PLoS ONE: Embelin-induceret apoptose for Human prostatacancerceller medieres gennem Modulation af Akt og β-Catenin Signaling

Abstrakt

Der er stigende tegn på, at embelin, en aktiv bestanddel af

embelia ribes

, inducerer apoptose i humane cancerceller, men de detaljerede mekanismer er stadig uklart. Her har vi undersøgt virkningen af ​​embelin på væksten af ​​humane prostatacancerceller. Embelin stærkt inhiberede cellevækst, især i human prostatacancer-cellelinier, herunder PC3, DU145, LNCaP-LN3 og normal prostata epitelcelle, RWPE-1 sammenlignet med brystcancer (MDA-MB-231, MCF-7, og T47D), hepatom (HepG2, Hep3B, og HuH-7), eller choriocarcinom (JEG-3). Vi observerede, embelin induceret apoptose af PC3-celler på en tidsafhængig måde korreleret med aftagende ekspression af Bcl-2, Bcl-XL, og Mcl-1, øget translokation af Bax til mitokondrierne, og en reduktion i den mitochondriemembranpotential. Desuden embelin inducerede spænding-afhængige anion kanal (VDAC) 1-ekspression og oligomerisering, som kan fremme cytochrom

c

og AIF frigivelse. Fordi embelin var i stand til at inhibere Akt aktivering og cyclooxygenase-2-ekspression blev virkningerne på Wnt /β-catenin signalering bestemt. Embelin aktiveret glycogensyntasekinase (GSK) -3β ved at forhindre phosphorylering og undertrykt β-catenin-ekspression. Dæmpning af β-catenin-medieret TCF transkriptionel aktivitet og gentranskription, såsom cyclin D1, c-myc, og matrixmetalloproteinase (MMP) -7, blev vist i embelin-behandlede celler. Ændringerne i β-catenin-niveauer i respons på embelin blev blokeret ved lithiumchlorid, en GSK-3-inhibitor, hvilket indikerer, at embelin kan nedsætte β-catenin-ekspression via GSK-3β-aktivering. Endvidere eksponering af PC3-celler til embelin resulterede i et signifikant fald i cellemigrering og invasion. Afslutningsvis disse resultater tyder på, at hæmning af Akt signalering og aktivering af GSK-3β bidrager delvist til den pro-apoptotiske effekt af embelin i prostata kræftceller

Henvisning:. Park N, Baek HS, Chun YJ (2015 ) Embelin-induceret apoptose af humane prostatacancerceller medieres gennem Modulation af Akt og β-Catenin Signaling. PLoS ONE 10 (8): e0134760. doi: 10,1371 /journal.pone.0134760

Redaktør: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Republikken Korea

Modtaget: Marts 4, 2015; Accepteret: 13 Juli 2015; Udgivet: 7 August, 2015

Copyright: © 2015 Park et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en Grundforskningsfonden Korea (NRF) tilskud finansieret af den koreanske regering (MSIP) (nr 2015R1A5A1008958). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Embelin (2, 5-dihydroxy-3-undecyl-1, 4- benzoquinon), isoleret som den aktive komponent i frugten af ​​

embelia Ribes

Burm (Myrsinaceae), har været anvendes til behandling af feber og vist at have anti-inflammatorisk, anti-kræftfremkaldende [1], anti-oxidant [2], anti-konvulsiv [3], og anti-bakterielle aktiviteter [4,5]. Embelin vides at være en potent lille molekyle hæmmer af X-bundet inhibitor af apoptose protein (XIAP), som ophæver binding af XIAP til procaspase-9 [1]. Embelin virker som en potent inhibitor af NF-

