7

, inden for vores 325 Kb minimal amplikon, kan også have en onkogen rolle (sammen med

SMURF1

).

For at opsummere ved genomisk profilering og funktionel analyse identificerede vi

SMURF1

som en forstærket onkogen kørsel celle invasiv i kræft i bugspytkirtlen. Måske de fleste betydning, som et enzym SMURF1 repræsenterer en medgørligt stof mål. Andre E3 ubiquitin ligaser er blevet forbundet med kræft, og på grund af deres substratspecificitet E3 ubiquitin ligaser menes at være attraktive mål for terapi [30]. Faktisk flere små molekyler hæmmere (herunder mod MDM2, en regulator af TP53) er i øjeblikket ved at blive evalueret [31]. Vores resultater identificerer SMURF1 som en mulig ny mål for molekylært-rettet terapi mod ødelæggende sygdom af kræft i bugspytkirtlen.

Materialer og metoder

Prøver

bugspytkirtelkræft cellelinjer, beskrevet tidligere [12], og NIH-3T3-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Kræft i bugspytkirtlen xenotransplantater, som effektivt beriger tumor epitelial fraktionen til DNA-analyse, blev genereret som beskrevet [32] på Johns Hopkins Hospital, med godkendelse fra Institutional Review Board (IRB) (protokol ID 05-04-14-02) og Animal Care og brug Udvalg (protokol ID MO05M466). Kort fortalt, en 1 mm

3 stykke af den primære tumor var gennemvædet i Matrigel (Collaborative Biomedical Research), derefter implanteret subkutant i en nu /nu mus. Indpodede tumorer høstedes når de nåede 1-2 cm i diameter, og tumorcelle berigelse bekræftet ved H 1,3 og 3,0 hhv. CGH data detaljeret heri, er tilgængelige på GEO (GSE19852); en fuldstændig beskrivelse af datasættet er under udarbejdelse.

Expression profilering

Expression profilering blev gjort ved hjælp Agilent katalog 44K Whole Human Genome arrays. RNA’er blev mærket under anvendelse af Quick Amp Labeling-kit (Agilent), derefter hybridiseret (

vs.

En universel RNA henvisning pulje af 11 cancercellelinier [35]) efter producentens anvisninger. Efter scanning og dataudtræk (som ovenfor), blev udtryk data normaliseret (middel-centreret) ved array og ved gen, og betyde-centreret log

2 nøgletal rapporteret.

FISH

væv microarray indeholder 105 pancreas ductus adenocarcinom sager (arkiveret på Stanford University, og bruges med IRB godkendelse) er tidligere beskrevet [6]. Probe mærkning og FISH blev udført under anvendelse Vysis (Downers Grove, Illinois) reagenser ifølge producentens protokoller. En locus-specifikke BAC mapping til

SMURF1 dele på 7q22.1 (RP11-62N3; BacPac Resources Center, Oakland, CA) blev mærket med SpectrumOrange, og co-hybridiseret med SpectrumGreen-mærket chr 7 centromer sonde (CEP7 ; Vysis). Objektglas blev modfarvet med DAPI, og filmede med et Olympus BX51 fluorescensmikroskop med Applied Imaging (San Jose, CA) Cytovision 3,0 software. Femogtyve tumorceller blev scoret pr tilfælde, og forstærkning defineret som et gennemsnit

SMURF1

/CEP7 forholdet . 2.5

siRNA transfektioner

On-TARGETplus målretning siRNA’er

SMURF1

, sammen med en negativ kontrol siRNA pool (ON-TARGETplus siCONTROL pool Ikke-målretning), blev opnået fra Dharmacon (Lafayette, CO). Sekvenser af siRNA’er er anført i tabel S1. AsPC-1-celler blev dyrket ved 37 ° C i komplet medium af RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% FBS, 50 U /ml penicillin og 50 U /ml streptomycin. For transfektion blev 150.000 celler udsået pr 6-brønds plade brønd og transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Celler blev transficeret med en slutkoncentration på 50 nM siRNA i 6 timer.

Western blot-

Celler blev lyseret i 1 × RIPA-buffer suppleret som beskrevet [6]. Fyrre ug totalt protein lysat blev elektroforesebehandlet på en 4-15% polyacrylamidgel, derefter overført til PVDF-membran og blokeret i TBST-T med 5% tørmælk. Antistoffer blev anvendt som følger: anti-SMURF1 kanin-polyklonalt antistof (H-60; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved 1:500 fortynding; anti-GAPDH kanin-polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology) ved 1:5,000 fortynding; HRP-konjugeret anti-kanin IgG (Pierce, Rockford, IL) ved 1:20,000 fortynding. Detektion blev udført ved anvendelse af et ECL-kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ), og intensiteter kvantificeres ved densitometri under anvendelse Scion billede software (Scion Corporation, Fredrick, MD). Salg

cellevækst og invasion-assays

Celleproliferation /levedygtighed blev kvantificeret ved kolorimetri baseret på den metaboliske spaltning af tetrazolium-salt WST-1 i levedygtige celler, ifølge producentens protokol (Roche, Indianapolis, IN). BrdU-inkorporering blev bestemt ved kolorimetrisk ELISA under anvendelse af BrdU-celleproliferationsassay ifølge fabrikantens protokol (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Invasion blev kvantificeret ved Boyden kammer assay (BD Biosciences, San Jose, CA). Kort fortalt, 24 timer efter transfektion blev 50.000 celler udpladet i 24 brønde Matrigelcoatede skær med en 0,5% til 10% FBS-gradient. Tooghalvfjerds timer senere blev celler fikseret, farvet med krystalviolet, og celler, der gennemkører membranen talt. Alle assays blev udført som tredobbelte transfektioner, og alle forsøg blev gentaget mindst en gang med lignende resultater.

