PLoS ONE: TMPRSS2-ERG Expression Forudsiger Prostata Cancer Survival and Associates med Stromal Biomarkers

Abstrakt

TMPRSS2-ERG gen fusion findes i cirka halvdelen af ​​alle prostatakræft. Den funktionelle og prognostisk betydning TMPRSS2-ERG er imidlertid ikke helt forstået. Baseret på en historisk vågent venter kohorte, blev en forening mellem TMPRSS2-ERG, vurderet som positiv immun farvning, og kortere overlevelse prostata kræftpatienter identificeret. Ekspression af ERG var også forbundet med kliniske markører, såsom fremskreden tumor stadium, høj Gleason score, tilstedeværelse af metastase og prognostisk tumor cellemarkører såsom høj Ki67, pEGFR og Pakt. Hidtil ukendte associationer mellem TMPRSS2-ERG og ændringer i tumor stroma, for eksempel øget vaskulær densitet, hyaluronan og PDGFRβ og faldt caveolin-1, alle kendt for at være forbundet med en aggressiv sygdom, blev fundet. Den foreliggende undersøgelse antyder, at TMPRSS2-ERG fusionsgenet er forbundet med en mere aggressiv prostatakræft fænotype, støttet af ændringer i tumor stroma

Henvisning:. Hägglöf C, Hammarsten P, Strömvall K, Egevad L, Josefsson A, Stattin P, et al. (2014) TMPRSS2-ERG Expression Forudsiger Prostata Cancer Survival and Associates med Stromal Biomarkører. PLoS ONE 9 (2): e86824. doi: 10,1371 /journal.pone.0086824

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: 27. september 2013; Accepteret: 15. december 2013; Publiceret: 5 feb 2014

Copyright: © 2014 Hägglöf et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den svenske Forskningsråd og det svenske Kræftens Bekæmpelse støttet arbejdet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Periodisk genfusion mellem androgen-regulerede gen TMPRSS2 og medlemmer af ETS transskriptionsfaktoren familie, mest almindeligt ERG, er til stede i omkring 50% af prostatacancer sager [1]. Tilstedeværelsen af ​​denne fusionsgenet er en kritisk begivenhed i udviklingen af ​​prostatacancer [2] – [4]. Transgen ekspression af fusionsgenet dog kun resulterer i PIN-læsioner og yderligere genetiske ændringer, såsom tab af PTEN og aktivering af PI3K pathway, er nødvendige for at fremkalde kræft [5] – [8]. Eksperimentelle undersøgelser overudtrykker eller undertrykkende fusionsgenet tyder på, at det fremmer tumorcelleinvasivitet og celleproliferation [1]. Talrige undersøgelser har evalueret sammenslutningen af ​​TMPRSS2-ERG og resultatet af patienter med prostatacancer med varierende resultater [1]. En nylig stor cohort- og metaanalyse viser dog, at fusion gen status er ikke en vigtig indikator for prostatakræft dødelighed eller tilbagefald hos patienter behandlet med radikal prostatektomi [9]. Så vidt vi ved, har kun to studier undersøgte fusion-gener status i forhold til det naturlige forløb af sygdommen i et vågent venter kohorte. I begge undersøgelser tilstedeværelse af TMPRSS2-ERG-fusionen blev forbundet med en øget risiko for prostatakræft død [10], [11].

fusionsgen status bestemmes generelt ved fluorescens in situ hybridisering (FISH). Positive epitel ERG immunfarvning under anvendelse af en nyligt udviklet antistof, er dog stærkt korreleret (95,7% følsomhed og 96,5% specificitet) af tilstedeværelsen af ​​TMPRSS2-ERG fusionsgenet [12] – [15] tyder på, at immunfarvning kunne være en praktisk måde at bestemme tilstedeværelsen af ​​TMPRSS2-ERG fusionsgenet.

