PLoS ONE: Målretning COX-2 /PGE2 Pathway i HIPK2 Knockdown Cancer Cells: Påvirkning af dendritceller Maturation

Abstrakt

Baggrund

homeodomæne-interagerende protein kinase 2 (HIPK2) er et multifunktionelt protein, der udnytter sin kinaseaktivitet at modulere centrale molekylære veje i cancer at begrænse tumorvækst og inducere respons på terapier. For eksempel HIPK2 knockdown inducerer opregulering af onkogen hypoxi-inducerbare faktor-1 (HIF-1) aktivitet, der fører til en konstitutiv hypoxisk og angiogene fænotype med øget vækst tumor

in vivo

. HIPK2 inhibering derfor frigiver veje, der fører til produktion af pro-inflammatoriske molekyler, såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) eller prostaglandin E2 (PGE

2). Tumor-produceret andre end fremme tumorvækst og vaskulær udvikling inflammatoriske mediatorer kan tillade omgåelse af anti-tumor immunrespons. Således dendritiske celler (DC’er) dysfunktion induceret af tumor-producerede molekyler, kan tillade tumorceller at undslippe immunosurveillance. Her evaluerede vi den molekylære mekanisme for PGE

2 produktion efter HIPK2 udtømning, og hvordan til at modulere det.

Metodologi /Principal fund

Vi viser, at HIPK2 knockdown i kolon kræftceller resulterede i cyclooxygenase -2 (COX-2) opregulering og COX-2-afledte PGE

2 generation. På molekylært niveau, COX-2-opregulering afhang HIF-1-aktivitet. Vi har tidligere rapporteret, at zink behandling hæmmer HIF-1-aktivitet. Her zinktilskud til HIPK2 udtømte celler hæmmede HIF-1-induceret COX-2-ekspression og PGE

2 /VEGF produktion. På translationel niveau, mens betinget medier både siRNA kontrol og HIPK2 udtømte celler hæmmes DCs modning, konditionerede medier kun zink-behandlede HIPK2 udtømte celler effektivt genoprettet DCs modning, ses som udtryk for co-stimulerende molekyler CD80 og CD86, cytokin IL 10 release, og STAT3 fosforylering

Konklusion /betydning

Disse resultater viser, at:. 1) HIPK2 knockdown induceret COX-2 opregulering, for det meste afhængig af HIF-1-aktivitet; 2) zink behandling nedreguleret HIF-1-induceret COX-2 og hæmmede PGE

2 /VEGF produktion; og 3) zink behandling af HIPK2 udtømte celler, der restitueres DCs modning

Henvisning:. Garufi A, Pistritto G, Ceci C, Di Renzo L, Santarelli R, Faggioni A, et al. (2012) Målretning COX-2 /PGE

2 Pathway i HIPK2 Knockdown Cancer Cells: Påvirkning af dendritcellemodning. PLoS ONE 7 (11): e48342. doi: 10,1371 /journal.pone.0048342

Redaktør: Kjetil Tasken, Universitetet i Oslo, Norge

Modtaget: Juni 15, 2012; Accepteret: September 24, 2012; Udgivet: November 7, 2012 |

Copyright: © 2012 Garufi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra den italienske sammenslutning for Cancer Research (AIRC) til GDO (nr. 11377) og aF (n. 10265). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

homeodomæne interagerende protein kinase 2 (HIPK2) er et multifunktionelt kinase, hvis aktivitet begrænser tumor progression. HIPK2 phosphorylerer og aktiverer oncosuppressor p53 for apoptotiske funktion som respons på lægemidler [1], [2]. HIPK2 undertrykker også signalveje, der er involveret i tumorudvikling, såsom Wnt /β-catenin, ved hjælp af dens katalytiske aktivitet og transskription undertrykkelse funktion [3], [4]. For nylig fandt vi, at HIPK2 inhiberer hypoxi-inducerbare faktor 1α (HIF-1α) underenheden på transkriptionelt niveau. HIF-1 er et heterodimert transkriptionsfaktor som inducerer transkriptionen af ​​mere end 60 gener involveret i angiogenese, glucosemetabolisme og invasion [5]. HIF-1 består af HIF-1β underenhed, konstitutivt udtrykkes i celler, og oxygen-sensitive HIF-1α underenhed. Forøgede HIF-1α niveauer findes hyppigt i mange humane cancere og er stimuleret af lavt iltindhold, men også af genetiske ændringer. I denne henseende HIPK2 knockdown inducerer HIF-1α opregulering med øget HIF-1-aktivitet fører til vaskulær endotel vækst (VEGF) produktion, tumor angiogenese og kemoresistens [6], [7]. I et forsøg på at målrette HIF-1-aktivitet, vi tidligere vist, at zinkioner tillader HIF-1α proteinnedbrydning i cancerceller, der fører til undertrykkelse af HIF-1-vejen

in vitro

in vivo

[8] med genoprettelse af kemosensitivitet [9].

