PLoS ONE: Omhyggelig udvælgelse af referencecentre Gener er nødvendig for pålidelig ydeevne af RT-qPCR i Human Normal og Kræft Cell Lines

Abstrakt

Reverse Transcription – kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) er en standard teknik i de fleste laboratorier. Udvælgelsen af ​​reference- gener er afgørende for data normalisering og udvælgelse af egnede referenceprodukter gener fortsat kritisk. Vores mål var at en) gennemgå litteratur siden gennemførelsen af ​​retningslinjerne MIQE for at identificere graden af ​​accept; 2) sammenligne forskellige algoritmer i deres udtryk stabilitet; 3) identificere et sæt af egnede og mest pålidelige referencepunkter gener til en række menneskelige kræftceller. En PubMed database gennemgang blev udført og publikationer siden 2009 blev udvalgt. Tolv formodede referencepunkter gener blev profileret i normale og forskellige cancercellelinier (n = 25) under anvendelse af 2-trins RT-qPCR. Undersøgte reference- gener blev rangordnet efter deres udtryk stabilitet ved fem algoritmer (geNorm, Normfinder, BestKeeper, sammenlignende ACt, og RefFinder). Vores gennemgang afslørede 37 publikationer, med to tredjedele patientprøver og en tredjedel cellelinjer. qPCR effektivitet blev givet i 68,4% af alle publikationer, men kun 28,9% af alle undersøgelser forudsat RNA /cDNA beløb og standard kurver. GeNorm og Normfinder algoritmer blev anvendt i 60,5% i kombination. I vores udvalg af 25 cancer cellelinjer, vi identificeret

HSPCB

,

RRN18S

, og

RPS13

som de mest stabile udtrykte reference- gener. I den delmængde af æggestokkene kræft cellelinjer, reference- gener var

PPIA

,

RPS13

SDHA

, klart viser nødvendigheden af ​​at vælge gener afhængigt af forskningsfokus. Desuden skal etableres på forhånd forsøgene, i henhold til retningslinjerne en kohorte af mindst tre egnede referenceprodukter gener. For oprettelse af et sæt af reference- gener til gen-normalisering anbefaler vi brug af ideelt tre referenceår gener udvalgt af mindst tre stabilitet algoritmer. Den uheldige manglende overholdelse af retningslinjerne MIQE afspejler, at disse skal yderligere etableret i forskningsverdenen

Henvisning:. Jacob F, Guertler R, Naim S, Nixdorf S, Fedier A, Hacker NF, et al . (2013) Omhyggelig udvælgelse af referencecentre Gener er nødvendig for pålidelig ydeevne af RT-qPCR i Human Normal og cancercellelinjer. PLoS ONE 8 (3): e59180. doi: 10,1371 /journal.pone.0059180

Redaktør: Sui Huang, Institut for Systembiologi, USA

Modtaget: November 28, 2012; Accepteret: 12. februar 2013; Udgivet: 15. marts 2013 |

Copyright: © 2013 Jacob et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den schweiziske National Foundation (PBZHP3-133289 og -138.752 til FJ, 320.030-120.543 til VHS.); Cancer Institute New South Wales (09 /CRF /2-02 til VHS); Royal australske og New Zealand College of Obstetricians og gynækologer (til VHS); William Maxwell Trust (til VHS) og Royal Hospital for Women Foundation (til VHS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