Nylige undersøgelser tyder på, at tumor aggressivitet er relateret til ændringer i tumormikromiljøet [16]. I prostatatumorer stroma er ændret i forhold til tumor aggressivitet [17]. Under prostata tumor progression, cancer epitelceller sender signaler til det omgivende stroma, som derved tilpasse sig behovene i den voksende tumor. Tumoren stromaceller igen sender vækstfremmende signaler til epitel [17]. Når forskellige prostatacancerceller inkuberes sammen med normale fibroblaster inducerer de ændringer blandt fibroblasterne, der er tumor-cellelinie specifik [18]. Hvis det sker også

in vivo

det kunne tyde på, at fusion gen positive og negative tumorer kan vise forskelle i tumor stroma. Dette har dog til vores viden aldrig blevet undersøgt. Hvis dette var tilfældet, kunne hjælpe os at identificere de stort set ukendte signaler, der bestemmer udviklingen af ​​en tumor stroma forbundet med aggressiv sygdom.

I denne undersøgelse derfor undersøgt vi et stort historisk kohorte af TURP-diagnosticerede prostatakræft lykkedes af vagtsomme venter af ERG immunfarvning for at undersøge, om ERG farvning blev forbundet med andre tumor egenskaber og langsigtet resultat, og især hvis det er forbundet med forskelle i tumor stroma morfologi.

Resultater

Heterogen udtryk for TMPRSS2-ERG i væv udtaget fra forskellige tumor foci

for at præcisere, hvilken rolle TMPRSS2-ERG i prostatakræft, en TMA indeholder materiale fra 350 prostata kræftpatienter hvoraf 256 blev forvaltet med vågent venter, blev analyseret med ERG immunhistokemi (IHC). TMA indeholdt 5-8 prøver af tumorvæv og 4 prøver af ikke-malignt væv fra forskellige steder i prostata af den samme patient. Nuklear tumor ERG farvning blev observeret i 34% af patienterne. Som tidligere vist, ERG ekspression undertiden varieres, når man sammenligner forskellige tumorfoci fra den samme patient. Heterogen ERG farvning blev observeret i 18% af patienterne. Hos nogle få patienter (6%) cytoplasmatisk ERG udtryk blev fundet i epitelial ikke-maligne væv. Hos alle patienter farvede endotelceller positive for ERG og dette fungerede som en intern positiv kontrol.

TMPRSS2-ERG er forbundet med prognostiske markører

Forholdet mellem TMPRSS2-ERG udtryk for allerede etablerede histologiske og kliniske prognostiske markører blev analyseret. Ekspression af ERG i mindst en tumor kerne var signifikant positivt korreleret med avanceret tumor stadium, høj Gleason score og tilstedeværelsen af ​​metastaser. Derudover blev ERG-ekspression også forbundet med tumor epithelial cellemarkører såsom høj celleproliferation (Ki67) [19], Pakt [20] og pEGFR ekspression [21], der alle vides at være relateret til dårligt resultat (tabel 1 og 2) . Disse eksperimenter antyder, at TMPRSS2-ERG er relateret til faktorer, der vides at angive dårlig prognose for patienter med prostatacancer.

TMPRSS2-ERG korrelerer med kræft specifik overlevelse

For at evaluere den kliniske betydning af TMPRSS2-ERG i denne kohorte af patienter følges med vågent venter, blev overlevelsesanalyse med Kaplan-Meier udført. Analysen viste, at patienter med tumorer, der udtrykker ERG havde en signifikant reduceret overlevelse sammenlignet med patienter med tumorer, der mangler ERG-farvning (Figur 1 A). Desuden tumorer, der udtrykker ERG hos patienter med Gleason score 6 eller 7 tumorer havde signifikant kortere kræft specifik overlevelse end dem med tumorer, der mangler ERG-ekspression (figur 1 B). En forskel i overlevelse mellem grupper med tumorer, der udtrykker ERG blev også set hos patienter med Gleason score 8-10 tumorer (figur 1 C). Tumorer, der udtrykker ERG blev forbundet med en øget relativ risiko for prostatakræft-specifik død i en univariate Cox regressionsanalyse (tabel 3). I multivariat Cox regressionsanalyse herunder den etablerede prognostiske markør Gleason score og lokal tumor stadium, tilstedeværelse af TMPRSS2-ERG i tumoren var signifikant associeret med dårlig prognose og gav yderligere prognostisk information (tabel 4).

