PLoS ONE: Samtidig Induktion af ikke-Canonical Autophagy og apoptose i cancerceller ved ROS-Dependent ERK og JNK Activation

Abstrakt

Baggrund

Kemoterapi-induceret reduktion i tumor belastning er en funktion af apoptotisk celledød, orkestreret af intracellulære caspaser. Imidlertid er effektiviteten af ​​disse behandlinger kompromitteret af mutationer påvirker specifikke gener, styring og /eller regulering apoptotisk signalering. Derfor er det ønskeligt at identificere nye veje for celledød, som kunne fungere i tandem med eller i mangel af en effektiv apoptotisk maskiner. I denne forbindelse nylige beviser understøtter eksistensen af ​​en roman celledød vej betegnes autophagy, som aktiveres ved vækstfaktor afsavn eller udsættelse for genotoksiske stoffer. Den funktionelle betydning af denne vej i form af dens evne til at tjene som et stressrespons eller en virkelig død effektormekanisme stadig pågældende Men rapporter viser, at autophagy er en specialiseret form for celledød under visse betingelser.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi rapporterer her den samtidige fremkaldelse af ikke-kanoniske autofagi og apoptose i humane cancerceller ved udsættelse for et lille molekyle forbindelse, som udløser intracellulær hydrogenperoxid (H

2O

2) produktion. Betragtninger, nedregulering af beclin1 hverken hæmmede kendetegnende for autophagy eller induktion af celledød, ATG 7 eller Ulk1 knockdown væsentligt ophævet lægemiddel-induceret H

2O

2-medieret autofagi. Desuden giver vi beviser for, at aktiverede ekstracellulær reguleret kinase (ERK) og c-Jun N-terminal kinase (JNK) er opstrøms effektorer kontrollerer både autofagi og apoptose som reaktion på forhøjet intracellulære H

2O

2. Interessant inhibering af JNK-aktivitet vendt stigningen i Atg7 ekspression i dette system, hvilket indikerer, at JNK kan regulere autofagi ved aktivering Atg7. Notatet det lille molekyle sammensatte udløste autofagi og apoptose i primære celler afledt af patienter med lymfekræft, men ikke i ikke-transformerede celler.

Konklusioner /Betydning

I betragtning af at tabet af tumor suppressor beclin 1 er forbundet med neoplasi, kunne muligheden af ​​denne lille molekyle forbindelse for at engagere både autophagic og apoptotiske machineries via ROS produktion og efterfølgende aktivering af ERK og JNK har potentielle translationelle konsekvenser

Henvisning:. Wong CH, Iskandar KB, Yadav SK, Hirpara JL, Loh T, Pervaiz S (2010) Samtidig Induktion af ikke-Canonical Autophagy og apoptose i cancerceller ved ROS-Dependent ERK og JNK Aktivering. PLoS ONE 5 (4): e9996. doi: 10,1371 /journal.pone.0009996

Redaktør: Gian Maria Fimia, INMI, Italien

Modtaget: December 3, 2009; Accepteret: 7 marts 2010; Udgivet: 2 April, 2010

Copyright: © 2010 Wong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af tilskud til SP fra National Medical Research Council, Singapore, forskningsråd Biomedical, Singapore, Undervisningsministeriet (MOE-Tier 2), Singapore, og forskningsmidler fra Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det er nu veletableret, at kemoterapi-induceret reduktion i tumor belastning er en funktion af apoptotisk celledød, dirigeret af intracellulære caspase proteaser. Imidlertid er effektiviteten af ​​nogle af disse behandlinger gjort stumpe ved mutationer, der påvirker specifikke effektorer gener, der kontrollerer og /eller regulerer apoptotisk signalering, såsom epigenetisk inaktivering af caspase 8, nedregulering af pro-apoptotiske proteiner Bax og Apaf-1, såvel som opregulering af anti-apoptotiske proteiner fra Bcl-2 og IAP familier. Derfor har der været en bølge af aktivitet omkring identifikation af nye veje for celledød, som kunne fungere i tandem med eller i mangel af en effektiv apoptotisk maskiner. I den forbindelse har de seneste beviser fremhævet, at der findes en roman, caspase-uafhængig vej, betegnes autophagy, som aktiveres som reaktion på vækstfaktor afsavn eller ved udsættelse for genotoksiske stoffer [1]. Betragtninger, juryen er stadig ude på den funktionelle relevans af denne vej med hensyn til dens evne til at tjene som en stress reaktion eller en virkelig død effektor mekanisme, seneste beviser synes at støtte denne autofagi er en specialiseret form for celledød under visse betingelser [ ,,,0],2], [3], [4].

