PLoS ONE: cytotoksiske effekt af en roman syntetiseret Carbazol Compound på A549 Lung Cancer Cell Line

Abstrakt

Øget dødelighed grundet lungekræft har nødvendiggjort søgningen efter potentielle roman anticancer forbindelser såsom carbazol derivater. Carbazoler er aromatiske heterocykliske forbindelser med anticancer, antibakterielle og anti-inflammatorisk aktivitet. Studiet undersøgte evnen af ​​det hidtil ukendte carbazol forbindelse (Z) -4- [9-ethyl-9aH-carbazol-3-yl) amino] pent-3-en-2-on (ECAP) for at inducere cytotoksicitet lungecancerceller og dets virkningsmekanisme. ECAP blev syntetiseret som et gult pulver med smeltepunkt på 240-247 ° C. 3- (4,5-dimethythiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT), lipidperoxidation og comet assays blev anvendt til at vurdere den cytotoksiske virkning af forbindelsen på A549 lungecancerceller. Proteinekspression blev bestemt ved anvendelse western blots, apoptose blev målt ved luminometri (caspase-3/7 -8 og -9) assay og flowcytometri blev anvendt til måling phosphatidylserin (PS) eksternalisering. ECAP inducerede en p53-medieret apoptose af lungecancerceller grund af en betydelig reduktion i ekspressionen af ​​antioxodantforsvarssystem proteiner (Nrf2 og SOD), Hsp70 (p 0,02) og Bcl-2 (p 0,0006), hvorved opregulering reaktive ilt arter (ROS) produktion. Dette resulterede i DNA-beskadigelse (p 0,0001), opregulering af Bax ekspression og caspaseaktivitet og induktion af apoptose i lungecancerceller. Resultaterne viser anticancer potentiale ECAP om lungekræft

Henvisning:. Molatlhegi RP, Phulukdaree A, Anand K, Gengan RM, Tiloke C, Chuturgoon AA (2015) cytotoksiske effekt af en roman syntetiseret Carbazol Compound på A549 Lung Cancer Cell line. PLoS ONE 10 (7): e0129874. doi: 10,1371 /journal.pone.0129874

Redaktør: En R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, UNITED STATES

Modtaget: November 7, 2014 Accepteret: 14 maj 2015; Udgivet: 2 juli 2015

Copyright: © 2015 Molatlhegi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Relevante data er tilgængelig på Figshare.com: 1) MTT assay Raw data: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425070. 2) A549-celler TBARS-assay: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425071. 3) A549 celler Comet Assay Rå data: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425073. 4) Western blots rådata: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425077. 5) luminometri caspase og ATP data efter 6 og 24 timer: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425078. 6) Annexin pletten for A549-celler Flowcytometri data: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425080. 7) carbazol 6 (CML1) Syntese og Characterization_1: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425089. 8) carbazol 6 (CML1) Syntese og Characterization_2:. https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425090

Finansiering: RM anerkender College of Health Sciences, University of KwaZulu-Natal for . finansiering dette projekt

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Baggrund

Kræft er blevet en anden førende livstruende sygdom tegner sig for høj dødelighed. satser efter hjertekarsygdomme verdensplan [1, 2]. Ifølge Globocan, i 2012 var der omkring 14,1 mio nye kræfttilfælde og 8,2 millioner kræftrelaterede dødsfald globalt, i forhold til den rapporterede 12,7 mio og 7,6 mio i 2008. Størstedelen af ​​de globale kræfttilfælde er rapporteret i udviklingslandene, med en dødelighed 63% sats [3]. En stigning i lungekræfttilfælde i udviklingslande, herunder Sydafrika (SA) er forbundet med smitsomme sygdomme såsom erhvervet immundefekt syndromer (AIDS) og tuberkulose (TB) [2]. I løbet af 2006 blev der rapporteret alene omkring 4525 lungekræft dødsfald i SA. En stigning i lungekræfttilfælde i SA er også tilskrives andre faktorer, såsom rygning, miljøforurening, erhvervsmæssig eksponering og ændret livsstil [2, 4].