revers transkription (RT) – kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) er blevet en alsidig teknik til at undersøge ekspression ændringer af et eller flere gener af interesse i forskellige patologiske tilstande. På grund af sin specificitet, sensitivitet, enkelhed, omkostninger og high-throughput, RT-qPCR tilbyder en bred vifte af fordele i forhold til standard-metoder såsom Northern blot og semi-kvantitativ PCR. Det er derfor blevet den mest spirende værktøj til absolut og relativ kvantificering af mRNA transskription niveauer [1]. RT-qPCR er en robust assay, der anvender veletablerede kemi og dataanalyse og er derfor bedre end teknikker, såsom Southern blotting eller DNA-sekventering [2]. På trods af sin brede accept, der er uoverensstemmelser i anvendelsen af ​​den samlede RNA udvindingsmetoder, RNA mængde pr reaktion [3], RNA integritet vurderinger [4], qPCR Master blandinger og i de forskellige producenter af revers transkription kits. Desuden er anvendelsen af ​​forskellige qPCR påvisningsmetoder såsom farvestofbaseret eller probe-baserede systemer udvider spektret af mulige anvendelser. For at overvinde eventuelle vanskeligheder og for at opnå konsensus i udførelsen og analyse af kvantitative PCR eksperimenter blev det MIQE (Minimum Information til Offentliggørelse af kvantitativ real-time PCR Eksperimenter) retningslinjer indført i 2009, forbedre det eksperimentelle design [5]. Desuden vil anvendelsen af ​​disse retningslinjer levere bedre og reproducerbare resultater ved at rapportere parametre såsom RNA integritet, reaktion volumen, cDNA /RNA-koncentrationen, eller kalibreringskurver [6].

Target gen normalisering opnås sædvanligvis ved hjælp af reference- gener for at kompensere inden for og mellem kinetisk RT-qPCR [7]. Flere matematiske tilgange er blevet offentliggjort, der leverer egnede referenceprodukter gener med den laveste variation og med høj stabilitet på tværs af de biologiske prøver. De fire mest almindeligt anvendte metoder er: (1) NormFinder algoritme [8], som er en statistisk model, der estimerer samlede variation af genekspression for hver kandidat henvisning gen og leverer en stabilitet værdi. Denne værdi er relateret til den systematiske fejl af hver kandidat-gen. (2) GeNorm [9] beregner et gen stabilitet foranstaltning for hver kandidat gen. Henvisningen genet med den laveste stabilitet (M) fjernes fra yderligere analyse, og M værdier gentagne gange beregnet indtil den mest stabile henvisning gen starter. (3) BestKeeper, en Microsoft

® Excel-baseret værktøj, bruger parvise korrelationer [10]; og (4) den sammenlignende delta Ct (baseret på retningslinjerne for nomenklatur og MIQE: kvantificering cyklus (Cq) foretrækkes til tærsklen cyklus (Ct), begge beskriver fraktioneret PCR cyklus bruges til kvantificering) metode rangerer stabiliteten af ​​kandidatgener ifølge repeterbarhed genekspressionssystemer forskelle [11]. Ingen af ​​de indførte algoritmer synes at være optimal og forskeren har altid at vælge, hvilken henvisning gen at bruge, og hvordan man kan identificere. Dette kan også påvirke fortolkningen af ​​RT-qPCR resultater.

Talrige formodede referencepunkter gener er blevet rapporteret for en bred vifte af humane væv, for humane cellelinjer, og til cellekulturer under forskellige eksperimentelle betingelser såsom medicinsk behandling eller miljømæssige faktorer. Men ingen reference- gener egnede til analyse af menneskelige kræftceller stammer fra gynækologisk cancer og tyktarmskræft er endnu ikke beskrevet.

Det primære formål med denne undersøgelse var at identificere de mest stabile referencepunkter gener egnede til undersøgelsen af normale og cancer cellelinjer af ovarie eller colon oprindelse ved profilering et sæt på 12 formodede reference- gener og for første gang anvender fem stabilitet algoritmer til at vurdere indflydelsen af ​​bioinformatiske dataanalyse. Vi var også interesseret i at se, hvordan forskellige producenter af revers transkriptase kits påvirke variationen af ​​henvisningen genekspression. Desuden blev en revision af den nuværende litteratur udført for at vurdere overholdelsen af ​​MIQE retningslinjerne i udførelsen af ​​RT-qPCR rapporterede siden deres indførelse.

Materialer og metoder

Anmeldelse

En PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) database review om brug af formodede reference- gener i RT-qPCR blev udført. Publikationer rådighed i perioden fra januar 2009 til april 2012, behandlet og identificeres ved hjælp nøgleordene: »reference- gener ‘eller’ husholdning gener” og “RT-qPCR ‘OR’ kvantitativ PCR. Referencelister fra udvalgte publikationer blev også anset for optagelse af potentielt relevante artikler. Publikationer ikke skrevet på engelsk og dem, der opgiver RT-qPCR udført på mindre end fem reference- gener blev udelukket. Kun publikationer med humane prøver blev inkluderet. Publikationer blev evalueret i henhold til udgivelsesår, typen og mængden af ​​prøver, antallet af reference- gener, de metoder, der anvendes til at bestemme RNA integritet, mængden af ​​total RNA oprindeligt anvendt til RT og /eller qPCR, at antallet af gentagelser i qPCR, detaljerne om seriefortyndinger for kalibreringskurven og effektivitet, den udnyttede qPCR kemi (SYBRgreen eller TaqMan), og de matematiske tilgange (computing algoritmer) for henvisning genekspression stabilitet måling.

