PLoS ONE: Effekten af ​​lungekræft på Cytokine Expression i perifere mononukleare Cells

Abstrakt

Formålet med denne undersøgelse er at evaluere cytokin udtryk ved mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) fra trin I lungekræftpatienter og at bekræfte disse ekspressionsmønstre ved at udsætte PBMC’er til lungekræft celler

in vitro

. Fem ændrede cytokiner i trin I lungekræftpatienter (CCL3, IL8, IL1β, CXCL10, sIL2Rα) blev fundet i plasma fra individer (n = 15) før og efter resektion anvendelse af en 30-plex panel proteinanalyse. Genekspressionsstudier under anvendelse kvantitativ RT-qPCR udførtes på PBMC’er fra trin I lungekræftpatienter (n = 62) før og efter resektion, og sammenlignet med patienter uden cancer (n = 32) før og efter kirurgi for benign sygdom. Co-kultur eksperimenter, der udsatte rask donor PBMC’er lungekræft celler

in vitro

blev udført for at vurdere effekten på PBMC cytokin udtryk. PBMC genekspression af CCL3, IL8 og IL1β var højere i lungekræft patienter sammenlignet med de samme patienter ved hver af fire sekventielle tidspunkter efter fjernelse af deres tumorer, mens CXCL10 og IL2Rα væsentlige var uændret. Dette mønster blev også påvist, når lungekræft patienter blev sammenlignet med patienter uden cancer. Når ikke-cancerpatienter blev opereret for benigne sygdomme, disse cytokinekspression ændringer var ikke påviselig. Lung cancer cellelinjer, men ikke godartede bronkiale epitelceller, inducerede lignende ændringer i cytokin gen og protein-ekspression ved rask donor PBMC’er i en

in vitro

co-kultur-systemet. Vi konkluderer, at PBMC’er fra trin I lungekræftpatienter besidder distinkte cytokin ekspressionsmønstre i forhold til både patienter ikke-cancer, og lungekræft patienter efter tumor fjernelse. Disse ekspressionsmønstre replikeres af sunde donor PBMC’er udsat for lungekræft-cellelinjer, men ikke godartede bronchiale epitelceller

in vitro

. Disse resultater har betydning for forståelsen af ​​immunrespons på lungekræft

Henvisning:. Chang DH, Rutledge JR, Patel AA, Heerdt BG, Augenlicht LH, Korst RJ (2013) Effekten af ​​lungekræft på Cytokine Expression i perifere mononucleære blodceller. PLoS ONE 8 (6): e64456. doi: 10,1371 /journal.pone.0064456

Redaktør: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 12. oktober 2012; Accepteret: April 15, 2013; Udgivet: 6 Juni 2013

Copyright: © 2013 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Valley Hospital Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA, og forventes at tegne sig for flere dødsfald i 2012 end colorectal, bryst og prostatakræft kombineret [1]. Selvom lungekræft er blevet anset for at være et dårligt immunogen malignitet, adskillige former for evidens tyder på en indflydelse af værtens immunsystem i ændring lungekræft udvikling og progression. Disse omfatter rapporter om forbedret overlevelse hos patienter med lungecancer med postoperative infektioner [2], øget tilbagefaldsrater blandt patienter, der modtager perioperative blodtransfusioner [3], [4], og højere incidensrater blandt immunsupprimerede individer som dem, der testes positive for human Immunodeficiency virus (HIV) [5]. På trods af disse observationer, er fortsat uklar rolle værtens immunsystem i udviklingen og progressionen af ​​lungekræft.

Cytokiner og chemokiner (kemotaktiske cytokiner) er vigtige endogene regulatorer af immunsystemet og udskilles af immunceller, samt ved tumor. I kræftpatient, disse molekyler har forskelligartede og komplekse roller i funktion og handel med immun- og andre celler, herunder endoteliale stamceller [6]. Cytokin og kemokin netværk kan også være “kapret” af kræftceller til at give et gunstigt miljø for tumorvækst [6], [7].