Blandt de mange effektor mekanismer involveret i styring og regulering af celledød veje, herunder apoptose og autophagy, er den cellulære redox status. Den redox status cellen er bestemt af balancen mellem satserne for produktion og nedbrydning af reaktive oxygen og /eller nitrogen arter (ROS, RNS) [5], såsom superoxid anion (O

2

-) , hydrogenperoxid (H

2O

2), hydroxylradikal (OH), nitrogenoxid (NO) og hypochlorus syre (HOCl) [6]. Vi har tidligere vist, at tumorcelle respons på død stimuli er en funktion af cellulær redox-status, og stimuli, især død-inducerende forbindelser, der inducerer en signifikant stigning i intracellulær H

2O

2 lette døden udførelse [7 ], [8], [9], [10] [11], [12], [13], [14], [15].

Interessant ROS er også blevet vist som stærke signaler til aktiveringen af ​​mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) -familie af signalering proteiner omfattende af c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 og ERK [16]. MAPK familiemedlemmer aktiveres i en 3-lags kinasekaskade bestående af MAPK kinase kinase (MAPKKK), MAPK kinase (MAPKK) og MAPK [17]. Vedvarende aktivering af JNK er blevet direkte forbundet med en stigning i intracellulær ROS produktion [18], og en mulig mekanisme kunne være gennem inaktivering af MAPK Phosphataser (MKP) [6]. Notatet en stigning i intracellulær ROS samt aktivering af MAPK er blevet demonstreret under autophagic udførelse [19], [20].

Autophagy er blevet godt anerkendt som renovationsafgifter af cellen, der primært er involveret i beslaglæggelse af plasmamembranen og langlivede organeller i autophagosomes, som i sidste ende fusionere med lysosomer for nedbrydning og genanvendelse af næringsstoffer [21], [22]. Vigtigere, vedvarende autofagi som reaktion på cellulære stresstilstande tjener som en potent død signal [23], [24], [25], som i tilfældet af behandling-induceret autophagy, en specifik ikke-apoptotisk død pathway udløses ved udsættelse for kemoterapeutiske forbindelser [26]. Sidstnævnte danner grundlag for identifikation af type II celledød, karakteriseret ved overdreven autophagosome dannelse [27], [28]. Paradoksalt nok basalt niveau af autofagi fremkaldt af stress, såsom hypoxi og vækstfaktor tilbagetrækning tips den cellulære skæbne til overlevelse [29], [30], [31].

Aktiveringen af ​​den kanoniske autophagy vej er kritisk under kontrol af BH-3 kun Bcl-2 interagerende protein, Beclin1 [32]. Især har de seneste beviser unraveled en roman autophagic celledød vej hvor Beclin1 er helt undværes [33]. Dette kunne være af afgørende betydning som udførelse af ikke-kanonisk autofagi i cancerceller, der bærer en Beclin1 knockout fænotype, kunne udgøre en ny og effektiv strategi for at fremkalde kræft celledød [34].

Her rapporterer vi den mekanisme af celledød induceret i humane tumorceller ved en hidtil ukendt lille molekyle forbindelse, 1,3-dibutyl-2-thiooxo-imidazolidin-4,5-dion (C1). Eksponering af humane kolorektal carcinom og forskellige andre tumorcellelinjer til C1 resulterede i celledød med morfologiske og biokemiske træk i overensstemmelse med ikke-kanoniske autofagi og apoptose. Desuden fremhæver vi den skelsættende inddragelse af tidlig ROS produktion og ERK og JNK aktivering opstrøms af autophagic og apoptotiske veje. Dette er en roman rapport fremhæver samtidig induktion af Beclin1-uafhængig autofagi og apoptose i tumorceller ved et lille molekyle forbindelser, som kan have enorme kliniske implikationer, i betragtning af den relativt høje forekomst af Beclin1 tab i humane kræftformer.