Cell Culture

I denne undersøgelse blev anvendt 2 normale og 23 cancercellelinier af forskellig oprindelse. De cellelinier blev afledt fra ATCC (www.atcc.org) eller var en gave fra Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australien. Skriftligt informeret etisk samtykke blev givet (HREC 08/09/17 /3,02, til VHS.). En detaljeret liste over de cellelinier og dyrkningsbetingelserne er givet som supplerende data (tabel S1). Alle cellekulturer blev holdt ved 37 ° C i 5% CO

2. Kulturer var fri for mycoplasma, som bestemt ved kvalitativ PCR hjælp VenorGeM

® Mycoplasma Detection Kit (Biocene Pty Ltd, Rozelle, Australien).

RNA Extraction og Integritet

For at undersøge udtrykket af de 12 formodede reference- gener i hver af disse cellelinier, 1 × 10

5-celler blev dyrket i plader med 6 brønde (NUNC, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Danmark) til en konfluens på 70-90%. Celler blev derefter vasket to gange med sterilt saltvand og totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af NucleoSpin RNAII kit (MACHEREY Nagel, Scientifix Pty Ltd, Clayton, Australien). Til dette blev cellerne lyseret ved tilsætning af lysepuffer direkte på cellerne. RNA-ekstraktion herunder DNase-behandling blev udført ifølge producentens protokol. RNA blev elueret i 60 pi RNase frit vand og RNA-koncentration, målt ved hjælp NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Danmark). Integriteten af ​​RNA-prøver blev bekræftet ved agarosegelelektroforese på 1,0% agarosegel indeholdende GelRed ™ (Biotium, Inc., Hayward, CA, USA). RNA-prøver uden indikation af nedbrydning blev yderligere vurderes RNA 6000 Nano chip ved hjælp af Agilent 2100 elektroforese Bioanalyzer (The Ramaciotti Center for Gene Funktionel analyse, University of New South Wales, Sydney, NSW, Australien).

Reverse Transskription af mRNA

Totalt RNA (1 ug) blev omvendt transskriberet ved hjælp af iScript Reverse transcription Supermix for RT-qPCR (# 170-8840, MMLV-baserede RTase, RNaseH

+, Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Australien) i et totalt volumen på 20 pi i overensstemmelse med producentens anvisninger. Den Supermix indeholdt både oligo dT og tilfældige primere for at opnå et maksimalt antal af cDNA-transkripter. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 25 ° C i 5 minutter for priming, derefter ved 42 ° C i 30 minutter til revers transkription, og endelig ved 85 ° C i 5 minutter til revers transkriptase inaktivering. Den komplementære DNA (cDNA) blev opbevaret ved -20 ° C indtil videre anvendelse.

Udover BioRad, vi medtaget to andre producenter (Takara og Bioline) for at undersøge dens indflydelse på udførelsen af ​​revers transkription. Vi reverse transkriberet total RNA (1 ug) ved seks reverse transskriptioner (Takara og Bioline) som følger: Reaktionsblandingen blev fremstillet ved anvendelse BluePrint ™ 1

st cDNA-syntese kit (# 6115A, MMLV-baserede RTase, RNaseH

+, Takara Bio Inc., Scientifix Pty Ltd, Clayton, Australien) i et totalt volumen på 20 pi indeholdende tilfældige 6 merer, oligo dT eller begge i lige molaritet. Et slutvolumen på 10 pi indeholdende primer, dNTP-blanding og totalt RNA blev inkuberet ved 65 ° C i 5 minutter og straks afkølet. Derefter blev 5 × BluePrint