κ

B [6,7] og viser cytotoksiske virkninger på en række kræft cellelinjer [8]. Selvom embelin er kendt for at undertrykke celleproliferation og inducere apoptose i mange humane cancerceller, de molekylære mekanismer i disse virkninger forbliver uklar. Apoptose spiller en stor rolle i at kontrollere cellulær integritet og er strengt reguleret. To vigtige distinkte apoptotiske tilgange er blevet udviklet, de indre og ydre veje. Initieringssignaler for indre vej genereres af udviklingsmæssige signaler eller cellulære skader, der forårsager tab af mitochondriemembranpotential og frigivelse af pro-apoptotiske proteiner [9, 10]. Men de mekanismer, hvormed apoptogenic initiativtagerne krydser den ydre mitokondrielle membran (OMM) er endnu ikke fuldt afklaret. Spændingsafhængig anion kanal (VDAC) 1 placeret i OMM er blevet foreslået som en vigtig bestanddel af permeabilitetsovergang pore (PTP), hvilket fører til frigivelse af cytochrom c og apoptoseinducerende faktor (AIF) [11,12]. Oligomerisering af VDAC1 at danne en stor porestruktur som reaktion på flere pro-apoptotiske signaler kan kræves for cytochrom c-frigivelse [13]. Endvidere interaktion VDAC1 med Bax, et proapoptotiske Bcl-2-familien protein kan danne større kompleks end VDAC1 alene eller Bax alene og fremmer åbningen af ​​PTP [14]. Men anti-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner, såsom Bcl-2, Bcl-XL, eller Mcl-1 forhindre PTP åbning og er forbundet med behandling modstand og progression i mange typer af cancer, herunder prostatacancer [15]. Ifølge tidligere undersøgelser, Mcl-1 er en afgørende regulator af apoptose og differentiering og overudtrykkes i hovedparten af ​​prostatacancerceller [16]. Chen et al. rapporterede en hidtil ukendt vej, som består af Akt, cyclooxygenase-2 (COX-2), Mcl-1, for erhvervet resistens over for apoptose i cancerceller [17]. Akt regulerer cellulære signalveje netværk, der er involveret i processer forbundet med cellulær proliferation, differentiering og metabolisme og aktiverer en COX-2-medierede anti-apoptotiske vej, der involverer Mcl-1 [18,19]. Phosphorylering med Akt på Ser 9 rest af GSK-3β resulterer i dens inaktivering [20, 21], hvilket resulterer i stabiliseringen af ​​β-catenin, der er korreleret med forøget transskription af nedstrøms-målgener [22]. Endvidere inhibering af GSK-3β phosphorylering undertrykker klart β-catenin-ekspression og resistens over for apoptose. Nærværende undersøgelse viser, at embelin inducerer mitokondrie-afhængig apoptose og hæmning af β-catenin udtryk via Akt hæmning og GSK-3β aktivering i humane prostata kræftceller.

Materialer og metoder

Cell kultur

human prostatacancer-cellelinier PC3, DU145, og LNCaP-LN3, human prostata epitelcellelinie RWPE-1, human lever hepatocellulært carcinom cellelinie HepG2, Hep3B, og HuH-7 eller human brystcancer cellelinje MDA- MB-231, MCF-7, og T47D-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Den humane choriocarcinom cellelinie JEG-3 blev erhvervet fra den koreanske cellelinje Bank og blev dyrket i DMEM medium med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2.

Reagenser

Embelin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). En 100 mM opløsning af embelin blev fremstillet i dimethylsulfoxid, opbevares som små alikvoter ved -20 ° C og derefter fortyndet efter behov i celledyrkningsmedium. En 8M opløsning af lithiumchlorid blev opnået fra Sigma-Aldrich og fortyndet efter behov i celledyrkningsmedium. FBS og RPMI 1640 medium blev indkøbt fra HyClone (Logan, UT). Neon transfektionssystem, JC-1 assay kit og COX-4-antistof var fra Life Technologies (Carlsbad, CA). Den bicinchoninsyre (BCA) proteinassaykit og ECL kit var fra Thermo Scientific (Rockford, IL). Antistoffer mod phospho-Akt (Ser473), GSK-3β, phospho-GSK-3β, eller Bcl-2 var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mod Total-Akt, VDAC1, Bd-XL, Bax, β-catenin, cyclin D1, GAPDH eller gede-anti-kanin IgG-Texas Red og Ultra Cruz monteringsmedium var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Cyclooxygenase-2 (COX-2), Mcl-1, cytochrom

c

, AIF, β-catenin, c-myc eller histon H1-antistoffer var fra Millipore Co. (Bedford, MA). Alle andre kemikalier var af den højeste renhed eller molekylærbiologisk kvalitet og blev opnået fra kommercielle kilder.