I betragtning af den uklare rolle antitumor immunitet i patienter med lungecancer, kombineret med globale betydning cytokiner og chemokiner til immunresponset, vi den hypotese, at lungekræft vil have specifikke virkninger på cytokin /chemokin ekspression og sekretion af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC). I denne henseende er formålet med den foreliggende undersøgelse er tredobbelt. Først, for at bestemme, om patienter med trin I lungekræft udviser ændret cytokinekspression i cirkulerende plasma og PBMC’er før potentiel kurativ resektion, sammenlignet med efter resektion, og identificere differentielt udtrykte cytokiner. For det andet, at bekræfte denne differentielle ekspression i PBMC’er opnået fra en større gruppe af trin I lungekræftpatienter, og sammenligne disse resultater til en kohorte af patienter, der gennemgår thoraxkirurgi for benigne sygdomme. For det tredje, at afgøre, om denne forskel cytokin udtryk udløses, når rask donor PBMC’er udsættes for lungekræft celler

in vitro

.

Materialer og metoder

Patient Befolkning

Denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af The Valley Hospital Institutional Review Board og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere. To grupper af patienter blev undersøgt. Den lungekræft patientgruppe inkluderet individer gennemgår helbredende pulmonal lobectomy og mediastinale lymfeknuder dissektion, med stadium I status bekræftet patologisk. Kontrolgruppen patientgruppe inkluderet ikke-kræftpatienter i thoraxkirurgi for benigne tilstande, såsom spontan pneumothorax, diagnostisk resektion af en godartet lungeknude, bulløs lungesygdom, bronchiectasis, mediastinale /pulmonale cyster, og hiatal hernia.

Patienter blev udelukket fra undersøgelsen, hvis de modtog kronisk steroid terapi, findes at have avancerede lungekræft (fase II, III, IV) patologisk efter resektion, havde andre andre end ikke-melanom hudkræft samtidige kræftformer, krævede adjuvans eller neoadjuverende kemoterapi , strålebehandling eller begge dele, eller havde en fortid med HIV-infektion, hepatitis B eller C eller andre immunosuppressive eller myeloproliferative sygdomme. Kontrol patienter blev ekskluderet, hvis de undergår thoraxkirurgi for inflammatoriske /infektiøse tilstande (empyem, interstitiel lungesygdom, eller aktiv pneumonitis) eller havde en fortid med andre former for kræft.

Præoperative blodprøver blev indsamlet under en to uge vindue før operation, hvorimod postoperative prøver blev opnået ved 3 (2-4 måneder), 6 (5-7 måneder), 9 (8-10 måneder) og 12 (11-13 måneder) efter kirurgi, medmindre andet er angivet.

Blood Prøvetagning og Processing

Lungekræft og kontrollere patientens blod blev tegnet af perifer venepunktur i BD Vacutainer CPT Cell Forberedelse Rør med Natrium Heparin (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Blod forarbejdningen foregik ifølge fabrikantens protokol. PBMC-pellets blev høstet og opbevaret ved -80 ° C i RNA-ekstraktion og efterfølgende assays. Plasma blev også gemmes og opbevares ved -80 ° C.

Sunde donor blod leukocytter (buffy coat), der anvendes i

in vitro

eksperimenter blev købt fra EF-Blood Services (Paramus, NJ) . Disse PBMC’er blev fremstillet ved centrifugering af blod på Ficoll-Paque PLUS densitetsgradient-medium (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) i 30 minutter ved 805 ×

g

RCF (relativ centrifugalkraft) ved stuetemperatur. Isolerede PBMC’er blev hentet og vasket to gange i PBS ved centrifugering i 15 og 10 minutter ved 453 ×

g

ved 4 ° C. Isolerede PBMC’er blev derefter anvendt til

in vitro

co-kultur assays.