Patienter adskilles i to grupper afhængigt af tilstedeværelsen af ​​ERG-ekspression (stiplet linie) eller fravær af ERG-ekspression (optrukket linje) hos alle patienter (A), patienter med Gleason score 6 (B), og patienter med Gleason score 8-10 (C). Vejviser

Når patienterne blev analyseret i 3 grupper, ERG-, ERG + og ERG heterogen (h) i Kaplan Meier plot, ERG- havde den mest gunstige prognose, bedre end ERGh og ERG +, som havde lignende prognose (data ikke vist).

TMPRSS2-ERG er forbundet med stromale ændringer

TMA har tidligere været anvendt til at identificere en række prognostiske markører. Stromale faktorer i prostatakræft, som vi tidligere identificeret som forbundet med overlevelse af patienter med prostatacancer i denne TMA er PDGFRβ [22], hyaluronan [23], caveolin-1 (Scherdin et al, upubliceret) androgen receptor [24], mastceller [ ,,,0],25] og von Willebrand faktor [19]. Interessant nok blev TMPRSS2-ERG fundet at være forbundet med alle disse faktorer, undtagen AR og mastceller. I disse undersøgelser rapporterer vi, at høj stromale ekspression af PDGFRβ og hyaluronan, både i tumoren stroma og i stroma af det omgivende ikke-malignt væv, var forbundet med en dårligt resultat af patienter med prostatacancer. Derudover høj kardensitet (målt som udtryk for von Willebrand faktor) og nedsat tumor stromal ekspression af caveolin-1 var relateret til dårlig prognose. TMPRSS2-ERG blev fundet at associere med disse faktorer på en måde forudsige et dårligt resultat af patienten (høj tumor stromal ekspression af PDGFRβ, hyaluronan, von Willebrand faktor og lav stromal ekspression af caveolin-1) (tabel 5 og 6). Disse resultater viser, at tilstedeværelsen af ​​TMPRSS2-ERG er relateret til stromale fænotyper forbundet med dårlig prognose af patienter med prostatacancer.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, TMPRSS2-ERG viste sig at være associeret med en række kliniske parametre, herunder overlevelse, i en patient kohorte forvaltes med vågent venter. Ud over dette, associationer mellem fusionsgen status og stromale gener, der tidligere blev identificeret som biomarkører med prognostisk information i prostatacancer blev også identificeret.

Aktuelle biomarkører at diagnosticere prostatakræft og forudsige prostatakræft udfald ikke har tilstrækkelig specificitet og følsomhed og genererer problemer med overbehandling og overdetection [26]. Nye og bedre prognostiske markører at sortere ud patienter med behov for prostatakræft behandling er et presserende berettiget. Nytten af ​​TMPRSS2-ERG som prognostisk markør for prostatakræft har været stærkt studeret med forskellige resultater. Det skal dog mere og mere klart, at patienter behandlet med radikal prostatektomi, er TMPRSS2-ERG fusion ikke har en stor indvirkning på resultatet patient [9]. Især alle undersøgelser, at undersøge resultatet efter vågent venter (den naturlige årsag til sygdommen) finder, at TMPRSS2-ERG er forbundet med en dårligt resultat. Prostatacancer er generelt multifokal og i omkring 30% af mænd med prostatakræft deres prostata harbor begge fusionsgen- positive og fusion gen negative tumorer [27], [28]. I sådanne tilfælde er det generelt fusionsgenet positivt fokus, der danner lymfeknudemetastaser og i denne undersøgelse var den forbundet med tilstedeværelsen af ​​knoglemetastaser ved diagnose [27]. Hypotetisk, tilstedeværelse af fusionsgenet giver en mere aggressiv cancer kun når patienter ikke behandles, eventuelt siden tumoren behøver tid til at erhverve yderligere genetiske ændringer, såsom tab af PTEN [7], at være i stand til at danne makroskopiske metastaser.