Cellelevedygtighed assay Salg

Celler (1 x 10

4 celler /brønd) blev tilsat til en 96-brønds rundbundet mikroplade og blev inkuberet i den angivne tid ved 37 ° C. Efter behandling for det angivne tidspunkt blev cellerne behandlet med 10 pi EZ-CyTox (Daeil Lab service, Korea) blev tilsat til hver brønd. Efter 2 timers inkubation ved 37 ° C blev absorbansen målt ved 450 nm under anvendelse af en Genios Pro mikropladelæser (TECAN, Schweiz).

Annexin V /PI apoptose assay

Celler blev pelleteret ved 1200 rpm og vasket en gang med 1 ml iskold phosphatpufret saltvand (PBS). Den resulterende pellet blev resuspenderet i 1 ml 1 × bindingsbuffer. Den resulterende blanding blev holdt på is i 60 minutter, hvorefter cellerne blev permeabiliseret med 50 ug /ml annexin V-FITC og 50 ug /ml propidiumiodid i 1 × bindingspuffer. Prøverne blev holdt ved 37 ° C i 60 minutter og analyseres øjeblikkeligt under anvendelse af en BD FACScan flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Måling af mitochondriemembranpotential (Δ

ψ

m)

Celler dyrket på poly-d-lysin-overtrukne dækglas blev behandlet i 24 timer med embelin i vækstmedium, hurtigt vasket med PBS, og derefter mærket med 2 pM JC-1 i 30 minutter ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator. Efter vask adskillige gange med PBS blev dækglassene monteret på objektglas under anvendelse af Ultra Cruz mounting medium. Fluorescenssignaler blev analyseret med en LSM 510 META Konfokal Laser Scanning Microscope (Zeiss, Jena, Tyskland).

Transient transfektion

I transient transfektion blev celler transficeret med pece myr-Akt eller human COX -2 promotor- luciferase-konstruktioner og pRL-Renilla (Promega) vektorer under anvendelse af Neon transfektionssystemet som anbefalet af fabrikanten. Kort fortalt, en dag før transfektion blev ca. 5 × 10

5 celler pr 60-mm plade blev podet i RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS. Celler blev vasket i PBS og derefter resuspenderet i Opti-MEM serum-frit medium. Transfektion blev udført med 2 ug plasmid-DNA i 5 timer ved 37 ° C. Efter transfektion blev cellerne holdt i RPMI-medium indeholdende 10% FBS i 48 timer.

Subcellulær fraktionering

Efter behandling blev cellerne høstet og vasket med iskoldt PBS. Subcellulær fraktionering blev udført ved anvendelse af Mitokondrier Isolation kit til dyrkede celler og NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Extraction kit fra Thermo Scientific. Western blotting blev udført under anvendelse af antistoffer mod følgende kontrol markørproteiner:. GAPDH for cytosoliske fraktion, COX-4 for den mitokondriske fraktion eller histon-H1for kernefraktionen

Western blot-analyse

celler blev solubiliseret med iskold lysepuffer (pH 7,4) indeholdende 25 mM HEPES, 1% Triton X-100, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF og 1 ug /ml leupeptin. De ekstraherede proteiner (30 ug) blev separeret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) på 10% polyacrylamidgeler, og blev elektroforetisk overført til PVDF-membraner. Membraner blev blokeret i 5% (w /v) fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand i 2 timer ved 4 ° C og derefter blev inkuberet natten over med primære antistoffer ved en 1: 1000 fortynding i 5% (vægt /volumen) Tris- saltvand indeholdende 0,1% Tween-20. Efter inkubering med sekundært antistof i 2 timer blev proteiner visualiseret ved ECL og bandet intensitet blev analyseret under anvendelse af en ChemiDoc XRS densitometer og kvantificeres ved Mængde One software (Bio-Rad, Richmond, CA). Proteinkoncentrationer blev anslået under anvendelse af BCA fremgangsmåde ifølge leverandørens anbefalinger under anvendelse af bovint serumalbumin som en standard.

Immunofluorescens Salg

celler dyrket på poly-D-lysin-overtrukne dækglas blev behandlet i 24 timer med embelin i vækstmedium, hurtigt vasket med PBS, og derefter behandlet med vækstmedium inklusive 100 nM MitoTracker prober (Invitrogen). Efter 1 time blev cellerne fikseret med 3,7% (vægt /volumen) paraformaldehyd i PBS, pH 7,4, i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med PBS blev cellerne blokeret i 15 min i PBS indeholdende 5% gedeserum og 0,2% Triton X-100, derefter inkuberet med primært antistof (1: 1000) i 1 time, vasket grundigt og farvet i 1 time med ged anti-kanin IgG-Texas Red (1: 500). Efter yderligere vaske blev dækglassene monteret på objektglas under anvendelse af Ultra Cruz mounting medium. Fluorescenssignaler blev analyseret ved anvendelse af en LSM 510 META Konfokal Laser Scanning Microscope (Carl Zeiss, Tyskland).