Luminex assay

Luminex-assayet er en multiplex bead-baseret immunassay, som giver mulighed for den samtidige måling af flere analytter (f.eks cytokiner) under anvendelse af et bibliotek af antistof-koblede farvekodede perler (kaldet mikrokugler). For den indledende screening af plasmaproteiner, blev plasma opsamlet fra 15 trin I lungekræftpatienter præoperativt og 3-7 måneder postoperativt. Plasmaprøver blev derefter analyseret ved anvendelse af cytokin human 30-plex Panel, LHC6003, (Luminex platform; Life Technologies, Carlsbad, CA). Assays blev udført i overensstemmelse med producentens protokol med den undtagelse, at prøver, perler og puffer blev inkuberet natten over ved 4 ° C. Reaktioner blev udført ved anvendelse af Luminex 100 instrument (Luminex, Austin, TX), Standardkurver blev dannet, og data blev opsamlet og analyseret under anvendelse Luminex 100 Integrated Software version 2.3. Supernatanter fra

in vitro

co-kultur eksperimenter blev også vurderet ved anvendelse Luminex-assayet ifølge protokollen beskrevet ovenfor. For oprindelige undersøgelser plasma screening blev relative proteinniveauer udtrykt ved at beregne forholdet mellem den gennemsnitlige gange ændring i proteinekspression (præoperativt til postoperativt), og omdanne værdierne til log

2 skala. Patienter med mindst ét ​​datapunkt udstiller udtryk over Luminex minimal afsløring niveau indgik i forholdet beregninger.

PBMC Gene Expression Database

genekspression i PBMC seks lungekræfttilfælde, før og 2-5 måneder efter kurativ resektion blev opnået ved anvendelse Affymetrix U133 + 2,0 mikroarrays, anvendelse af RNA isoleret fra PBMC cellelysater i modsætning til plasmaprøver. Dette arbejde er tidligere blevet beskrevet [8]. Hybridiseringsbetingelser intensiteter blev anvendt til at beregne fold forskelle mellem præoperative og postoperative prøver.

RNA-ekstraktion og kvalitetsvurdering

RNA blev ekstraheret fra PBMC lysater under anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Valencia, CA) ifølge til fabrikantens protokol med de følgende modifikationer. Frosne PBMC pellets blev lyseret direkte i RLT-buffer for at minimere RNA-nedbrydning. Cellelysater blev ledt gennem QIAshredder (Qiagen) inden efterfølgende oprensning som beskrevet i protokollen. Ribonculease-fri DNase (Qiagen) blev anvendt under på søjle fordøjelse af DNA for at minimere forekomsten af ​​resterende genomisk DNA.

RNA kvalitet og koncentration blev vurderet ved hjælp af RNA Nano chips med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og analyseret under anvendelse af 2100 Expert Software (Agilent). RIN (RNA Integrity Number) for det ekstraherede RNA var i intervallet mellem 7,0 og 10,0 med gennemsnittet af 8,8 ± 0,68 for alle RNA-prøver anvendt i denne undersøgelse.

Real-time kvantitativ Reverse Transcription PCR (RT -qPCR)

blev udført RT-qPCR forsøg ved hjælp af 7500 Real Time PCR instrument fra Applied Biosystems (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Alle materialer og protokoller blev opnået fra Applied Biosystems. Primer og probe sæt (tabel S1) blev designet ved hjælp Primer Express Software (Applied Biosystems) efter standard sæt af design kriterier fastsat af softwaren. Indstiller spændte en intron og bro en exon-exon junction og blev gjort til specifikation af enten Applied Biosystems eller Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Primere og prober blev testet empirisk for fravær af interferens inden den anvendes til multipleksning. Den normaliserende kontrol anvendes til alle RT-qPCR forsøg var β-Actin (gen symbol ACTB), som blev anvendt som reference genet for alle beregninger. RT-qPCR multiplex analyser, der består af tre til fire sæt primere og prober (herunder, at der for ACTB.) Blev udført [9].

RT-reaktionen blev udført med 2 ug RNA per reaktion ved hjælp af High Capacity-RNA til cDNA kit (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Kvantitativ PCR-reaktion blev udført under anvendelse af 30 ng cDNA i tre eksemplarer. Fold ændre beregninger blev udført ved hjælp af “komparative C (T) metoden” fastlagt af producenten [10]. C (T), tærskel cyklus, er også nævnt som Cq (Kvantificering cyklus) værdi. Til beregning, blev gennemsnittet af de tredobbelte CQ værdier anvendes til analyse. CQ-værdier blev normaliseret til dem, for ACTB.