Reaktive ilt arter (ROS) er en af ​​de hyppigste årsager af malignitet. De er produkter af ilt metabolisme i cellerne og deres funktioner spænder fra cellesignalering, homeostase og antimikrobielle virkninger [5]. Pattedyrceller løbende udsat for ROS genereret både extrinsically og uløseligt [6]. Kronisk og vedvarende udsættelse for høje ROS-niveauer inducerer DNA, protein og lipid skader, og kan resultere i induktion af sygdomme såsom cancer [7, 8]. For at opretholde vævshomeostase i multicellulære organismer, er celleproliferation og død stramt reguleret af cellecyklus og apoptose processer. mutation af tumorsuppressorgen (er) (fx p53) og forhøjede niveauer af ROS kan dog tillade ureguleret vækst fører til udvikling af cancer. Mammale celler indeholder forsvarssystemer at regulere oxidativ skade, og disse omfatter proteiner, såsom superoxiddismutase (SOD), nuklear faktor erythroide 2-relateret faktor 2 (Nrf2) og varmechokprotein 70 (Hsp70) [9-12].

De overlevelsesrater for lungekræft patienter, der gennemgår kirurgi er dårlig, derfor er der behov for mere potente anti-lunge cancer medicin. Udfordringen stadig er evnen til at udvikle meget effektive lægemidler specifikke for lungekræft med ringe eller ingen bivirkninger på normale celler [13]. Heterocycles er blevet en vigtig klasse af organiske forbindelser til forskning på grund af deres talrige medicinske og landbrugsmæssige anvendelser [14].

carbazoler er aromatiske heterocykliske organiske forbindelser, med en tricyklisk struktur bestående af to benzenringe hver kondenseret på en fem leddet nitrogenholdig ring [14, 15]. Disse syntetiske eller naturlige produkter fungerer gennem interaktion med DNA; de skader DNA resulterer i inhibering af syntesen af ​​nye DNA eller RNA [16]. Carbazoler og deres derivater hæmme kræft vækst ved interkalerende i DNA, hæmme DNA-topoisomerase II-aktivitet, samt ved dannelse af kovalente DNA addukter medieret gennem oxidation af cytokrom P

450 og peroxider [15]. Forskellige naturlige og syntetiske carbazol derivater, herunder ellipticin, olivacine, elliptiniumacetat, mahanimbine, mukonine, koenoline og rebaccamycin er blevet rapporteret at have antineoplastisk aktivitet [15].

Baseret på deres rapporterede antitumor, antibakterielle og anti-inflammatoriske aktiviteter , forskellige syntetiske carbazol analoger er blevet syntetiseret fra naturligt forekommende carbazoler [14, 15, 17]. Carbazoler og deres derivater er i stigende grad målrettet til potentiel anvendelse i cancerbehandling grund det til deres store π-konjugeret system, som gør det let at indføre forskellige funktionelle grupper i den stive carbazol ring [15].

Undersøgelsen undersøgte anticancer egenskaber ECAP om lungekræft celler og bestemmes antineoplastisk vej det modulerer sammen med de associerede proteiner. Det blev en hypotese, at ECAP induceret apoptose af A549 lungekræft celler gennem induktion af oxidativt stress.

Materialer og metoder

Carbazol derivat (ECAP) blev syntetiseret ved Kemisk Institut (Durban University of Technology , SA). Perifere, mononukleare blodceller (PBMC’er) blev isoleret fra helblod fra en sund mand frivillig efter opnåelse Institutional etisk godkendelse (BF 170/11). A549-celler blev opnået fra Highveld Biologicals (Johannesburg, SA), cellekulturreagenser fra Whitehead Scientific (Johannesburg, SA), Ellipticine (Sigma, St. Louis, MO, USA) og Western blot reagenser fra Bio-Rad (USA). Andre reagenser blev opnået fra Merck (SA)

Syntese af (Z) -4 -. ((9-ethyl-9H-carbazol-3-yl) amino) pent-3-en-2-on

En blanding af acetylacetone (1,02 ml, 0,01 mol), 3-amino-9-ethylcarbazol (2,1 g, 0,01 mol) og indiumchlorid (0,22 g, 0,001 mol) i ethanol (25 ml) blev opvarmet under tilbagesvaling i 5 timer. Efter afslutning af reaktionen blev overskud af opløsningsmiddel afdampet. Resten blev opløst i is /vand og ekstraheret med ethylacetat. Kombinerede organiske lag blev tørret over vandfrit natriumsulfat. Den blev derefter oprenset på en silicagelsøjle (elueringsmiddel petroleumsether: ethylacetat (90:10)). Det rene produkt blev omkrystalliseret fra methanol