Tværbinding af VDAC

Efter behandling med embelin, sulfo-EGS i DMSO blev tilsat til en slutkoncentration på 250 uM. Efter 25-minutters inkubation ved 30 ° C blev krydsbinder standset ved tilsætning af 1 M Tris-HCl (pH 7,5) til en endelig koncentration på 20 mM. Prøver blev derefter solubiliseret i 1% NP-40 og sonikeret i 7 s fem gange med en 30% puls under anvendelse af en Vibra-Cell sonikator (Sonics og Materials, Newtown, CT).

DNA fragmentation assay

DNA-fragmenter blev ekstraheret med Exgene Cell SV genomisk DNA oprensningssystem (GeneAll, Korea) ifølge fabrikantens protokol. DNA-fragmenterne blev separeret under anvendelse af gelelektroforese på en 1% agarosegel. Loaded DNA blev visualiseret ved ChemiDoc XRS (Bio Rad).

Dual luciferase reporter assay Salg

Celler (1 x 10

6 celler /brønd) blev cotransficeret med 2 ug af human COX 2-promotoren luciferase konstruktioner og pRL-Renilla (Promega) vektorer eller 2 ug TOPFlash luciferase vektorer med vildtype TCF-bindingssteder og FOPFlash luciferase vektor med mutanten TCF bindingssteder ifølge producentens protokol under anvendelse af Neon transfektionssystemet. Efter 48 timer blev cellerne behandlet med 30 pM embelin i de angivne tidsrum, og lyseret med passiv lysepuffer, og luciferaseaktiviteter blev målt fortløbende ved anvendelse af Dual Luciferase Assay System (Promega) med en FilterMax F3 mikropladelæser (Molecular Devices, CA) .

sårheling assay

celler (1 x 10

6 celler /brønd) blev podet i 6-brønds cellekultur plader. Cellerne fik lov at vokse til konfluens i RPMI1640-medium indeholdende 10% FBS. Celler blev vasket med PBS og inkuberet med 25 ug /ml mitomycin C i 30 min. A1 mm bred ridse skete over cellelaget anvendelse af en steril pipettespids. Plader blev fotograferet efter den angivne tid.

Invasion assay

Cell invasion blev målt under anvendelse af celleinvasion assay kit (Chemicon, Temecula, CA) ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev celler podet på en invasion kammer insert indeholdende en 8 um porestørrelse polycarbonatmembran belagt med et tyndt lag af polymeriseret collagen. Invaderende celler på bunden af ​​indsatsen membranen blev farvet og fotograferet.

gelatinezymografi

Konditionerede medier blev analyseret for gelatinaser ved gelatinezymografi. For gelatinaser blev prøver separeret under ikke-reducerende betingelser på 10% SDS polyacrylamidgeler inkorporerer 0,1% gelatine. Efter SDS-PAGE blev gelen inkuberet med renatureringsbuffer i 15 minutter tre gange. Derefter blev gelerne udskiftet i udvikling puffer ved 37 ° C natten over. Gelerne blev vasket og fotograferet efter farvning med 0,5% Coomassie blå opløsning i 30 minutter.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af envejs variansanalyse efterfulgt af Dunnetts parvis multipel sammenligning t-test med GraphPad Prism software (GraphPad software Inc., CA) efter behov. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant ved *

s

0.05.