Cell Kultur og

in vitro

Co-kultur Experiment

A549 og HCC827 humane lungecancer cellelinier blev købt fra ATCC ( Manassas, VA). A549-celler blev dyrket i F12K-medium, HCC827 celler i RPMI. Begge dyrkningsmedier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum, 0,028% HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre), 0,02% natriumpyruvat, 0,02% penicillin /streptomycin og 0,004% Gentamicin. Alle reagenser anvendt til celledyrkning blev indkøbt fra Life Technologies (Carlsbad, CA). De primære humane bronkiale epitelceller (NHBE), svarende BEBM dyrkningsmedium (suppleret med BEGM bullet-kit), og reagenser blev indkøbt fra Lonza (Allendale, NJ). NHBE kultur og subkultur blev udført ifølge leverandørens protokol (Lonza). Cellekulturer blev holdt ved 37 ° C med 5% CO

2.

A549, blev HCC927 og NHBE-celler dyrket i to dage i 3 ml medium i 35 mm (6 brønde) retter (BD Biosciences , Franklin Lakes, NJ) til 80-90% sammenløb. Efter to dage blev 0,4 um transwell inserts (Corning Corp, Corning, NY) anbragt i brøndene og 5 × 10

6 af sunde donor-PBMC’er, suspenderet i 3 ml tilsvarende cellekulturmedium blev tilsat til hver transwell . Co-kultur kontroller bestod af brønde indeholdende eneste komplette cellekulturmedier (F12K, RPMI eller BEBM, suppleret som beskrevet ovenfor) uden de maligne eller benigne epitelceller. Co-kulturer blev derefter inkuberet i 6 og 18 timer. Efter inkubation blev cellekultursupernatanter opsamlet, centrifugeret (453 x

g

RCF, 4 ° C, 15 min), og alikvoter opbevares ved -80 ° C i Luminex-assay. Til genekspression analyse blev Transwell inserts fjernes og PBMC’er straks lyseret

in situ

hjælp RLT-buffer (RNeasy kit, Qiagen) og enten opbevaret ved -80 ° C eller anvendt umiddelbart til RNA-ekstraktion for RT-qPCR. Til flowcytometrisk analyse af proteinekspression, 10 timer efter tilsætning PBMC’er til Transwell inserts blev 1 pl /ml Golgi-Plug /Brefeldin A (BD Biosciences) tilsat for at inhibere protein transport. PMA (phorbol-12-myristat-13-acetat, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev tilsat til udvalgte brønde som en positiv kontrol på samme tid med GolgiPlug. Efter flere 8 timers inkubation blev PBMC’er høstet og brugt til flowcytometri til at opdage intracellulære cytokiner.

flowcytometri

For at definere PBMC cellepopulationer blev patient blod trukket ind BD Vacutainer Plus Plastic K

2EDTA på samme tid, det blev indsamlet til RNA ekstraktion. Immuncellepopulationer var præget af flowcytometri følge de standardprocedurer, der er fastsat af The Valley Hospital Klinisk Patologi Laboratory. Flowcytometri blev udført under anvendelse af en Beckman Coulter Cytomics FC500 og CXP cytometer software. Dataanalyse blev udført ved hjælp af Kaluza software fra Beckman Coulter. Reagenserne til flowcytometri blev indkøbt fra forskellige kilder: Anti-human-CD11-PECF594, anti-human-IL8-PE, anti-human-CD14-FITC og anti-human-IL1β-PE fra BD Biosciences; anti-human-CD8-PE-Cy5, anti-human-CD56-PE-Cy7, og anti-human-CCL3-PE fra eBioscience (San Diego, CA); anti-human-CD3-ECD og anti-human-CD45-PE-Cy7 fra Beckman Coulter (Brea, CA); anti-humant-CD4-FITC og anti-human-CD19-PE-Cy5 fra Dako (Carpinteria, CA).