TM 1

st strand buffer, rekombinant RNase inhibitor og BluePrint

TM RTase blev tilsat til et endeligt volumen på 20 pi. Final revers transkription blev inkuberet ved 30 ° C i 10 minutter, derefter ved 42 ° C i 60 minutter efterfulgt af inaktivering ved 95 ° C i 5 min. Revers transkription under anvendelse af Bioline s Tetro cDNA-syntese kit (# BIO-65.042, MMLV-baserede RTase, RNaseH

+, Bioline (Aust) Pty Ltd, Alexandria, Australien) blev udført som følger: et slutvolumen på 10 pi indeholdende primer ( tilfældige 6 merer eller oligo dT eller begge i lige molaritet), dNTP blanding og RNA blev inkuberet ved 70 ° C i 5 minutter, efterfulgt af tilsætning af 5 × RT puffer og Ribosafe RNase inhibitor op til 20 pi. Endelige reaktionsblanding blev inkuberet ved 45 ° C i 30 minutter og termineret ved 85 ° C i 5 min.

Kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR)

Kvantitativ PCR blev udført på 12 formodede reference- gener . Deres karakteristika, herunder navn, deponeringsnummer, kromosom lokalisering, produkt længde, og den respektive fremad- og reverse primere er opsummeret i tabel 1. Referencetallene gener og primersekvenser (indkøbt fra Sigma-Aldrich Pty. Ltd., Castle Hill, Australien) blev udvalgt baseret på tidligere databaser og på publikationer rapportering stabile genekspressionsprofiler [8], [9], [12] – [15]. Primer sekvenser blev også krydstjekket bruger web-baseret værktøj

i-silico

PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) på det humane genom browser UCSC [16] mod gen og genomiske mål.

ekspressionen af ​​de mest stabile gener blev bestemt i humane cellelinier af normal overfladeepitelet i æggestokkene (n = 2) og af kræft oprindelse, herunder ovarie (n = 9 ), colon (n = 9), bryst (n = 1), livmoderhalskræft (n = 1), livmoderkræft (n = 1) og leukæmi (n = 2).

qPCR blev udført på den Stratagene Mx3005

® (Integrated Sciences Pty. Ltd, Chatswood, Australien) i 96-brønds mikrotiterplader (Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Australien). Optimale reaktionsbetingelser blev opnået med 1 × SsoFast ™ EvaGreen

® Supermix med lav ROX som reference farvestof (Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Australien), 400nM specifik sense-primer, 400 nM specifik antisense-primer, RNase /DNase-frit vand, og cDNA-skabelon (tidligere isolerede og revers-transkriberet RNA med 1 ng /brønd) op til slutvolumen på 10 pi. Amplifikationer blev udført startende med en 30 sek enzymaktivering ved 95 ° C, efterfulgt af 40 cykler af denaturering ved 95 ° C i 5 sekunder, og derefter annealing /forlængelse ved 60 ° C i 30 sek. Ved afslutningen af ​​hver kørsel en smeltekurveanalyse blev udføres fra 65-95 ° C. Alle prøver og negative kontroller blev amplificeret i tre eksemplarer, og den opnåede middelværdi blev derefter anvendt til yderligere analyse. Cyklus af kvantificering (CQ) værdier 35 blev udelukket fra yderligere matematiske beregninger. En “ingen template prøve” (RNA fra revers transkription uden revers transkriptase), og en prøve uden RNA eller cDNA var de negative kontroller.

PCR Efficiency (E)

Sammenlignelighed blev sikret ved at undersøge qPCR effektivitet på alle reference- gener på en tilfældigt udvalgt cellelinie RNA-ekstrakt. At sammenligne RNA transcript niveauer for de 12 formodede reference- gener, blev CQ-værdier genereres direkte på et bestemt tærskel. CQ er defineret som antallet af cykler, der er nødvendige for fluorescenssignalet at nå en bestemt tærskel på påvisning og er derfor omvendt korreleret til indgangen mængden af ​​total RNA [17]. For at sammenligne forskellige qPCR kørsler udført på forskellige dage, plader og kører blev justeret til tærsklen til Cq 0.1. Revers transkriberet cDNA blev fortyndet fra 100 ng til 1 pg af input-RNA før RT i 10 gange fortyndinger for hver henvisning gen i tre eksemplarer. Opnået fluorescenssignaler for endelig RNA-koncentrationen blev plottet og lineær regression blev udført for at identificere den bedste lineære sammenhæng repræsenterer standardkurven. Hældningen af ​​den lineære ligning blev anvendt til at beregne effektiviteten ifølge ligningen E = (10