Resultater

Embelin hæmmer spredning af menneskelige prostata cancerceller

Forskellige menneskelige kræftceller, herunder prostata cancer celler (PC3, DU145 og LNCaP-LN3), human prostata epitelcelle (RWPE-1), brystcancerceller (MDA-MB-231, MCF-7, og T47D), hepatomaceller (HepG2, Hep3B, og huh-7), og choriocarcinoma celler (JEG-3) blev behandlet med forskellige koncentrationer af embelin at bestemme virkningerne af embelin på cellulær proliferation (Fig 1). Embelin hæmmede signifikant væksten af ​​humane prostata kræftceller i forhold til sine virkninger på andre kræftceller. Cellelevedygtighed blev reduceret med embelin i human prostatacancer-cellelinier og prostata epitelcelle herunder PC3, DU145, LNCaP-LN3 og RWPE 1 med IC

50 værdier på 23,6 pM, 11,0 uM, 32,0 um, og over 200 uM henholdsvis når celler blev dyrket i 24 timer (fig 1E). Prostatakræft cellelinjer blev tydeligt hæmmet af embelin, men normal prostata celler blev ikke påvirket af embelin i lav koncentration i 24 timer. Til yderligere undersøgelser, blev 30 uM koncentration af embelin udvælges til behandling af PC3-celler. Salg

Celler blev behandlet med embelin i forskellige koncentrationer i de angivne tidsrum. Cellelevedygtighed blev målt ved CCK. Formazan-dannelse blev kvantificeret ved hjælp af spektrofotometri ved 450 nm. Procentdelen af ​​celler overlevende i hver gruppe i forhold til kontrollen blev beregnet. (A) PC3 celle. (B) DU145 celle. (C) LNCaP-LN3 celle. (D) RWPE-1-celle. (E) IC

50 værdier af embelin i forskellige humane cancercellelinier. IC

50 værdier blev analyseret under anvendelse af GraphPad Prism software. Værdier repræsenterer middel ± S.D. af tre uafhængige bestemmelser. * Signifikant forskellig fra de ubehandlede kontrol celler (

s

0,05).

Induktion af apoptose ved embelin

For at belyse, om embelin inducerer apoptose i PC3 celler, flowcytometrisk analyse blev udført med annexin V og propidiumiodid (PI) -stained celler. Behandling med 30 pM embelin i op til 48 h forårsagede en kraftig stigning i antallet af apoptose. Celler behandlet med 30 pM embelin i 12 timer og 24 timer viste en 15,6-fold og 17,2 gange stigning i apoptose sammenlignet med ubehandlede celler (figur 2A). Efter 48 timers inkubation blev en signifikant stigning i nekrose observeres i embelin-behandlede celler. Behandling med embelin inducerede også kromosomal DNA fragmentation i en tidsafhængig måde (Fig 2B). Fordi mitokondrie gennemtrængelighed overgang kan føre til apoptose, vi bestemt effekten af ​​embelin på mitokondrie membran potentiale (Δ

ψ

m). Fig 2C viste, at embelin stærkt nedsat Δ

ψ

m, angivet som den rød /grøn fluorescens-forhold i tidsafhængig måde. Disse resultater antyder, embelin er i stand til at inducere apoptose ved at ændre mitochondriemembranpermeabilitet.

(A) Celler blev inkuberet i de angivne tidsperioder med embelin (30 uM), og blev farvet med annexin V-FITC og PI . Apoptose blev målt ved flowcytometri. De cellepopulationer blev diskrimineret i hver kvadrant som levedygtige celler i nederste venstre (annexin V negativ /PI negativ), tidlige apoptotiske celler i øverste venstre (annexin V positiv /PI negativ), sent apoptotiske celler i øverste højre (annexin V positive /PI positive), og nekrotiske celler i nederste højre kvadrant (annexin V negativ /PI positive). (B) Induktion af DNA fragmentation i PC3 celler ved embelin. Cellerne blev inkuberet i de angivne perioder med embelin. Kromosomalt DNA blev isoleret og DNA-fragmentering blev bestemt. M, DNA-markør; P, paclitaxel (1 uM). (C) Efter PC3 celler blev inkuberet med embelin for tidsrum blev celler mærket med 2 M JC-1 i 30 minutter og Δ

ψ

m blev bestemt ved konfokal mikroskopi. Forholdet mellem JC-1 aggregat (rød) til monomer (grøn) intensitet blev beregnet med Image J software. Værdier repræsenterer middel ± S.D. af tre uafhængige bestemmelser. * Signifikant forskellig fra de ubehandlede kontrol celler (

s

0,05).