I

in vitro

co-kultur eksperimenter, intracellulær cytokin-farvning var udført efter Cytofix /Cytoperm protokollen fra BD Biosciences. Kort fortalt blev PBMC’er fra co-kultur eksperimenter høstet, vasket og farvet for celleoverflademarkører. Efter overfladefarvning blev cellerne vasket, fikseret med Cytofix /Cytoperm og farvet for intracellulært CCL3, IL8, og IL1β. Efter farvning blev cellerne vasket igen før analyserne.

Statistical Analysis

Forskelle i gennemsnitlige ekspressionsniveauer mellem kræftpatienter og kontrolpatienter og ændringer i gennemsnitlige ekspressionsniveauer i løbet af tiden var evalueret samtidig anvendelse af gentagne målinger af variansanalyse (ANOVA). Denne type af ANOVA står for den samtidige virkning af begge faktorer på ekspressionen [11]. Sammenligningen af ​​kræftpatienter og kontrolpatienter evaluerer det væsentlige virkningen af ​​tumor tilstedeværelse på ekspressionsniveauer, mens vurderingen af ​​ekspression som en funktion af tiden evaluerer den virkning, undergår en kirurgisk procedure havde på hver patient i undersøgelsen.

p-værdier ≤0.05 blev anset statistisk signifikant. IBM-SPSS Statistics-software (version 19) blev anvendt til alle statistiske analyser.

Resultater

indledende analyse af plasma fra Stage I lungekræftpatienter for cytokinprotein Niveauer

Til vurdere, om cytokiner og chemokiner differentielt blev udtrykt i plasmaet fra trin i lungecancerpatienter (n = 15) før og efter (3-7 måneder postoperativt) kurativ resektion en human multiplex immunoassay blev anvendt, og resultaterne er vist i tabel 1. af de oprindelige 30 immune cytokin /chemokin /vækstfaktor mål analyseret ved Luminex, niveauer af 21 mål lå over detektionsgrænsen i lungen kræftpatienters plasmaprøver (tabel 1), mens ekspressionsniveauer af 9 mål (tumornekrosefaktor alfa, IL2, IL4, IL5, IL10, IL13, IL17, granulocyt-makrofag-kolonistimulerende faktor, interferon gamma) lå under detektionsgrænsen i både den præoperative og postoperative prøver (data ikke vist).

Identifikation af 5 gener til yderligere undersøgelse

for at underbygge de første resultater for de 21 targets identificeret af Luminex analysen, og at hjælpe med at definere mål for yderligere undersøgelse, vi afhørt en microarray database tidligere dannet i vores laboratorium, der sammenligner mønstre af genekspression i PBMC’er opnået fra patienter trin i lungekræft før og efter kurativ resektion. Svarende til Protein Data, genekspression for størstedelen af ​​disse 21 cytokiner var højere før kurativ resektion af trin I lungekræft, sammenlignet med efter resektion (tabel 1).

Fem cytokiner blev udvalgt til yderligere undersøgelse af undersøge de indledende screening plasma protein data og database microarray (mRNA) parallelt med fokus på mål, der var betydeligt op /nedreguleret (p /= 0,05). Som vist i tabel 1, af de fire cytokiner (proteiner), som blev påvist i plasma på højeste niveau

før

at iscenesætte jeg lungekræft resektion (CCL3 (Chemokin med CC motiv ligand 3), IL8 (Interleukin 8), IL6 (Interleukin 6), IL1β (Interleukin 1 beta)), tre blev bekræftet af PBMC genekspression data fra microarray database (

CCL3, IL8, IL1β

) på mRNA niveau. Tilsvarende de to cytokiner (proteiner), som blev fundet på de laveste niveauer

før

at iscenesætte jeg lungekræft resektion (CXCL10 og opløselig IL2Rα) blev begge bekræftet af PBMC genekspression data fra microarray database. Figur S1 grafisk viser de opsummerede screening plasma protein resultater og PBMC mRNA database resultater for de 5 gener udvalgt til yderligere undersøgelse:.