Titelforbindelsen (Z) -4 -. ((9-ethyl-9H-carbazol-3-yl) amino) pent-3-en-2-on (ECAP ) blev fremstillet i godt udbytte ved to-komponent reaktion under indiumchlorid som promotor struktur af den fremstillede forbindelse (figur 1). Strukturen af ​​den fremstillede forbindelse blev derefter undersøgt og karakteriseret ved hjælp af infrarød (IR), Hydrogen-1 (

1 H) og Carbon-13 (

13C NMR) spektroskopiske teknikker.

Extraction perifert blod mononukleære celler

perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) blev isoleret fra hepariniseret fuldblod ved densitetsgradientcentrifugering. Lige volumener af blod og Histopaque 1077 (Sigma, Tyskland) blev opdelt i alikvoter i 15 ml koniske rør og centrifugeres (400 g, 30 min). Buffy coat lag indeholdende PBMCer blev aspireret og vasket to gange med 0,1 M phosphat saltvandsbuffer (PBS; 400 g, 10 min).

Tissue cellekultur Salg

A549-celler blev dyrket ifølge en tidligere beskrevne fremgangsmåde [18]. Sammenfattende blev A549-celler dyrket ved 37 ° C, 5% CO

2 i Eagles minimale essentielle medium (EMEM) suppleret med 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin-fungizon og 10% føtalt kalveserum. Cellevækst blev overvåget, og celledyrkningsmedium (CCM) blev ændres efter behov. Sammenflydende kolber blev trypsiniseret og trypanblåt blev anvendt til celle nummerering. PBMC’er opnået fra en mandlig donor blev dyrket ved 37 ° C, 5% CO

2 i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suppleret med 1% L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin-fungizon og 10% føtalt kalveserum .

Cell levedygtighed assay

Cell levedygtighed blev udført som beskrevet tidligere [18], med mindre modifikation. Den methylthiazol tetrazolium (MTT) assay blev anvendt til at bestemme cytotoksiciteten af ​​ECAP på PBMC’er og A549 lungecancerceller. PBMC’er og A549-celler (20, 000 celler /brønd) blev inkuberet med forskellige koncentrationer (0, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,6, 0,7 og 0,8 ug /ml) af ECAP og inkuberet i en 96-brønds mikrotiterplade i tre eksemplarer ved 37 ° C, 5% CO

2 i 24 timer. Celler inkuberet med 1% DMSO blev anvendt som vehikelkontrol (V kontrol) og ellipticin ved koncentrationer (0, 0,01, 0,025, 0,050, 0,10, 0,25, 0,6 og 0,8 ug /ml) blev anvendt som en positiv kontrol. Efter 24 timers inkubation blev CCM /MTT saltopløsning (5 mg /ml) tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Supernatanten blev derefter fjernet, og 100 pl /brønd dimethylsulfoxid (DMSO) blev tilsat efterfulgt af inkubering (1 time). Absorbansen af ​​den producerede formazan blev målt ved 570 nm og reference bølgelængde på 690 nm ved anvendelse af en Bio Tek μQuant spektrofotometer. GraphPad Prism V5.0 software blev anvendt til at plotte en koncentration-respons-kurve, som efterfølgende blev anvendt til at bestemme en IC

50 værdi ECAP på PBMC’er og A549-celler.