Materialer og metoder

Reagenser og kemikalier

pan-caspaseinhibitor, zVAD-FMK, og caspase 3 og 9 hæmmere (DEVD-FMK og VEHD-FMK) blev opnået fra Alexis Biochemicals ( Lausen, Schweiz). JNK-inhibitor (SP600125), ERK-inhibitor (PD98059), bovin katalase, Earles balancerede saltopløsning (EBSS) medium, rapamycin, diethyldithiocarbamat (DDC), E64D, pepstatin-A, 3-methyladenin, C2-ceramid, N-acetyl -cystein, krystalviolet, og MTT blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Superoxiddismutase (SOD) blev købt fra Calbichem (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) blev opnået fra Upstate (Millipore, MA).

tumorcellelinier

HCT116 colorektale carcinomaceller blev generøst leveret af Dr. Bert Vogelstein (The Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD) og opretholdt i McCoy 5A (Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum FBS), 1% L-glutamin og 1% S-Penicillin (Hyclone, Thermo Videnskabelige, Waltham, MA) i en 37 ° C inkubator med 5% CO

2. HeLa cervical carcinoma, A549 småcellet carcinom, M14 melanom, SHEP1 og SHSY5Y neuroblastom-cellelinier blev opnået fra ATCC og opretholdt i DMEM (Hyclone) suppleret med 10% FBS. MCF-7, T47D, og ​​MB-MDA231 brystcancercellelinier var fra ATCC og dyrket i RPMI (Hyclone) suppleret med 10% FBS. HK-6, C666-1 nasopharyngeal karcinom cellelinjer, begavet af Dr. Lo Kwok-Wai (Den kinesiske University of Hong Kong) og Dr. Hsieh Wen-søn (Johns Hopkins Singapore), blev opretholdt i RPMI suppleret med 10% FBS .

Transfektion med pGFP-rLC3 og siRNA

i forbigående ekspression blev celler transficeret med 8 ug pGFP-LC3 eller pCINeoEV eller pClneo + Cat plasmider i Optimem1 ™ medium (Invitrogen Corporation, Carlsbad , CA) under anvendelse af Superfect-transfektionsreagens (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. For knockdown af genekspression, 50 nM siRNA (beclin- 1 siRNA, eller JNK1 /2 siRNA, eller ERK1 /2 siRNA, eller Atg7 siRNA, eller ulk-1 siRNA) blev transficeret ind i celler i Optimem1 ™ medium vha Dharmafect1 reagens ( Dharmacon) ifølge producentens instruktioner.

Cellelevedygtighed og tumor kolonidannende assays

Cellelevedygtighed efter eksponering lægemiddel blev bestemt ved MTT-assayet som tidligere (14) beskrevet. For kolonidannende assays blev 10.000 celler udpladet i petriskåle og dyrket i 2 uger. Pladerne blev derefter farvet med krystalviolet-opløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og kolonier blev scoret manuelt som beskrevet tidligere [35]. Salg

propidiumiodidfarvning for DNA fragmentation

Celler blev behandlet med C1 til de angivne tidspunkter som beskrevet i figurteksterne forud for propidiumiodidfarvning for DNA indholdsanalyse som tidligere (14) beskrevet. Histogram data, der angiver procentdelen af ​​celler med sub-diploid DNA er vist og er gennemsnit ± SD af tre uafhængige observationer.

Flowcytometrisk analyse af intracellulær ROS

Celler blev fyldt med 5 pmol /l redox følsomme farvestof 5- (and-6) -chlormethyl-2-, 7-dichlorofluorescin diacetat (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) som beskrevet tidligere (14) og analyseret ved flowcytometri (Coulter EPICS Elite ESP). Påvisning af intra-mitokondrie O

2

– blev udført ved at indlæse celler med MitoSox ™ RED MITOCHODNRIAL O

2

– indikator (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) som tidligere beskrevet og analyseret ved flowcytometri ( Coulter EPICS Elite ESP). Mindst 10.000 begivenheder blev analyseret.

Isolering af mitochondrier

HCT116-celler behandlet med C1 til 6, 12 og 24 timer blev underkastet mitokondriel ekstraktion som beskrevet andetsteds (14). De mitokondriske pellets blev lyseret i standard 1xRIPA lysepuffer og supernatanterne blev anvendt som cytosoliske fraktioner.