CCL3, IL8, IL1β, CXCL10,

IL2Rα

bekræftelse ved RT-qPCR af differentielt udtrykte Cytokiner efter resektion af fase i lungekræft

for at validere og udvide de opnåede resultater fra de indledende Luminex og microarray data, blev PBMC genekspression evalueret i meget større grupper af trin i lungekræftpatienter (n = 62) og kontrolpatienter undergår thoraxkirurgi for benigne sygdomme (n = 32). Demografiske funktioner i disse to grupper af patienter er vist i tabel S2.The fem udvalgte målgener,

CCL3, IL8, IL1β, CXCL10,

IL2Rα,

blev yderligere undersøgt af real- time RT-qPCR assay. Af de 62 patienter i lungekræft kohorte, som gennemgik tapning før resektion, 58 havde blod udtages til analyse i den postoperative periode, som gjorde 16 af de kontrol- patienterne 32. Figur 1 viser den relative udvikling i udtryk påvist for de 5 gener under den postoperative periode for lungekræft og kontrolpatienter. Interessant, at PBMC genekspression for de tre cytokiner (

CCL3, IL8, IL1β

) påvist i plasma på et højt niveau

før

lungekræft resektion under den indledende screening blev fundet blive nedreguleret

efter

lungekræft resektion på alle tidspunkter. Yderligere blev det samme mønster ikke påvist i kontrol- patienter, der gennemgår thoraxkirurgi for godartede sygdomme. Endelig PBMC genekspression for de 2 cytokiner (

CXCL10, IL2Rα

), som ikke blev påvist i plasma på et højt niveau

før

lungekræft resektion under den indledende screening ikke var signifikant forskellige

efter

resektion (figur 1). Efter en analyse af disse data ved hjælp af gentagne målinger ANOVA, bliver det klart, at

IL8

og

IL1β

udtryk er signifikant nedreguleret efter resektion af fase I lungekræft, en konstatering, som ikke er forbundet med den virkning, af thoraxkirurgi hos patienter uden kræft.

CCL3

synes også at nedreguleres på en lignende måde, for så vidt som den nærmer statistisk signifikans (figur 2). Yderligere, flowcytometri af PBMC’er viser en ensartet population af lymfocyt undertyper tværs af alle patientkohorter, hvilket antyder, at ændringer i genekspression ikke synes at skyldes forskelle i celle repræsentation i PBMC lymfocytpopulationer, selv om disse data ikke eliminere muligheden for subtile forskydninger i subpopulationer (figur S2).

Genekspression i 5 udvalgte cytokiner i PBMC’er fra trin i lungecancer (lukkede cirkler) og patienter ikke-cancer kontrol (åbne cirkler) efter operationen er påvist. Hver postoperative punkt repræsenterer middelværdien (+/- SEM) fold ændring i ekspression på det udpegede postoperativ tidspunkterne forhold til den præoperative niveau, udtrykt i log

2 skala. Præoperative værdier (preop) er vist som nul som reference. Ændringer mindre end nul repræsenterer nedregulering efter operationen. For kræftpatienter, antallet af prøver, der anvendes i beregningerne er: Preop: n = 58; 3 måneder: n = 48; 6 måneder: n = 43; 9 måneder: n = 40; 12 måneder: n = 40. For kontrolpatienterne, antallet af prøver, der anvendes i beregningerne er: Preop: n = 16; 3 måneder: n = 11; 6 måneder: n = 9; 9 måneder: n = 6; 12 måneder: n = 7.

A gentagne målinger variansanalyse blev anvendt til at isolere virkningen af ​​tilstedeværelsen eller fraværet af lungecancer på ekspressionen af ​​

CCL3

(p = 0,07),

IL8

(p = 0,01),

IL1β

(p = 0,004),

CXCL10

(p = 0,4) og

IL2Rα

( p = 0,69). Hver søjle repræsenterer middelværdien (+/- SEM) i forhold fold ændring for hver cytokin inkorporerer alle postoperative data i forhold til udtryk før operationen, udtrykt i log

2 skala. En negativ relativ fold ændring indikerer nedregulering efter fase I lungekræft resektion.