Lipidperoxidation assay til kvantificering af malondialdehyd ( MDA)

thiobarbitursyre assay (TBARS) blev anvendt til at måle evnen hos ECAP at generere ROS. Supernatanten af ​​kontrollen, V kontrol og ECAP behandlede celler blev overført til reagensglas med 2% H

3PO

4 (200 pi), TBA /BHT-opløsning (400 pi) og 7% H

3PO

4. blev anvendt En positiv kontrol på 1% MDA og en negativ kontrol med 3 mM HCI (400 pi). Prøve pH blev kontrolleret (pH 1,5) og opvarmet ved 100 ° C i 15 min. Prøver blev tilladt at afkøle til stuetemperatur (RT), efterfulgt af tilsætning af 1,5 ml butanol, hvirvelbehandlet og fik derefter lov til at separere i særskilte faser. Den øvre butanol fase blev opdelt i alikvoter i 96-brønds mikrotiterpladen i triplikater. Den optiske densitet blev målt ved 532 nm med reference bølgelængde på 600 nm. Den gennemsnitlige optiske densitet blev beregnet for hver prøve og divideres med absorptionskoefficienten af ​​156 mM

-1 for at opnå MDA-koncentration (uM) per behandling.

DNA skader

Kometen assay blev anvendt som tidligere beskrevet [18], med let modifikation at bestemme DNA-beskadigelse. De tre behandlinger (kontrol, V kontrol- og ECAP) blev fremstillet henholdsvis efterfulgt af fjernelse af supernatanten, og derefter trypsinbehandlet. To slides per prøve blev fremstillet som følger; det første lag af 700 pi, 2% agarose med lavt smeltepunkt (LMPA, 37 ° C), andet lag af celler (25 pi), 1% LMPA (175 pi, 37 ° C) og gel rød (1,5 pi), og det tredje lag på 1% LMPA (250 pi, 37 ° C), og derefter dækket med mikroskop dækslides. Efter størkning blev objektglassene nedsænket i koldt lyserende opløsning [2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 M Tris, 10% DMSO] og inkuberet ved 4 ° C i 1 time. Efter lysis blev objektglassene anbragt i elektroforese buffer [300 mM NaOH, 1 mM Na

2EDTA (pH 13)] i 20 minutter, og derefter elektroforese blev kørt ved 25 V i 35 min. Efter elektroforese blev objektglassene vasket tre gange i 5 minutter med neutraliserende puffer [0,4 M Tris (pH 7,4)]. Objektglas blev derefter betragtet med et fluorescerende mikroskop (Olympus IXSI inverteret mikroskop med 590 nm emission filtre og 510-560 nm excitation). For hvert dias blev 50 celler til fange og deres komet hale længder blev målt i um hjælp Soft billeddannende system (Life Science-Olympus Soft Imaging Solution v5).

Western blot-analyse

proteinekspression af p53, blev Bax, Bcl-2, Nrf2, SOD og Hsp70 i A549-celler bestemt under anvendelse af western blot. Proteiner blev isoleret fra A549-celler under anvendelse Cytobuster reagens suppleret med phosphat-inhibitor (Roche, kat. Nr. 04906837001) og protease-inhibitor (Roche, kat. Nr. 05892791001). Bicinchoninsyre-assay (Sigma, Tyskland) blev anvendt til protein kvantificering. Proteiner blev standardiseret til en koncentration på 3,966 mg /ml. Prøver blev derefter fremstillet i en Laemmli-buffer, kogt i 5 minutter ved 100 ° C og elektroforeret ved 150 V i 1 time i 7,5% natriumdodecylsulfat polyacrylamid (SDS-PAGE) under anvendelse af Bio-Rad kompakt strømforsyning. Trans-Blot Turbo Transfer system blev anvendt til at overføre de separerede proteiner på nitrocellulosemembraner ved 20 V i 45 minutter. 3% BSA i Tris-bufret saltvand [(TTBS) -NaCl, KCI, Tris, dH

2O, Tween 20, pH 7,4)] indeholdende 0,5% Tween20 blev anvendt til at blokere membranerne i 1 time, efterfulgt af en overnatning inkubation med primære antistoffer [p53 (2521P), Nrf2 (8882), SOD (4266), Hsp70 (BD 610.607) og Bcl-2 (3869); 1: 5000], 5 x vask med TTBS, 1 h inkubation med sekundære antistoffer (anti-mus: ab97046; 1: 10.000) ved stuetemperatur og 5 x vask med TTBS (10 min hver). β-actin (ab8226; 1: 5000) blev anvendt til protein normalisering. A 50:50 (v /v) til klarheden Western luminale /enhancer-opløsning og peroxidopløsning tilsattes på hver elektro-blottet nitrocellulosemembran til dannelse af antigen-antistof-komplekset. Det genererede signal blev detekteret ved anvendelse Alliancen 2.7 billeddokumentation systemet (UViTech). Proteinekspression blev derefter analyseret under anvendelse UViBand Advanced Image Analysis software v12.14 (UViTech). Dataene blev udtrykt som gange ændring (FC).