For at afgøre, om embelin påvirker niveauerne af apoptose-relaterede proteiner i mitokondrier, målt vi beløbet af Bax (pro-apoptotisk), Bcl-2, Bcl-xL, og Mcl-1 (anti-apoptotisk). Som vist i fig 3A og 3B, fandt vi, at embelin (30 uM) stærkt inducerede translokation af Bax fra cytosol til mitokondrier. Ekspressionsniveauerne af anti-apoptotiske Bcl-2-familien proteiner, såsom Bcl-2, Bcl-XL, og Mcl-1, blev signifikant reduceret ved embelin. 24 timer efter embelin behandling, niveauerne af Bcl-2, Bcl-XL, og Mcl-1 var 15%, 58% og 28% af kontrolniveauet hhv. Frigivelse af cytochrom

c

fra mitokondrier til cytosol blev også forbedret i tilstedeværelsen af ​​embelin (Fig 3C). 24 timer efter embelin behandling, cytochrom

c

niveau blev reduceret til 45% i mitokondrier, men i cytosolen cytochrom

c

niveauet blev forøget til 1,8 gange af kontrolniveauet. Konfokal mikroskopisk analyse viste også, at embelin forbedrer Bax translokation til mitochondrier og cytochrom

c

frigivelse til cytosolen (Fig 3B og 3D). Vi fandt også, embelin inducerer translokation af apoptoseinducerende faktor (AIF) fra mitokondrier, gennem cytosolen, og endelig til cellekernen (fig 3E). Konfokal mikroskopisk analyse viste, at behandling med embelin forbedrer AIF translokation til cellekernen (fig 3F). For at bestemme om embelin inducerer oligomerisering af VDAC at fremme ændringer i Δ

ψ

m, og frigivelse af cytochrom

c

og AIF, celler blev behandlet med sulfo-EGS at generere tværs sammenkædning mellem VDAC, og oligomerisering af VDAC blev bestemt ved Western blotting under anvendelse af et anti-VDAC1 antistof. Når celler blev behandlet med embelin (30 uM) i op til 24 timer, embelin klart induceret ekspression og dimerisering af VDAC1 i en tidsafhængig måde (Fig 3G). Disse resultater antyder, at VDAC1 kunne være en mediator af embelin-induceret apoptose og at VDAC oligomerisation induceret af embelin potentielt kunne bestemme dens gating kapacitet til udstrømningen af ​​mitokondrielle proteiner, såsom cytokrom

c

og AIF.

(A), (C), (E) translokation af pro-apoptotisk protein (Bax), cytochrom

c

, AIF, og niveauet af anti-apoptotiske proteiner (Bcl-2, Bcl-xL , Mcl-1) blev analyseret ved western blotting. Cellerne blev behandlet med embelin for de indikerede tidsperioder. Efter inkubation blev cellerne høstet, og den cytosoliske og mitokondriske fraktioner blev isoleret. Ekstraherede proteiner blev adskilt ved SDS-PAGE (10%) og Western blot-analyse blev udført. GAPDH niveau blev bestemt som lastning styringer til cytosol og totale lysater. COX-4-niveauet blev bestemt som en loading kontrol for mitokondrier. Histon H1 niveau blev bestemt som en belastning kontrol for nuklear fraktion. C, cytosolisk fraktion, M, mitochondriefraktionen, N, nuklear fraktion. Numrene mellem blots er forholdene mellem intensiteten af ​​bånd efter normaliseret med kontrol. (B), (D), (F) translokation af Bax (B), cytochrom

c

(D), og AIF (F). Celler blev dyrket på mikroskopiske objektglas og behandlet med embelin i 24 timer. Efter behandling blev cellerne fikseret, permeabiliseret, og efterfølgende farvet med specifikt antistof. Celler blev derefter farvet med det Texas-Red-mærket sekundært antistof. Fluorescens blev bestemt under anvendelse af konfokal mikroskopi. G, Ekspression af VDAC1 og oligomerisering af VDAC1. Embelin-behandlede celler blev høstet og derefter inkuberet med sulfo-EGS (250 uM) i 25 minutter ved 30 ° C. Efter proteiner blev adskilt ved SDS-PAGE (8%), blev VDAC1 proteiner målt under anvendelse af Western blot-analyse. En 33 kDa bånd repræsenterer VDAC1 monomerer mens et bånd ved 65 kDa repræsenterer VDAC1 dimer. Mitochondriefraktionen blev isoleret og opløst ved SDS-PAGE (12%) og Western blot-analyse blev udført. COX-4-niveau blev bestemt som en belastning kontrol for mitokondrier.