Angivelse af

CCL3, IL8

IL1β

er højere i PBMC’er fra fase I Lung kræftpatienter sammenlignet med patienter uden lungekræft

for at afgøre, om PBMC’er fra fase i lungekræftpatienter har højere ekspressionsniveauer af

CCL3, IL8

IL1β

end patienter uden lunge cancer, blev RT-qPCR resultater fra de præoperative PBMC prøver fra trin i lungecancer (n = 62) og kontrol-kohorter (n = 32) sammenlignet. Som vist i figur 3, den betyde udtryk i patienter med lungecancer var signifikant højere i forhold til kontrol for

CCL3

IL1β Hotel (10 og 29 gange, henholdsvis). Selvom det ikke er statistisk signifikant, betyder udtryk for

IL8

var 6 gange højere i de lungekræftpatienter i forhold til kontrol. I modsætning hertil selvom statistisk signifikant,

IL2Rα

udtryk var kun 2 gange højere hos patienter de lungekræftpatienter, mens

CXCL10

udtryk var stort set uændret. Vigtigere er det, at tre og tolv måneder efter operationen, ekspressionsniveauerne synes at udligne mellem kræft og kontrol kohorter (Figur 3).

A. Præoperativ PBMC genekspression i trin I lungekræftpatienter (n = 62) sammenlignet med ikke-cancerpatienter ny skal foretages thoraxkirurgi for benign sygdom (n = 32).

CCL3

: p = 0,003;

IL8

: p = 0,23;

IL1β

: p = 0,05;

CXCL10

: p = 0,55;

IL2Rα

: p = 0,01. B. Tre måneders postoperativ PBMC genekspression i trin I lungekræftpatienter (n = 48) sammenlignet med patienter uden cancer (n = 11).

CCL3

: p = 0,79;

IL8

: p = 0,3;

IL1β

: p = 0,1;

CXCL10

: p = 0,8;

IL2Rα

: p = 0,29. C. Tolv måned postoperativ PBMC genekspression i trin I lungekræftpatienter (n = 40) sammenlignet med patienter uden cancer (n = 7).

CCL3

: p = 0,76;

IL8

: p = 0,52;

IL1β

: p = 0,87;

CXCL10

: p = 0,22;

IL2Rα

: p = 0,58. For alle paneler, hver bjælke repræsenterer forholdet mellem den gennemsnitlige ekspressionsniveau i de kræftpatienter over gennemsnitlige ekspressionsniveau i kontrolpatienterne, udtrykt i log

2 skala. En positiv værdi indikerer, at ekspression er højere i de kræftpatienter sammenlignet med kontrolpatienterne. To eksempler t-tests blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​forskellene i udtryk.

cytokin profil rask donor PBMC’er Efterligner

in vivo

Resultater Efter Co-kultur med lungekræft cellelinier

for at udvide analyse af virkningerne af lungekræft på PBMC cytokin udtryk blev en

in vitro

co-kultur, der anvendes, som beskrevet i materialer og metoder. To forskellige humane lungecancer-cellelinjer blev anvendt i de nedre transwell kamre: A549, en lunge carcinom cellelinje, der huser en K-ras-mutation og HCC827, en lunge adenocarcinom cellelinie med et EGFR-mutation (E746-A750 del). Som en yderligere kontrol blev godartede NHBE-celler også anvendt i de nedre Transwell kamre. PBMC’er, der anvendes i de øvre transbrøndene, blev fremstillet fra raske donorer uden kendt lungekræft historie.

Eksponering af rask donor PBMC’er til 6 og 18 timer til enten A549 eller HCC827 celler induceret opregulering af

CCL3, IL8

IL1β

mRNA i en tidsafhængig måde sammenlignet med sham-eksponerede PBMC (figur 4A og 4B). Selvom

IL2Rα

mRNA blev også opreguleret, omfanget er langt mindre end den, der ses for

IL8

IL1β

. I modsætning hertil

CXCL10

ekspression var enten uændrede eller nedreguleret efter co-inkubering med lungekræft cellelinier. Interessant nok blev dette mønster af cytokin-genekspression ikke set i PBMC samdyrket med de godartede NHBE celler (Figur S3). Endvidere blev de samme fibrinlag, der anvendes til co-kultur af NHBE-celler og PBMC (viser ingen cytokin respons) også udsat for A549 og HCC827 lungecancerceller hvor en reaktion svarende til den demonstreret i figur 4 blev værdsat (data ikke vist) .