Caspase-3/7, 8, 9 og ATP aktiviteter

Tidsafhængige luminescens-baserede assays (6 timer og 24 timer) blev anvendt at vurdere aktiviteterne i caspase-Glo 3/7, 8, 9 og ATP. Efter behandling med ECAP (6 timer og 24 timer), blev A549-celler trypsiniseret, justeret til 20.000 celler /brønd efterfulgt af centrifugering ved 3000 g x (5 min, RT). Supernatanten blev fjernet; Cellerne blev derefter resuspenderet i 50 pi PBS /brønd for hver behandling og derefter podet i en uigennemsigtig polystyren 96 brønd mikrotiterplade i seks replikater. Producentens vejledning blev anvendt til fremstilling Caspase-Glo 3/7, 8, 9 og ATP reagenser (Promega). Ca. 100 pi reagens blev tilsat til specifikke brønde, og derefter inkuberet i mørke (30 min, RT). Den Modulus mikroplade luminometer anvendtes til efterfølgende måling af luminescens, og de opnåede data blev udtrykt som RLU.

Annexin-V-Fluos assay

Annexin pletten assay blev udført som tidligere beskrevet [19 ], med let modifikation. Phosphatidylserin (PS) translokation blev bestemt under anvendelse annexin-V-Fluos apoptose afsløring kit (Roche). Til hver 100 pi A549 cellesuspension, 100 pi Annexin farvning puffer og 100 pi Annexin-V-Fluos mærkningsløsning (annexin-V: propidiumiodid: annexin farvning puffer (1: 1: 50 volumen /volumen /volumen)) blev tilsat i 1,5 ml rør. BD Accuri flowcytometer blev anvendt til at indsamle data fra de farvede celler. Celler blev analyseret under anvendelse af Accuri C6 gating og CFlow Plus v1.0 analyse software. For hver prøve 50.000 hændelser blev analyseret i tre eksemplarer. Resultaterne præsenteres som procent af apoptose, hvor celler er positive for Annexin-V (FITC) i nederste højre kvadrant (tidlig apoptose) og øvre højre kvadrant (sent apoptose) blev gated.

Statistisk analyse

GraphPad Prism v5.0 software (GraphPad software Inc., La Jolla, USA) blev anvendt til statistisk analyse. For alle eksperimenter blev de opnåede resultater af triplikater repræsenteret betyder med standardafvigelse (SD). Den statistiske signifikans af resultaterne blev analyseret med uparret

t

-test og en 95% konfidensinterval. Værdierne for

s . 0

05

blev derefter betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Syntese af (Z) -4 -. ((9-ethyl-9H-carbazol-3 yl) amino) pent-3-en-2-on

Det resulterende produkt var et gult fast stof fremstillet i 94% udbytte; smeltepunkt (MP): 240-247 ° C. Funktionelle grupper blev forudsagt ved anvendelse af IR (KBr, cm

1): 1774,97 (C = O), 3043,92 (N-H), 2988,76 (C-H) Alkaner, 1562,66 (C = C) Aromatiske ringe (Fig 2A). Den

1 H-NMR (400 MHz, CDC

3) blev anvendt til at forudsige forholdet mellem hydrogen nummer: δ (ppm) 12,59 (s, 1H), 8,20 (q, 1H), 7,8 (d, 1H), 7,45-7,40 (m, 2H), 7,35-7,30 (m, 3H), 5,3 (s, 1 H), 4,35 (q, 2H), 2,25 (s, 3H) 1,95 (s, 3H), 1,45 ( t, 3H) (fig 2B). Den

13C-NMR (400 MHz, CDC

3) blev yderligere anvendt til at forudsige rygraden af ​​molekylet: δ (ppm) 195,67, 191,20, 161,94, 140,51, 138,18, 130,13, 126,39, 126,18, 123,93, 123,15, 122,47, 121,00, 120,52, 119,00, 117,65, 109,32, 108,72, 108,59, 96,60, 37,70, 29,08, 27,84, 19,80, 13,82, 13,72 (figur 2C).