[- 1 /slope] -1). × 100

Dataanalyse

Raw data, herunder smelte og forstærkning kurver opnået ved MxPro- Mx3000P v4.10 (Integrated Sciences Pty. Ltd, Chatswood, Australien) blev udvundet til Microsoft

® Excel-filer (.xls), gemt som Microsoft

® editor filer (.txt), og derefter læsset til analyse yderligere data ind i open source statistisk programmeringssprog R (https://CRAN.R-project.org/version 2.13.2). For yderligere modellering og analyse af RT-qPCR data, blev R-pakke “qPCR”, der anvendes (https://cran.r-project.org/web/packages/qpcR/index.html). Den Pearson korrelation (r) blev beregnet til at bestemme sammenhængen mellem anvendte algoritmer.

For at sammenligne forskellige algoritmer for udvælgelse af de mest stabile referencepunkter gener, vi anvendte RefFinder (https://www.leonxie.com/referencegene.php), en web-baseret omfattende værktøj. Det bruger den aktuelt tilgængelige algoritmer geNorm [9], Normfinder [8], BestKeeper [10] og komparative ACt metoder [11], og tildeler en passende vægt til en individuel gen og beregner det geometriske gennemsnit for den samlede bestilling af alle reference- gener. Salg

Resultater

Overholdelse af MIQE retningslinjer for oprettelse af reference Gener

Siden deres introduktion i 2009 [5], er forskningsmiljøet kontinuerligt acceptere retningslinjerne MIQE for publikationer og overvejelse af videnskabelige manuskripter hjælp RT-qPCR. For at undersøge accept af MIQE mere detaljeret, vi udførte en litteraturgennemgang af publikationer foreslår et sæt af formodede reference- gener (n≥5) i humane prøver for RT-qPCR. Vi identificerede 37 publikationer fra januar 2009 til April 2012, hvis antal konstant øges hvert år (figur 1A). De fleste af disse studier undersøgte patientprøver (63,2%), efterfulgt af primære og udødelige cellelinjer (31,6%). En mindre del (5,3%) undersøgte vævsprøver og cellelinier sammen. RNA integritet var i de fleste tilfælde (68,4%) undersøgte med to uafhængige metoder såsom spektrofotometri (90,9%) og RIN integritet nummer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA). Mængden af ​​total RNA til revers transkription eller cDNA for qPCR reaktioner blev rapporteret hos 78,9% af alle publikationer. SYBR

® Green (57,9%), et fluorescerende dsDNA bindende farvestof, blev hyppigere anvendt end TaqMan (26,3%), en fluorescens-mærket målspecifik probe. Den qPCR effektivitet for alle de undersøgte reference- gener blev leveret i 68,4% af alle publikationer, men kun 28,9% forudsat detaljer såsom cDNA mængde og fortynding række standard kurver. Endelig har vi undersøgt, hvilke af de kendte algoritmer (geNorm, Normfinder, BestKeeper, sammenlignende ACt) blev anvendt til at identificere de mest stabilt udtrykte reference- gener. GeNorm og Normfinder algoritmer sammen blev brugt i de fleste undersøgelser efterfulgt af geNorm alene og geNorm, Normfinder, og BestKeeper sammen (figur 1B). I betragtning af at alene publikationer udfører RT-qPCR til identifikation stabilt udtrykt referencenumre gener blev inkluderet, viser disse data, at væsentlige oplysninger såsom RNA integritet, mængden af ​​total RNA i reaktionen, qPCR effektivitet, og cDNA beløb mangler i en væsentlig del af disse publikationer.