lungecancer cellelinier blev co-dyrket med rask donor PBMC som beskrevet i Materialer og Metoder. PBMC genekspression og supernatant proteinniveauer blev bedømt for hver af 5 udvalgte cytokiner. A. Genekspression i PBMC eksponeret for A549-celler. B. genekspression i PBMC eksponeret for HCC827 celler. Til paneler A og B, hver søjle repræsenterer middelværdien (n = 8 raske donorer) i forhold fold ændring (+/- SEM) mellem lungekræft celle eksponeret PBMC og PBMC eksponeret for medier alene, udtrykt i log

2 skala. Lukkede søjler indikerer 6 timers co-kultur, mens de åbne søjler angiver 18 timers co-dyrkning. C. Cytokin-proteinniveauer i supernatanten i løbet af co-dyrkning af A549-celler med rask donor PBMC. D. cytokinprotein niveauer i supernatanten i løbet af co-dyrkning af HCC827 celler med rask donor PBMC. Til paneler C og D, hver søjle repræsenterer middelværdien (n = 8 raske donorer) i forhold fold ændring (+/- SEM) mellem lungekræft celle eksponeret PBMC (18 timers co-kultur) og PBMC eksponeret for medier alene, udtrykt i log

2 skala. Én prøve t-tests blev anvendt til at bestemme betydningen af ​​den observerede gennemsnitlige fold ændringer. I alle paneler, en stjerne angiver p 0,05. ND angiver data under detektionsgrænsen.

For at vurdere cytokinprotein niveauer i co-kultur-systemet, blev supernatanter høstet efter 18 timers co-kultur med lungekræft-cellelinjer, og evalueres ved hjælp af Luminex-assay (figur 4C og 4D). Mens IL8, CXCL10 og sIL2Rα koncentrationer efterlignede de tilsvarende genekspression data (figur 4A og 4B), CCI3 og IL1β niveauer var under detektionsgrænserne i alle prøver til begge cellelinier. For at løse denne mangel på detekterbar CCL3 og IL1β i kultursupernatanterne, blev PBMC’er evalueret ved anvendelse af flowcytometri for den intracellulære tilstedeværelse af CCL3, IL8 og IL1β. Som vist i figur 5A, intracellulær CCL3, IL8 og IL1β blev påvist i CD3 + fraktion (T-celler) af sunde donor-PBMC’er, der var blevet co-dyrket med enten lungecancer-cellelinie, men ikke i dem, dyrket i fravær af lungekræft celler. Et lignende resultat blev opnået for CD14 + PBMC-fraktionen (monocytter), der er vist i figur 5B. Omvendt CD19 + fraktion (B-celler), og CD56 + fraktion (NK-celler) viste ingen stigning i de intracellulære niveauer af disse cytokiner (data ikke vist).

Efter co-dyrkning, PBMC blev fikseret og evalueret under anvendelse flowcytometri for intracellulære cytokiner (CCL3, IL8 og IL1β). Vist er én repræsentant rask donor (ud af 3 udført). A. CD3 + cellefraktion. Abscissen repræsenterer CD3-farvning, mens individuel cytokin-farvning afspejles som ordinat. Andelen af ​​dobbelt farvede celler er afbildet i øverste højre hjørne af hver undertavle. B. CD14 + cellefraktion. Abscissen repræsenterer CD14-farvning, mens individuel cytokin-farvning afspejles som ordinat. Andelen af ​​dobbelt farvede celler er afbildet i øverste højre hjørne af hver undertavle.

Diskussion

rolle cytokiner i biologi menneskelige malignitet er kompleks, men meget af den interaktion mellem tumorceller og værtens immunceller menes at være medieret af denne store familie af proteiner og glycoproteiner [6]. Som følge heraf er der en voksende mængde litteratur evaluere serum cytokinniveauer i forhold til clinicopathologic elementer af både hæmatologiske og faste tumorer, herunder lungekræft. Mange af disse undersøgelser dog kun sammenlignet serum cytokin niveauer af kræftpatienter til dem i raske frivillige, med vægt på den potentielle nytte af disse målinger som biomarkør [12], [13].