Hæmning af embelin af Akt aktivering og β-catenin vej

Tidligere Chen et al. rapporterede en hidtil ukendt vej, der består af Akt, og COX-2 for erhvervet apoptose resistens i cancerceller [17]. Fordi vi fandt, at embelin undertrykker Akt phosphorylering og COX-2-ekspression blev bestemt. Celler blev behandlet med 30 pM embelin til 6, 12 eller 24 timer og niveauet for phospho-Akt (Ser473), total Akt, og COX-2 blev målt ved Western blot-analyse. Som vist i fig 4A, phosphorylering af Akt om Ser473 og ekspression af COX-2 blev signifikant nedsat ved embelin, selv om det samlede Akt niveauer ikke ændres væsentligt. 24 timer efter embelin behandling, phospho-Akt og COX-2-niveauer faldt med 99% og 52% henholdsvis fra niveauet for kontrolceller. Samtidig vurderede vi hæmning af Akt aktivering i PC3-celler, blev phosphorylering af Akt og cellelevedygtighed faldt med Akt inhibitor IV (0,3 uM) (Fig 4B). Når celler blev transficeret med pece-Myr-Akt plasmid til ekspression af konstitutivt aktive Akt, embelin-medieret reduktion af Akt phosphorylering på Ser473 (Fig 4C). Endvidere fandt vi, at embelin-medieret formindskelse i cellelevedygtighed blev forhindret af myristoyleret Akt ekspression. Embelin inhiberede også COX-2 promotoraktivitet, som bestemt ved luciferase reporter assay, hvilket indikerer, at embelin kan inhibere Mcl-1 ekspression ved blokering af Akt-COX-Mcl-1-vejen.

(A) Celler blev behandlet med 30 pM embelin for de angivne tidsperioder, og hele cellelysater blev fremstillet, og ekstraherede proteiner blev adskilt ved SDS-PAGE (10%) og Western blot-analyse under anvendelse af phospho-Akt, total Akt, og COX-2-antistoffer blev udført. Numrene mellem blots er forholdene mellem intensiteten af ​​bånd efter normaliseret med kontrol. (B) Celler blev transficeret med Myr-Akt plasmidet og derefter behandlet med 30 uM embelin i 24 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved CCK. Værdier repræsenterer middel ± S.D. af tre uafhængige bestemmelser. * Signifikant forskellig fra de ubehandlede kontrol celler (

s

0,01) og **, markant forskellige fra den embelin kun behandlede celler (

s

0,001). Helcellelysater blev fremstillet og niveauerne af total Akt og phospho-Akt blev bestemt ved Western blot analyse. (C) AKT-inhibitor IV behandlede cellelysater blev fremstillet og ekstraherede proteiner blev adskilt ved SDS-PAGE (10%) og Western blot-analyse under anvendelse af phosphor-Akt, total Akt, og GAPDH-antistoffer blev udført. Celler blev behandlet med 0,312 pM af AKT-inhibitor IV i 24 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved CCK. Formazan-dannelse blev kvantificeret ved hjælp af spektrofotometri ved 450 nm. Procentdelen af ​​celler overlevende i hver gruppe i forhold til kontrollen blev beregnet. (D) Celler blev transficeret med COX-2 luciferase vektor og renilla luciferase vektor til 48 timer. Celler blev udsat for dual-luciferase assay. Den relative ildflueluciferaseaktivitet, normaliseret ved renilla luciferaseaktivitet er vist. Værdier repræsenterer middel ± S.D. af tre uafhængige bestemmelser *, signifikant forskellig fra den ubehandlede kontrol (

s

0,05)..