Immunofluorescensanalyse af pGFP-rLC3 og acridinorange

Analyse af LC3 blev udført ved anvendelse pGFP-rLC3 transficerede celler ved immunfluorescensmikroskopi. Efter transfektion med pGFP tom vektor eller pGFP-rLC3 blev celler inkuberet med C1 til 6 til 24 timer og visualiseret ved et fluorescerende mikroskop (Eclipse TE2000-S, Nikon) ved anvendelse excitationsbølgelængde på 488 nm og emissionsbølgelængde på 525 nm. Til visualisering af lysosomer blev celler behandlet i 6 timer og derefter farvet med 2,5 ug /ml acridinorange (Molecular Probes, Invitrogen Corporation) i 10 minutter ved 37 ° C, og analyseret for både, grøn og rød flurorescence, ved hjælp af fluorescensmikroskopi som nævnt ovenfor.

Elektronmikroskopi

Celler blev fikseret natten over i 2,5% glutaraldelhyde i 0,1 M phosphatbuffer (pH 7,2), før de post-fikseret i 1% OSO4 i 1 time. Derefter blev cellerne dehydratiseret i ethanol serie og indlejret i Spurr s harpiks. Ultratynde snit blev farvet med uranylacetat og blycitrat og observeret under et JEOL JEM-1230 transmission electron microscope.

cytotoksicitet assay for primære celler fra lymfom væv Salg

Primært tumorvæv fra patienter med T eller B-celle lymfom blev opnået fra samtykkende patienter på Rigshospitalet i henhold til den godkendte IRB protokol. Væv blev hakket og anspændt gennem MACS adskillelse filter (Miltenyi Biotec) til opnåelse enkeltcellesuspensioner. Lymfocytter blev opnået efter Ficoll Hypaque gradient centrifugering. Cellelevedygtighed af primær lymfom /200 pi /brønd i 96 brønds plader blev bestemt ved MTT-assay efter eksponering til 25 og 50 ug /ml C1 i 24 timer. MTT-assayet blev vurderet som beskrevet i forrige afsnit.

Western blot-analyse

helcelle proteinekstrakter blev isoleret under anvendelse af 1X RIPA-lysepuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl , 0,25% deoxycholsyre, 1% NP-40, 1 mM EDTA og proteaseinhibitorer (Calbiochem, San Diego, CA). Lige store mængder af protein fra totale cellelysater (30 til 120 ug /bane) blev adskilt ved natriumdodecylsulfat (10%, 12% eller 15%) polyacrylamidgelelektroforese geler (SDS-PAGE; BioRad Laboratories), overført til PVDF-membran (BioRad Laboratories) under anvendelse af våd overførsel (BioRad Laboratories) og blottet med primære antistoffer specifikke for Bax, P62, LC3 , Caspase 9, β-actin, GAPDH, ULK1 (Santa Cruz Biotechnology), Beclin1, ATG7, ATG12, ATG5, cytochrom C, JNK, p-JNK, c-jun, pc-jun, Bud (Cell Signaling Technology), Caspase 3 (Upstate, Millipore Corporation), caspase 8, Smac, anti-poly (ADP-ribose) polymerase (BD Pharmingen) og katalase (Calbiochem) og probet med de respektive sekundære isotype specifikke antistoffer mærket med peberrodsperoxidase (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL). Bundet immuno-komplekser blev påvist ved anvendelse WEST PICO Kemiluminescens substrat (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL).

Syntese og analyse af det lille molekyle forbindelse C1

Det lille molekyle Forbindelse 1,3- dibutyl-2-thiooxo-imidazolidin-4,5-dion, her betegnet C1, blev syntetiseret som følger: Oxalylchlorid blev tilsat til 1,3-dibutyl-2-thiourinstof (10 mM) i vandfri ether i en rundbundet kolbe under omrøring. Reaktionsblandingen blev omrørt i 1 til 2 timer ved omgivelsestemperatur og derefter hældt i mættet NaHCO

3. Produktet blev ekstraheret med 3X ethylacetat. Ethylacetatlaget blev derefter vasket med destilleret vand og derefter saltopløsning vand. Ethylacetat blev derefter tørret med vandfrit Mg