(A). Linje diagram af alle publikationer (n = 37), der undersøger de mest stabilt udtrykte reference- gener. (B) Procentdel af algoritmer, der anvendes til at identificere pålidelige reference- gener blandt alle publikationer.

kvaliteten og integriteten af ​​RNA-prøver

Total RNA udvundet fra vores sæt cellelinier blev evalueret for kvalitet og integritet. En detaljeret liste over de cellelinier og de respektive oplysninger om RNA beløb, kvalitet og integritet (absorbans nøgletal 260/230 nm og 260/280 nm, RNA integritet nummer RIN, og 28 s /18 s ratio) præsenteres som supplerende data ( tabel S2). Vi fandt, at absorbansen nøgletal, gennemsnit (middelværdi ± standardafvigelse) på hele 25 cellelinier, var 1,97 ± 0,23 (260/230 nm) og 2,11 ± 0,04 (260/280 nm). Vi fandt endvidere, at RIN varierede fra 8.4 til 10, hvilket indikerer en tilstrækkelig total RNA kvalitet. Den RIN algoritmen tildeler en RIN nummer score fra 1 til 10, hvor en værdi på 10 repræsenterer helt intakt RNA og en værdi på 1 repræsenterer nedbrudt RNA. Desuden blev kvaliteten af ​​total RNA bekræftes også af forholdet mellem 28 s /18 s ribosomale RNA, som varierede fra 1.7 til 2.7.

Den mulige tilstedeværelse af kontaminerende DNA (fig S1) i hver qPCR forsøg var undersøgt ved amplifikation plots, smeltekurver og 1% agarosegelelektroforese. Revers transkription negative kontrolreaktioner bekræftede fravær af kontaminerende DNA. Ikke desto mindre var der PCR-amplifikationer i de negative kontroller af

PPIA

,

GUSB

,

RPII

TBP

i en eller to gentagelser med CK-værdier 35. Disse værdier var væsentligt højere end for de prøver, der indeholdt skabelon på 1 ng cDNA, der viser en ubetydelig amplifikation af kontaminerende DNA. Der blev ikke påvist PCR-amplifikationer i negative kontroller for de andre reference- gener. Disse resultater viser, at vores samlede RNA-prøver var af tilstrækkelig kvalitet og stort set fri for forurenende DNA.

qPCR Effektivitet, inden for og mellem Assay Variabilitet

RT-qPCR effektivitet af hver primer sæt bestemtes ved seriefortyndinger af cDNA skabelon fra humane ovarie overfladeepitelet cellelinie HOSE17-1 (tabel 2). Vi anvendte RNA fra et tilfældigt valgt cellelinie i stedet for plasmider, fordi RNA kan forårsage potentielle ikke-ubetydelig variation i revers transkription [18], [19]. Baseret på de opnåede middelværdier CQ-værdier for alle fortyndinger i en logaritmisk fortyndingsrække af cDNA blev en standardkurve genereret. Hældningen, skæringspunktet, qPCR forstærkning effektivitet og korrelationskoefficienter (R

2) af hver primer par blev beregnet ud fra standardkurven (figur S2). Den oprindelige fortynding fra 100 ng til 1 pg af input RNA før RT blev tilpasset på grund af ikke-påviselige amplikoner på det nedre område eller mætning af qPCR reaktioner ved højere cDNA mængder, både at påvirke effektiviteten i

RRN18S

,

RPII

B4GALT6

(tabel 2).

GUSB

viste en optimal lineær fortynding fra 10 pg til 10 ng. PCR effektivitet studeret reference- gener varierede fra 87,1% til 106,6%, hældning fra -3,680 til -3,157, opfange 11,10-27,30 og R

2 0,994-0,999.

For at sikre en stabil RNA afskrift plan blev indflydelsen af ​​teknisk variabilitet, intra- og inter-assay variation undersøgt ved hjælp af tilfældigt udvalgte

HSPCB

på RNA fra SKOV3 celler. Inter-assay variation blev bestemt ved at udføre RT-qPCR med identiske prøver fra fem forskellige dage, afslører en variationskoefficient (CV) på 1,74%. Intra-assay variation var mindre end CV 0,3% under anvendelse af en mængde på 0,5 ng og 2,0% under anvendelse af 5 pg af RNA. Disse data viser, at den tekniske variabilitet er i et acceptabelt interval, og derfor betragtes som ubetydelig.