Forrige rapport antyder, at β-catenin spille en afgørende rolle i flere vækstsignaler i humane prostatacancerceller [23]. For at bestemme virkningen af ​​embelin på β-catenin-ekspression blev PC3-celler behandlet med embelin (30 uM) i op til 24 timer og Western blotting blev udført. Fig 5A viste, at embelin er i stand til at reducere β-catenin niveau i en tidsafhængig måde. 24 timer efter embelin behandling blev niveauet af β-catenin faldt med 40% i forhold til niveauet i kontrolceller. Bestemte vi TOP flash luciferaseaktivitet at måle niveauet af β-catenin nuklear translokation og TCF transkriptionel aktivering. Embelin (30 uM) inhiberede signifikant TOPflash aktivitet til 19% af kontrollen ved 24 timer behandling (Fig 5B). Konfokal mikroskopisk analyse bekræftede også, at behandling med embelin klart faldet niveauet af β-catenin i PC3-celler (Fig 5C). Transkription af målgener af β-catenin, såsom cyclin D1, c-myc, eller MMP-7 blev også signifikant undertrykt af embelin (Fig 5D). Interessant mRNA-transkription af MMP-7 blev næsten fuldstændig blokeret efter 12 h behandling med embelin. Western blot-analyse viste også, at embelin stærkt nedsat cyclin D1, c-Myc, og MMP-7 proteinniveauer (Fig 5D).

(A) Helcellelysater blev fremstillet og ekstraherede proteiner blev adskilt ved SDS-PAGE (10%) og Western blot-analyse under anvendelse af β-catenin, phospho-β-catenin, eller GSK-3p-antistoffer blev udført. Numrene mellem blots er forholdene mellem intensiteten af ​​bånd efter normaliseret med kontrol. (B) Luciferase assay. TOPFlash eller FOPFlash-transficerede celler blev behandlet med embelin. Luciferaseaktiviteten blev målt, og den relative ildflueluciferaseaktivitet, normaliseret ved renilla luciferaseaktivitet er vist. (C) Celler blev podet på dækglas i 24 timer og behandlet med 30 pM embelin op til 24 timer. Derefter blev cellerne farvet med β-catenin antistof og fluorescens blev bestemt ved anvendelse af konfokal mikroskopi. (D) Ekspression af cyclin D1, c-myc og MMP-7 blev bestemt ved brug af kvantitativ PCR og Western blot-analyse. Værdier repræsenterer middel ± S.D. af tre uafhængige bestemmelser *,

#,

§, signifikant forskellig fra den ubehandlede kontrol (

s Restaurant 0,05).. Tallene mellem blots er forholdene mellem intensiteten af ​​båndene efter normaliseret med kontrol.

Forrige rapport foreslået, at GSK-3β modulerer β-catenin niveauer ved phosphorylering af β-catenin på Ser 33/37 og Thr 41 [24]. Vi undersøgte, om embelin er i stand til at forbedre GSK-3β stabilitet og aktivitet. Som vist i figur 6A, fandt vi, at embelin kraftigt forhindrede phosphorylering af GSK-3β på Ser 9 ved Akt aktivering. Embelin kraftigt induceret phosphorylering af β-catenin på Ser 33/37 /Thr 41 og kan fremme β-catenin-nedbrydning. Vores hypotese, at embelin-medierede stigning i phosphorylering af β-catenin kan være forårsaget af GSK-3β-aktivering, fordi den reducerede β-catenin niveau ved embelin behandling blev næsten fuldstændig udvundet ved behandling med LiCI (20 mM), et GSK-3β-inhibitor . LiCI sænkede også embelin-medieret induktion af β-catenin phosphorylering. Som behandling med LiCl ikke genvinde embelin-medieret fald i GSK-3β phosphorylering, kan LiCI inhibere GSK-3β-aktivitet, men ikke ændre GSK-3β phosphorylering. Interessant nok blev MCL-1-niveau steg 1,4 gange ved LiCl behandling og nedsat niveau af Mcl-1VED embelin var signifikant genvundet ved LiCl (Fig 6A). Disse resultater antyder, Mcl-1-ekspression moduleres af GSK-3β-aktivitet. Maurer et al. rapporterede, at inhibering af GSK-3β gennem Akt aktivering induceret Mcl-1-ekspression [25]. Vores data bekræftede også, at GSK-3β aktivering ved embelin-medieret Akt hæmning undertrykker Mcl-1-ekspression. Desuden LiCI-induceret TOPFlash aktivitet 2,5 gange af kontrol og embelin inhiberede TCF transkriptionel aktivering forårsaget af LiCI-induceret stigning i β-catenin (fig 6B). Konfokal mikroskopisk analyse viste, at behandling med embelin næsten fuldstændig hæmmet β-catenin-ekspression (Fig 6C). Behandling med LiCl udvundet embelin-medieret fald i β-catenin-ekspression. Chen et al.