2SO

4 og fjernet under reduceret tryk. Oprensningen ved flashkromatografi (ethylacetat: hexan) gav den gule olieprodukt. Det olieagtige produkt blev størknet i køleskab. Forbindelsen blev derefter analyseret ved

1HNMR,

13C NMR og MS, og resultaterne er præsenteret som følger:

Navn: 1,3-dibutyl-2-thiooxo-imidazolidin-4,5-dion; Farve: Orange; FT-IR (i CH

2Cl

2): 2875-2960 cm

– (alifatisk CH), 1770 (C = O), 1410 (C = S);

1HNMR (i CDC

3): δ = 0,95 9 (t, J = 7,3 Hz, 6H, 4′-CH

3), 1,34 (sext, J = 7,7 Hz, 4H, 3 ‘ -CH

2), 1,67 (kvint, J = 7,2 Hz, 4H, 2-CH

2) 3,93 (t, J = 7,5 Hz, 4H, 1′-CH

2);

13C NMR (i CHC

3): δ = 13,54 (C4 ‘), 19,90 (C-3’), 29,72 (C-2 ‘), 41.83 (C-1’), 155,35 (C- 4.5), 180,63 (C-2); Masse m /z (%): 242 (100) [M

+], 209 (26) [M + -HS], 187 (22); MF C

11H

18N

2O

2S beregnet 242,34, Fundet 243,34

Udbytte:. 95%

Statistisk Analyse

Alle forsøg blev udført mindst 3 gange, medmindre andet er angivet. Eksperimentelle forskelle blev testet for statistisk signifikans ved hjælp Students

t

-test.

P

værdi 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

C1 inducerer celledød og MOMP i humane tumorceller

Eksponering af tumorceller. til stigende koncentrationer (25-200 pg /ml) af C1 resulterede i en dosisafhængig formindskelse i cellelevedygtighed efter 24 timer med LD50 for -100 pg /ml (figur 1b). Endvidere viste kolonidannelse assayet en signifikant reduktion i klonogene evne på 25 og 50 ug /ml og et fuldstændigt ophør af kolonidannelse ved 100 ug /ml (figur 1 C). Resultaterne viste også, at inkubation af celler med C1 udløste mitokondrisk ydre membran permeabilisering (MOMP) som påvist ved translokationen af ​​cytochrom c og Smac, og gensidig translokation af Bax og Bud til mitokondrierne (figur 1D). Desuden opnåede vi evidens for effektiv behandling af caspaser 3, 8 og 9, og spaltning af caspase 3 substrat PARP i totale cellelysater fra celler efter C1 behandling, der blev reddet i nærværelse af zVAD-fmk (Figur 1E, F ). Analyse af cellecyklus afslørede 20% af cellerne med sub-diploid DNA-indhold (sub-G1 population) efter 24 timers behandling blev væsentligt forøget (52%) efter inkubering i 48 timer og blokeret i nærvær af det pan-caspase inhibitor (Figur 1G). Interessant zVAD kun delvist billede beskyttelse formular C1-induceret celledød (figur 1H). Disse data viste, at C1-induceret celledød kan indebære caspase-uafhængig pathways. For at undersøge det, vi først evalueret effekten af ​​nekrose hæmmer, necrostatin på C1-induceret celledød. Resultaterne viste, at mens necrostatin effektivt kunne ophæve tumornekrosefaktor-α-induceret celledød (Supplerende figur S1A), det havde ingen effekt på C1-induceret celledød, derved udelukke involveringen af ​​nekrose i denne model (Figur 1I).

(A) Kemisk struktur og molekylvægten af ​​forbindelsen C1. (B) Celler blev behandlet med stigende koncentrationer af C1 (25 ug /ml til 100 ug /ml) i 18 timer, og celle overlevelse blev vurderet ved MTT-assayet. (C) Efter eksponering for C1 som i (B), blev 10.000 celler podet på 100 mm petriskåle til vurdering af kolonidannelse. (D) Celler blev behandlet med C1 (100 ug /ml) i 6, 12 og 24 timer, og sub-cellulære fraktioner blev underkastet western blot-analyse. (E) lysater fra celler behandlet med C1 (100 ug /ml) i blev probet til forarbejdning af caspaser 3, 9 og 8. (F, G, H) Celler blev behandlet med C1 (100 ug /ml i 18 timer) i tilstedeværelsen eller fraværet af zVAD-fmk (50 pM) i 12 og 24 timer og (F) lysater probet for PARP-spaltning og (G) cellecyklus-profiler blev opnået ved PI-farvning og (H) overlevelse blev vurderet ved MTT-assayet . (I) Celler blev præinkuberet med Necrostatin-1 (50 uM i 1 time) før udsættelse for C1 (100 ug /ml i 18 timer) og overlevelse blev vurderet ved MTT-assayet.