Tissue materialer genereret med TURP kan indeholde en overrepræsentation af overgangszone tumorer og da prostatakræft stammer fra overgangszonen er kendt for at være biologisk forskellige fra perifere zone tumorer dette kunne påvirke effekten af ​​ERG overekspression [29], [30 ]. Den lavere frekvens af TMPRSS2-ERG i den foreliggende undersøgelse (34%) sammenlignet med ca. 50% i radikal prostatektomi kohorter kan også forklares af patienten kohorte (fusionsgenet sjældnere hos overgangszone tumorer) og er i overensstemmelse med hvad andre har set i TURP materialer [9].

fund, at ekspression af fusions-gen TMPRSS2-ERG i epitelceller er relateret til stromale ændringer er hidtil ukendt og interessant. Tumoren mikromiljø, som er formet af tovejskommunikation mellem kræft epitelceller og deres omgivende stroma, er involveret i alle stadier af kræft progression, holder prognostisk information og påvirke respons på behandling [31] – [33]. Interessant og i overensstemmelse med de foreliggende fund i prostatacancer, forskellige brystcancer undertyper, baseret på deres ekspression af estrogen- progesteron-og Her2-receptorer i epithelet, giver anledning til stromaceller med forskellige genekspressionsmønstre og variabel evne til at understøtte cancercelle migration [34]. Alle de stromale ændringer, der blev fundet at associere med epitelial ERG udtryk er relateret til mere aggressiv kræft. Lav stromale caveolin-1 korrelerer med reduceret tilbagefald overlevelse i prostata cancer patienter og Akt aktivering [35]. Tilsvarende forøgede niveauer af PDGFRβ og Hyaluronan i prostata tumor stroma og omgivende ikke-maligne stroma associerede med dårligt resultat af prostatacancerpatienter og injektion af hyaluronan i prostata øge prostatakræft vækst i et ortotopisk rottemodel [22], [23]. Angiogenese er kritisk for udviklingen af ​​prostatacancer, og tilstedeværelsen af ​​fusionsgenet var forbundet med øget vaskulær tæthed. For yderligere at undersøge, om og på hvilken måde celler, der udtrykker TMPRSS2-ERG fusion gen er i stand til at ændre tumor mikromiljø og gøre det mere gæstfri til tumorcellerne, ville tilføje vigtige oplysninger om, hvordan TMPRSS2-ERG bidrager til prostatakræft biologi. Navnlig er der også ændringer i tumorstroma relateret til tumor aggressivitet (f.eks nedsat androgen receptorekspression og mast celletal), der tilsyneladende ikke er relateret til epitel ERG status. Celler, der bærer fusionsgenet er kendt for at have en specifik genekspression mønster [36], og det kan være muligt at finde nøglefaktorer ændring af stroma i et tumorfremmende måde, en effekt, der tilsyneladende tilføjer aggressivitet til tumorer af alle Gleason kvaliteter.

konklusioner

i denne kohorte blev TMPRSS2-ERG fundet at associere med en række kliniske parametre, herunder overlevelse, relateret til dårligt resultat. Dette bekræfter tidligere resultater, som viser, at tilstedeværelsen af ​​fusionsgenet giver en mere aggressiv sygdom i patienter ikke behandles. Desuden har denne undersøgelse identificerede sammenhænge mellem TMPRSS2-ERG og stromale ændringer, der tidligere er identificeret som biomarkører forudsiger en dårligere prognose af patienter med prostatacancer. Dette kunne tyde på, at den mere aggressive fænotype, der opstår med tilstedeværelsen af ​​TMPRSS2-ERG mindste delvist er forårsaget af ændringer i tumor stroma.