Anvendelse af passende revers transkriptase Setup

For at undersøge, om oprindelse (producent) af revers transkriptase påvirker kvaliteten af ​​reaktionen fire referencepunkter gener (

SDHA

,

HSPCB

,

GUSB

TBP

) blev udvalgt tilfældigt og qPCR blev udført efter revers transkription. For at definere de samlede resultater af alle fire valgte referencestoffer gener, blev variationer beregnet for Cq og CV værdier (n = 7). Variationen for Cq varierede fra et minimum på 1,14 (

TBP

) til et maksimum på 2,83 (

GUSB

) (figur 2A). Den intra-assay variation inden tre eksemplarer var højest i

SDHA

(CV = 2,51%) og lavest i

GUSB

(CV = 0,04%) (figur 2B). Disse data indikerer, at oprindelsen af ​​den omvendte transkriptase og forskellige primer opsætninger har kun marginal indflydelse i udførelsen af ​​disse fire referencepunkter gener.

(A) Tilfældig 6 mer blev anvendt i 2 og 5, oligo dT primer i 3 og 6, og begge sammen i 1, 4 og 7 (abscisse); CQ på ordinat viser forskelle mellem de testede omvendte forhold transkriptase. (B) Variationskoefficient (CV). RT leverandører angivet med romertal: I) BioRad, II) Takara, og III) Bioline. X-aksen med forskellige RT primere: oligo dT (oligo), tilfældige 6 merer (tilfældige), og begge (begge)

Expression Stabilitet af Candidate reference Gener i humane cellelinjer

for at identificere de mest stabile referencepunkter gener på tværs af de testede normale og cancer cellelinjer, blev udtrykket stabiliteter af reference- gener undersøgt ved at udføre de fem algoritmer (RefFinder, geNorm, BestKeeper, Normfinder, og sammenlignende ACt) og ranking af generne for hver algoritme individuelt. Disse rækker blev opsummerede, med den laveste rang sum repræsenterer mest stabilt udtrykt henvisning genet og den højeste rang sum repræsenterer mindst stabilt udtrykt henvisning gen. På tværs af alle undersøgte cellelinjer (figur 3A) vi identificeret

HSPCB

,

RRN18S

RPS13

som de 3 mest stabilt udtrykte reference- gener.

B4GALT6

var den mindst stabile henvisning gen. I undergruppen for tyktarmskræft cellelinjer

HSPCB

, YWHAZ, og

RPS13

var de 3 mest stabilt udtrykte reference- gener (figur 3B). Desuden i den delmængde af normale og æggestokkene kræft cellelinjer, de respektive gener var

PPIA

,

RPS13

SDHA

(figur 3C).

(A) Alle undersøgte cellelinier (n = 25), (B) coloncancer-cellelinjer (n = 9), og (C) normale og æggestokkene cancercellelinier (n = 11). Numbers fremhæve de første tre mest stabile referencepunkter gener i hver forsøgsopstilling op.

Disse resultater viser, at de mest stabilt udtrykte reference- gener varierer blandt de forskellige celle linje apparater, med kun

RPS13

er til stede i alle tre cellelinje sæt inden for de første 3 top reference- gener. Interessant, de hyppigst anvendte henvisning gen

GAPDH

var blandt de mindst stabilt udtrykt henvisning gen i vores sæt op.

Vi undersøgte yderligere korrelationen blandt de fem anvendte algoritmer, der leverer de mest stabile gener . Sammenhængen mellem alle fem stabilitetstests var moderat til høj blandt anvendte algoritmer. Den højeste korrelation blev observeret mellem Normfinder og den sammenlignende delta Ct metode (r = 0,99) (figur 4), hvilket indikerer, at alle 12 referencenumre gener blev næsten identisk rangeret. Den laveste korrelation (r = 0,71) var mellem delta Ct-metoden og RefFinder, hvilket indikerer en høj uoverensstemmelsen i ranking.

Absolut værdi af Pearson korrelation og

s

-værdi angivet med en asterisk (0 ***, 0,01 **). Bunden af ​​scatter plots visualiserer bivariate korrelation blandt undersøgte stabilitetstests herunder en monteret linje.