Induktion af Beclin1-uafhængig autophagy af C1

Dernæst elektronmikroskopisk analyse af cellemorfologi blev udført efter udsættelse for C1. Interessant, udsættelse af celler for C1 (100 ug /ml i 24 timer) resulterede i dannelsen af ​​autophagosomes og autophagic vakuoler (figur 2A). Desuden blev den forøgede ekspression af MAP1 LC3II (her betegnet LC3II) observeret i en tidsafhængig måde (Figur 2B). Af særlig note identificerede vi for første gang LC3II berigelse i de tunge membranfraktioner følgende lægemiddelbehandling (Figur 2C). Dette kan indikere tilstedeværelsen af ​​mitokondrie engulfment af autophagic vakuoler. Desuden celler transficeret med LC3-GFP viste et diffust mønster, mens eksponering for C1 resulterede i en grøn punktformet farvning, der indikerer LC3II akkumulering inden for autophagosomal membraner (Figur 2D). Desuden blev en signifikant stigning i ekspression af Atg7 og Atg5 sammen med en gensidig fald i Atg12 ekspression observeret efter eksponering (6-24 timer) af celler til C1, hvilket indikerer Atg5-Atg12 konjugering (Figur 2E).

(A) HCT116-celler blev behandlet med C1 (100 ug /ml) i 24 timer, fikseret og betragtes under et elektronmikroskop (forstørrelse x 40.000). Pile indikerer tilstedeværelsen af ​​autophagosomes. (B) Lysater af celler behandlet med C1 (100 ug /ml) blev probet for LC3II. (C) Western blotting-analyse af LC3II inden cytosolisk og mitokondriske fraktioner af celler efter udsættelse for C1. (D) Celler blev transficeret transient med GFP-vektor eller LC3-GFP i 48 timer, udsat for C1 i 24 timer og derefter analyseret ved anvendelse af et fluorescensmikroskop. Pile peger på punktformet farvning indikerer LC3 II sammenlægning i autophagosomes. (Mag: 40.000 ×). (E) Efter C1 eksponering blev cellelysater undersøgt for Atg7, Atg5 og Atg12.

Næste vi undersøgt, om der var tilstrækkelig autophagic flux ved udsættelse for C1. Autophagic flux er afgørende for, om den autophagic fragt og montage sidst når lysosomerne og efterfølgende nedbrydes. En af de måder at bestemme autophagic flux er forbehandling med lysosomale inhibitorer, E64D og pepstatin A, før tilsætning af stimulus. Lysosomale hæmmere øger LC3 II dannelse, dels ved at blokere autophagosomal-lysosomale fusion. Derfor undersøgte vi virkningen af ​​lysosomale inhibering på C1-induceret LC3II formation. Vores resultater viste, at inhibitorerne øget LC3II omsætning i cellerne på tidlige tidspunkter (6 timer), men der var ingen yderligere stigning på længere inkubation (24 timer) med forbindelsen (Supplerende figur S1E). Vi derefter kontrolleres for ekspressionsniveauet af p62 /SQSTM1, en markør for autophagic flux [36]. Niveauerne af P62 faldt på C1 behandling på tidlige tidspunkter indikerer effektiv autofagi dog niveauerne forhøjet efterfølgende (12-24 timer; Supplerende Figur S1F), som kunne antyde muligheden for afvigende autophagic flux. Sidstnævnte observation blev yderligere dokumentation for lysosomale brud, analyseres ved acridinorange, der fluorescerer rødt i sure rum såsom lysosomerne og grønt i neutral pH. En stigning i grøn flurorescence med en gensidig fald i rød flurorescence blev observeret i celler efter udsættelse for C1, hvilket viser sprængning af lysosomer (Supplerende figur S1F).