(A) IR, (B)

1 H-NMR og (C)

13C-NMR spektre.

Cell levedygtighed assay

MTT blev anvendt til at bestemme den cytotoksiske effekt af ECAP på normal sunde PBMC’er og A549 lungecancerceller. Ellipticine (en potent neoplastisk carbazol-derivat) blev anvendt som en positiv kontrol (figur 3), mens 1% DMSO blev anvendt som en vehikelkontrol (S1 Fig). Baseret på køretøjet kontrolresultater (S1 Fig) og de tidligere levedygtighed DMSO celle resultater [20], 1% DMSO ikke fremkalder cytotoksicitet, derfor ECAP blev opløst i 1% DMSO og bruges i alle efterfølgende behandlinger. De cytotoksicitetsdata repræsenterede en dosis og respons med hensyn til både ECAP og ellipticin (figur 3).

(A) Virkningen af ​​(A) ECAP og (B) ellipticin på celleviabilitet af PBMC’er og A549-celler efter 24 timer behandling. [N = 3 replikater ved 95% konfidensinterval].

Brug af opnåede dosis-respons-kurve, en IC

50 værdi på 1,99 uM ved 95% konfidensinterval blev beregnet for ECAP behandlede A549 lungecancerceller (tabel 1) og efterfølgende anvendes i alle assays. Endvidere viste ECAP ingen cytotoksicitet i normale sunde PBMC’er (det var ikke muligt at beregne IC

50 værdi for PBMC’er).

Lipidperoxidation assay til kvantificering af malondialdehyd (MDA)

Lipidperoxidation, som målt ved MDA-koncentration, blev forøget betydeligt i ECAP behandlede celler sammenlignet med kontrollen (0,305 ± 0,00490 uM vs 0,190 ± 0,007479 uM (kontrol)) ved 95% tillid interval (figur 4).

(p 0,0002) [*** signifikans sammenlignet med kontrolgruppen, antal gentagelser: n ≥ 3]

DNA skader

DNA-skader blev vurderet ved brug. comet assay. ECAP steg markant længden af ​​komet haler i behandlede celler sammenlignet med kontrolgruppen med 81,80 ± 1,19 um vs 68,20 ± 1,61 um (kontrol) (figur 5).

(A) Kontrol og (B) ECAP behandlet A549 celler. (P 0,0001).

Western blot-analyse

Western blotting anvendtes til bestemmelse apoptotiske proteiner induceret af ECAP i A549 lungecancerceller. Nrf2 /Keap1 Systemet regulerer ekspressionen af ​​proteiner, såsom SOD og varmechokproteiner, som er involveret i den cellulære antioxidant og anti-inflammatoriske forsvar [21]. En betydelig reduktion i ekspressionen af ​​Nrf2 (p 0,02 *), Hsp70 (p 0,02 *) og SOD (p 0,01 **) blev observeret i ECAP behandlede celler sammenlignet med kontrollen (figur 6, S2 Fig ). ECAP behandlede celle yderligere demonstreret en stigning i ekspressionen af ​​pro-apoptotiske proteiner, såsom p53 (p 0,09) og Bax (p 0,25) og en reduktion i ekspressionen af ​​anti-apoptotiske Bcl-2 (p 0,0006 ***) (fig 6, S2 fig).

(A) Bax, (B) Bcl-2, (C) p53, (D) Nrf2, (E) Hsp70 og (F) SOD.

Caspase-3/7, 8, 9 og ATP aktiviteter

Caspaser er ATP afhængige enzymer, der fremmer apoptose. Den tidsafhængige virkning af ECAP på aktiviteten af ​​caspaser og ATP-niveauer blev målt i A549 lungecancerceller efter 6 timer og 24 timers inkubering (fig 7).

(A) Aktiviteten af ​​caspase-3/7 (6 h: p 0,4036, 24 h: p 0,0003), (B) Caspase-8 (6 h: p 0,