Diskussion

Vi 1) foretaget en gennemgang af litteraturen om, hvorvidt MIQE retningslinjer i udførelsen af RT-qPCR forsøg identificerer sæt af reference- gener, 2) vurderede ydeevne algoritmer til rækkefølgen af ​​reference- gener ved deres udtryk stabilitet; og 3) identificeret et sæt af egnede og mest pålidelige referencepunkter gener for vores udvalg af menneskelige kræftceller af forskellig oprindelse.

Vores litteraturgennemgang viste, at overholdelsen af ​​retningslinjerne MIQE var kun delvis. Væsentlige oplysninger [5] såsom RNA integritet, mængden af ​​total RNA i reaktionen, cDNA beløb, fortyndingsområdet for standard kurver, og effektiviteten af ​​qPCR ofte mangler i publikationer, som ikke er i overensstemmelse med de retningslinjer MIQE . Tættest mulige overensstemmelse med de retningslinjer for udførelsen af ​​RT-qPCR samt rapporterer denne information i publikationer bidrager til en forbedring af den eksperimentelle studiedesign og sikrer reproducerbarhed og pålidelighed af undersøgelsens resultater. Ellers kan ubetydelige forskelle påvist i målrettet genekspression være en potentiel resultat af variationer i henvisning genekspression.

Vi har vist, at revers transkriptase leveret af forskellige producenter føre til variationer i kvantificering cyklusser (Cq op til 3). Derfor kan det være nyttigt at overveje forskellige RT’er og afprøve forskellige primersæt, oligo dT eller tilfældige 6 merer eller begge i kombination før virksomhedens eksperimenter. Vores resultater er også i konkordans med tidligere undersøgelser, hvor udskrift udbytter varierede op til 100 gange mellem forskellige revers transkriptase i en gene- afhængig måde [20], [21]. Vi fandt i litteraturen og bekræftet i vores undersøgelse, at forskellige RT priming strategier er afgørende for kvantitativ måling af genekspression [21]. Desuden har vi observeret i vores egne eksperimenter, at ingen RT er overlegen i forhold til andre RT’er og derfor ingen konklusion kunne gøres for valg af RT priming; det er, kan der ikke foretages beslutning om, hvilken primer er bedre end den anden.

Anvendelse af statistiske algoritmer for stabilitets- målinger blev kritisk gennemgået, fordi alle disse algoritmer er baseret på den antagelse, at ingen af ​​de undersøgte reference- generne viser systematisk variation i udtrykket profilen tværs prøverne [22]. Desuden er vores litteraturgennemgang viste, at kun en eller to algoritmer i de fleste undersøgelser er blevet anvendt. Vores undersøgelse viste betydelig variation i sammenhængen mellem de anvendte algoritmer. Endvidere trods den relativt høje korrelation (r = 0,9) mellem geNorm og Normfinder algoritmer, anvendelsen af ​​disse to algoritmer leveret identisk placering i kun 5 ud af de undersøgte 12 reference- gener. Dette giver en mangel, der kan føre til falsk udvalg af reference- gener, som kan have en negativ indvirkning på kvaliteten og pålideligheden af ​​data. Vi anbefaler derfor, at mere end to algoritmer skal anvendes ved udvælgelsen af ​​reference- gener.

Vi har udnyttet tidligere demonstreret og offentliggjort primerpar til påvisning af transkriptniveauer af formodede reference- gener i en pulje af normal og kræft cellelinier. Generelt næsten alle reference- gener udføres i et egnet måde og kan anvendes til fremtidige undersøgelser under anvendelse cellelinjer. Desuden er baseret på resultater på intra- og inter-assay variation alle undersøgte reference- gener kan anvendes til yderligere undersøgelser. Ikke desto mindre, blandt alle de cellelinjer testet fandt vi, at

HSPCB

,

RRN18S

, og

RPS13

er de mest stabilt udtrykte gener tyder deres egnethed som reference- gener for fremtidige undersøgelser inden for denne eksperimentelle oprettet. Undersøgelser på tyktarmen og normal samt ovarie cancer cellelinjer afslørede forventede forskelle mellem udvalgte referencepunkter gener og bør derfor overvejes i fremtidige studier. Den viser, at reference- gener skal udvælges omhyggeligt for hver eksperimentel opsætning.