For at vurdere rollen af ​​Beclin1 i C1-induceret autophagy blev RNAi-medieret dæmpning af

Beclin1

udført. Banke ned af

Beclin1

hverken inhiberet LC3II akkumulering fremkaldt af C1 heller ikke kunne redde celler fra død udløser aktivitet af det lille molekyle forbindelsen (figur 3A). Især

Beclin1

lyddæmpning effektivt kunne ophæve serum sult-induceret LC3II dannelse, viser den klassiske rolle Beclin1 i sult-induceret autophagy (Supplerende figur S1c). I modsætning til

Beclin1

lyddæmpning, si

Atg7

resulterede i et signifikant fald i LC3II ophobning induceret ved C1 eksponering, mens det apoptotiske signal (PARP spaltning) forblev uændret (figur 3B). Tilsammen disse data giver stærke beviser for, at eksponering af HCT116 celler til C1 udløser ikke-kanonisk autophagy, men involverer mellemkomst af ubiquitin E1-lignende enzym Atg7. Bestyrke disse resultater er resultater opnået med gen knockdown af UNC-51 lignende kinase (ULK1; mammal homolog af gær Atg1), der ligeledes inhiberede LC3II dannelse i denne model (figur 3C). Endvidere

a priori

behandling af celler med 3-MA (5 eller 10 mM) havde næsten ingen virkning på LC3 II akkumulering induceret af C1 (figur 3D). Vigtigere, forbehandling af HCT116 celler med zVAD-fmk, caspase 3 inhibitor eller caspase 9-inhibitor ændrede ikke akkumulering af LC3II I induceret af C1, hvilket viser, at signalerne for apoptose ikke påvirke autophagic signalvejen (figur 3E). Vigtigere, nedregulering af Atg7 signifikant beskyttede HCT116 celler fra C1-induceret reduktion i cellelevedygtighed, hvilket indikerer, autophagic signal kunne være et effektivt celledød udløser (fig 3F). Da Beclin1 ikke var involveret i C1-induceret autophagy, knockdown af Beclin1 naturligt ændrede ikke celledød respons (figur 3F). Men ulk lyddæmpning også havde ingen signifikant effekt på celledød (figur 3F), således argumentere for kompenserende virkninger udøves af andre fremtrædende

ATG

gener.

(A), (B) og (C) Celler blev transficeret transient med siRNA mod Beclin1 eller ATG7 eller ULK1 i 48 timer efterfulgt af udsættelse for C1 (100 ug /ml) i 24 timer. Helcellelysater blev derefter probet for LC3II. (D) Celler blev præinkuberet med 3-MA (5 eller 10 mM) i 1 time før udsættelse for 100 ug /ml C1 i 18 timer. Lysater blev derefter immuno-blottet med anti-LC3. (E) Celler blev forbehandlet med zVAD-fmk (50 pM), caspase 3 inhibitor (50 uM) eller caspase 9-inhibitor (50 uM) før tilsætning af 100 ug /ml C1 i 18 timer. Lysater blev derefter immuno-blottet med anti-PARP og anti-LC3 antistof. (F) Celler blev transficeret med siRNA mod Beclin-1 eller Atg7 eller ULK1 og derefter eksponeret for 100 ug /ml C1 i 18 timer. Cellernes levedygtighed blev vurderet ved MTT-analysen, som beskrevet i materialer og metoder.

For at dokumentere, at autofagi-inducerende effekt af dette lille molekyle sammensatte ikke var begrænset til kolorektal carcinom cellelinje, LC3II dannelse var vurderes i 9 andre humane cancer cellelinier af forskellige oprindelser. Faktisk blev en stigning i LC3II dannelse observeret i alle testede, om end på forskellige lægemiddelkoncentrationer (figur 4A) cellelinier. Det skal bemærkes, at i lighed med HCT116 celler, disse cellelinier var også følsomme over for apoptose induktion ved C1 (data ikke vist). For yderligere at undersøge den translationelle relevans af disse data opnået med etablerede cellelinjer, vi næste testede virkningen af ​​C1 på ikke-transformerede celler (MCF-10A og MRC poster) samt på primære celler opnået fra patienter med lymfomer. I modsætning cancerceller, har ikke-transformerede celler ikke viser nogen tegn på autofagi som reaktion på C1, sammenlignet med HCT116-celler og MDA-MB-231-celler (figur 4B). Desuden en repræsentativ prøve fra en patient med klinisk lymfom klart fremkaldte stærke LC3II dannelse i respons på narkotika eksponering (figur 4B). Vigtigere, eksponering af primære celler afledt af lymfom patienter (n = 12) viste dosisafhængig følsomhed over for C1, hvorimod celler fra ikke-kræft lymfeknuder var relativt modstandsdygtige over for behandlingen (figur 4C). Disse data klart fastslået, at den lille molekyle forbindelsen C1 udløst og celledød i forskellige cancercellelinier og i primære celler, mens besparende ikke-transformerede celler.