TGFp transkriptionel reporter assay

Celler blev co-transficeret med 4 ug p3TP-Lux (Addgene, Cambridge, MA), en TGFp responsiv ildflueluciferase reporter indeholdende tre på hinanden følgende TPA responselementer (TRES) og en del af plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1) promotorregion [17], sammen med 0,4 ug pRL-TK (Promega, Madison, WI), der udtrykker Renilla luciferase som intern normalisering kontrol. Luciferaseaktivitet blev analyseret 48 timer efter transfektion (ved Lipofectamine 2000) under anvendelse af dobbelte luciferase reporter assaysystem (Promega, Madison, WI). Reporter aktivitet udtrykkes som forholdet mellem ildflue /Renilla. Analyser blev udført som tredobbelte transfektioner, og gentages mindst en gang med lignende resultater.

Anchorage-uafhængig vækst

En pGIPZ shRNAmir konstruktion rettet mod

SMURF1

(V2LHS_229724), sammen med en ikke-targeting pGIPZ shRNAmir kontrol blev opnået fra Open Biosystems (Huntsville, AL). At skabe stabilt-transducerede AsPC-1 celle puljer blev lentivirale konstruktioner (sammen med Trans-lentivirale emballage mix plasmider) transficeret ind 293TN producent- celler (System Biosciences, Mountain View, CA), og supernatanten pakket virus transduceres i aspC-1 celler efter producentens anvisninger (Open Biosystems ‘Trans-lentiviral GIPZ emballage protocol). To dage efter infektion blev 1 ug /ml puromycin (Invitrogen) tilsat til dyrkningsmediet, og cellerne udvælges i 14 dage. Forankringsuafhængig vækst blev analyseret ved kolonidannelse i blød agar. Kort fortalt blev 10.000 celler indlejret i en 6-brønds plade godt inden et øverste lag af 0,36% agarose i komplette medier, over et lag af 0,48% agarose i komplette medier. Celler blev dyrket i 14-21 dage, derefter synlige kolonier talt efter farvning med 0,015% Neutral Red-opløsning. Assays blev udført som tredobbelte transduktioner, og gentaget mindst én gang med lignende resultater.

NIH-3T3-dannelse fokus assay

Fuld-længde human

SMURF1

cDNA ekspressionsvektor pcDNA3 0,1-SMURF1 var en slags gave fra Di Chen (University of Rochester Medical center, Rochester, NY), og moderselskabet pcDNA3.1 blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). En katalytisk mutant SMURF1 (C699A) [22] blev manipuleret under anvendelse af QuickChange XL II steddirigeret mutagenese Kit fra Stratagene (La Jolla, CA), med følgende mutagene primere: 5′-CGTGGAGGAGACCGCCGGGTTTGCTGTGG -3 ‘(degenereret, muterede baser betegnet af fed tekst) og 5’-CCACAGCAAACCCGGCGGTCTCCTCCACG-3 ‘. Halvtreds tusinde celler blev podet pr 60 mm plade, og 8 ug plasmid blev transficeret ved lipofectamin 2000-reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol. To dage efter transfektion, celler fra hver 60 mm plade blev genudpladet i to 10 cm plader og dyrket til konfluens over 28 dage. Synlige foci blev talt efter methanol fiksering og Giemsa-farvning. Analyser blev udført som tredobbelte transfektioner, og gentages mindst en gang med lignende resultater.

Støtte oplysninger

tabel S1.

siRNA-sekvenser målrettet SMURF1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023924.s001

(PDF)

Figur S1.

HS700T celler udviser TGFp-induceret væksthæmning. HS700T celler blev udpladet, og derefter 2 ng /ml TGFp (eller vehikelkontrol) tilsat, og celleproliferation /levedygtighed analyseret (ved WST-1) dagligt. Assays blev udført tre gange (gennemsnit +/- 1SD vist); *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

0,001 (t-test). I overensstemmelse med intakt TGFp væksthæmning, ingen sletninger spænder

Smad4

(244K Agilent CGH-array data ikke vist) og ingen punktmutationer af

Smad4

(Illumina RNAseq analyse ikke vist) blev identificeret.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023924.s002

(EPS)

tak

Vi takker Ilana Galperin (Stanford cytogenetik Laboratory) for at få hjælp med FISH-analyse, og medlemmer af Pollack laboratorium til nyttige diskussioner.