Materialer og metoder Salg

Tissue microarray

Vævsprøver blev indsamlet fra patienter, der undergik transuretral resektion af prostata (TURP) på hospitalet i Västerås, Sverige, mellem 1975 og 1991. prostatakræft blev opdaget af histologisk analyse. Median alder på tidspunktet for diagnosen var 74 år (spændvidde 51-95 år). Oplysninger om tilstedeværelsen af ​​benign prostata hyperplasi var ikke tilgængelig. Vævsprøver blev formalin-fikseret, paraffin-indlejret og nedklassificeret i henhold til Gleason-systemet af en patolog i overensstemmelse med ISUP anbefalinger [37]. Vævsprøverne blev anvendt til at konstruere et væv micro array (TMA) under anvendelse af en Beecher Instrument (Sun Prairie, WI, USA). Kanterne af væv fragmenter blev undgås for at forhindre effekter fra kemikalier og kirurgiske anordninger, der anvendes under TURP procedure. TMA: s indeholdt 5-8 prøver af tumorvæv repræsenterer både den primære og sekundære Gleason kvalitet og 4 prøver af ikke-malignt væv fra hver patient. Patienterne havde ikke modtaget anti-cancer terapi før TURP. Radionuklid knoglescanning blev opnået efter diagnose til påvisning af metastaser. 350 patienter blev inkluderet i undersøgelsen, hvoraf 256 patienter blev fulgt med vågent venter efter TURP. Ved symptomer fra metastaser patienter fik palliativ behandling med androgen ablation og i et par tilfælde strålebehandling eller østrogenbehandling, ifølge terapi traditioner i Sverige i løbet af denne tid. Desuden blev 94 patienter, der blev behandlet med palliativ behandling umiddelbart efter diagnosticering inkluderet i analysen. Behandlede patienter blev ikke medtaget i overlevelse analyse. Den mediane samlede overlevelse for patientgruppen fulgte med vagtsomme venter blev 5,9 år. 80 af vævsprøverne blev gradueret som Gleason score 4-5, 71 patienter som Gleason score 6, 44 patienter havde Gleason score 7, og 61 patienter Gleason score 8-10. 1 patient (0,4%) med Gleason score 7, og 8 patienter (3,1%) med Gleason score 8-10 havde knoglemetastaser ved diagnose. I august 2003 26 patienter (10,2%) var stadig i live, 65 patienter (25,4%) var døde af prostatakræft og 165 patienter (64,5%) var døde af andre årsager.

Faktorer af potentiel prognostisk betydning, såsom som Gleason score, tumor volumen, tumor fase, tumor celle Ki67, Pakt og Perg udtryk samt stromale faktorer som androgen receptor, mastceller, PDGFRβ, hyaluronan havde caveolin-1 og von Willebrand-faktor allerede blevet analyseret i materialet og kunne anvendes i nærværende undersøgelse (for referencer se ovenfor).

Etik erklæring

materialet blev indsamlet efter svenske regler på et tidspunkt, hvor informeret samtykke ikke var påkrævet. Forskningen etiske komité på Umeå Universitetshospital (Regional Etisk Review Board i Umeå), godkendt af undersøgelsen og frafaldes behovet for samtykke.

Immunhistokemi

Vævssnit blev afparaffineres og rehydreret i xylen, 99 % ethanol, 96% ethanol, 70% ethanol (3 x 5 min i meget trin) og derefter vasket i destilleret vand. Antigenet blev hentet i Tris /EDTA (pH 9) i 1 time i en trykkoger. Sektionerne blev derefter efterladt til afkøling i 5 minutter i et vandbad inden vask i første destilleret vand og derefter TBS i 20 min. Resten af ​​den immunhistokemiske procedure blev udført i en intelliPATH FLX instrument (Biocare Medical, Concord, CA, USA) i overensstemmelse med fabrikantens instruktioner. ERG-antistof (CM421A, Biocare Medical) blev fortyndet i Renoir Rød (1:50). MACH 3 Mouse HRP-Polymer (Biocare Medical) blev anvendt til detektion. I korrelationsanalysen blev prøverne scoret som positive for TMPRSS2-ERG hvis farvning blev påvist i det mindste en af ​​de tumor kerner.

Statistik Salg

Korrelationer mellem nominelle variable og kontinuerlige variabler blev analyseret under anvendelse Kendall tau b korrelation test. Data anvendt i korrelationsanalysen blev opsamlet på tidspunktet for prostatakræft diagnose. Patienter inkluderet i overlevelse analyser med Kaplan-Meier og Cox regression blev fulgt med vagtsomme venter. Varigheden af ​​begivenhed overlevelse (EFS) er defineret som tiden fra TURP indtil datoen for prostatakræft død, død andre årsager, eller hvis der ikke døden indtraf, indtil datoen for den sidste opfølgning. Forskelle i resultat mellem grupper blev testet med log-rank test. Den prognostiske relevans af TMPRSS2-ERG immunoreaktivitet blev undersøgt af Cox regressionsanalyse alene og sammen med Gleason score og og lokal tumor stadie. Niveauet af statistisk signifikans blev defineret som

P

0,05 (to-sidet). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 21.0.0 software til OS X (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

anerkendelser

Forfatterne takker Pernilla Andersson og Birgitta Ekblom ved Institut for Medicinsk Biosciences, Umeå Universitet for dygtige teknisk bistand.