(A) Primære kulturer af lymfom og godartede væv var dyrket i 6-brønds plader og eksponeres for C1 25 og 50 ug /ml i 24 timer og celleoverlevelse blev vurderet ved MTT-assayet. (B) primære lymfomceller, MDA-MB-231 brystcancerceller, MCF10A mammae epitelceller, HCT116 kolorektale celler og MRC-5 humane lungefibroblaster blev behandlet med C1 i forskellige doser i 18 timer. Cellelysater blev derefter bliver immuno-blottet med anti-LC3 med GAPDH som ladningskontrol. (C) Tumorceller fra forskellige afstamninger blev behandlet med forskellige koncentrationer af C1 i 24 timer og totale cellelysater blev probet for LC3 II og β-actin.

Intracellulær ROS styrer C1-induceret autofagi og apoptose

Efter at have klart fastlagt evne C1 til samtidig fremkalde autofagi og apoptose i kræftceller, vi satte os for at undersøge den molekylære mekanisme (r) ligger til grund for denne biologiske aktivitet. Først vurderede vi effekten på intracellulære ROS produktion ved hjælp af to forskellige fluorescerende prober (MITOSOX ™ RED og CM-DCHF-DA). Faktisk eksponering af celler for C1 resulterede i en signifikant stigning i intracellulær ROS produktion som målt ved H

2O

2-sensitve probe CM-DCHF-DA samt en stigning i intra-mitochondrial O

2

– produktion (figur 5A). Præ-inkubation af celler med ROS scavenger N-acetylcystein (NAC; 200 uM) eller H

2O

2 scavenger, katalase (7000 enheder /ml), blokerede fuldstændigt forøgelsen af ​​CM-DCHF-DA fluorescens, hvilket kraftigt antyder, at ROS arter involverede er H

2O

2 (figur 5B). Der bekræfter disse resultater, blev overekspression af human katalase fundet at ophæve C1-induceret ROS produktion, vurderet ved CM-DCHF-DA-farvning (figur 5A). Interessant katalase præinkubation samt forbigående overekspression af plasmid indeholdende humant katalase-gen inhiberes også C1-induceret PARP-spaltning, en markør for caspase 3-aktivering (figur 5B). Der blev observeret en lignende inhiberende virkning af katalase (exogen tilsætning samt overekspression) og NAC på LC3II akkumulering induceret af C1 (figur 5C). Disse data kraftigt implicerer intracellulær H

2O

2 som opstrøms stimulus, som kontrollerede både autofagi og apoptose i denne model.

I alt 1 × 10

6 celler blev inkuberet med 100 ug /ml C1 i 3 timer og (Ai) intra-mitokondrie O

2

– blev bestemt ved anvendelse af fluorescerende farvestof MitoSox ™ RED mitochondriel O

2

– Indikator og intracellulær H

2O

2 blev påvist ved DCHF-DA lastning og analyseret ved flowcytometri. (AI) Celler blev præinkuberet med katalase (7000 enheder /ml) eller NAC (200 uM) i 1 time før behandling med C1 (100 ug /ml i 3 timer) og intracellulær H

2O

2 var fast besluttet. (All) Celler blev transficeret transient med 8 ug pCINeoEV eller pClneo + CAT i 48 timer (AIII) og behandlet med C1 (100 ug /ml i 3 timer) og intracellulær H

2O bestemtes

2 (Aii ). Celler blev præinkuberet med katalase (7000 enheder /ml i 1 time) eller blev kortvarigt transficeret med pCINeoEV eller pClneo + CAT før udsættelse for C1 (100 ug /ml i 24 timer), og totale cellelysater blev immunoblottedes for (B)