Undtagen inducere VEGF-ekspression, HIPK2 knockdown fører til forøget prostaglandin E2 (PGE

2) biosyntese, der korrelerer med tumorvækst

in vivo

[10]. PGE

2 er den mest rigelige prostaglandin fundet i colorektal cancer og begunstiger tumorvækst ved at stimulere proliferation, angiogenese og invasionsevne, og ved at hæmme apoptose [11]. PGE aktiverer

2 komponenter af den onkogene Wnt signalsystemet fører til stabilisering og aktivering af β-catenin som transkriptionsfaktor at inducere ekspressionen af ​​adskillige gener, herunder cyclooxygenase-2 (COX-2), c-myc, cyclin D1, og PPARS der er involveret i tumorudvikling [12].

dannelsen af ​​prostaglandiner via COX-2 er en vigtig vej i patogenesen af ​​colorektal cancer, men også for andre kræftformer [13]. COX-2, en inducerbar form af cyclooxygenase, katalyserer omdannelsen af ​​arachidonsyre (AA) for at endoperoxid mellemprodukter, der i sidste ende omdannes til prostaglandiner (PGE2, PGD2, PGF2α, PGI2 og TXA2). COX-2 er stærkt induceres som respons på inflammatoriske mediatorer, vækstfaktorer, onkogen aktivering og tumorpromotorer [14]. Derfor forhøjede niveauer af COX-2 er blevet fundet i mange cancertyper, [15] – [17]. Transkriptionel kontrol af COX-2-genet afhænger af den molekylære maskineri vekselvirker med COX-2-promotoren, som synes at blive styret gennem aktiviteten af ​​forskellige signalveje [18]. Blandt dem, onkogene veje såsom Wnt /β-catenin signalering [19] eller HIF-1 [20] kan forstærke COX-2 gentransskription. Det har vist sig, at HIF-1-aktiveret COX-2 /PGE

2 akse inducerer VEGF og fremmer angiogenese [21], som igen forstærker HIF-1 transkriptionel aktivitet [22]. Sådan krydstale blandt signalveje fører til en autoregulatorisk løkke, der er til gavn for tumorudvikling. Derfor målretning HIF-1 er et funktionelt strategi at afskaffe involverede veje i tumorudvikling, såsom COX-2 /PGE

2 /VEGF.

Tumorceller ofte producerer inflammatoriske molekyler, som i mikromiljøet, andre end fremme tumorvækst og vaskulær udvikling, muliggøre omgåelse af anti-tumor immunrespons [23]. PGE

2, som andre tumor frigivet faktorer, har vist sig at undertrykke immunresponset og tillade tumorceller at undslippe immunosurveillance ved at inducere, for eksempel lokale og systemiske dendritiske celler (DC’er) dysfunktion [24], [25]. DC’er er kraftige antigenpræsenterende celler (APC’er) og som sådan har en afgørende rolle i initiering en immun-respons. Udviklingslandene er højt specialiserede i antigen capture, forarbejdning og præsentation, og efter modning de udtrykker co-stimulerende molekyler (dvs. CD80 og CD86), som aktive T-lymfocytter [26]. Deres rolle i at fremkalde tumor-specifikke svar og efterfølgende tumor regression er blevet grundigt demonstreret gennem

in vivo

vaccine stimulation eller

ex vivo

DC immunterapi [26]. Nedskrivning af DCs modning kan afhænge af tumor-frigivet faktorer derved inducerer immunosuppression. Således er en defekt i DC-systemet er en af ​​de vigtigste faktorer er ansvarlige for tumorundvigelse [27], [28].

På grundlag af ovenstående bemærkninger er formålet med denne undersøgelse var først at evaluere rolle af COX-2 i PGE

2 generation efter HIPK2 udtynding. Vi fandt, at HIPK2 knockdown førte til HIF-1-induceret COX-2 opregulering og COX-2-afledte PGE

2-produktion. Interessant zink behandling nedreguleret COX-2-ekspression og inhiberede PGE

2 generation og dens signalveje, samt HIF-1-induceret VEGF. Så på funktionsniveau, mens konditionerede medier af både siRNA kontrol og HIPK2 udtømte celler hæmmes DCs modning, kun betinget medier zink-behandlede HIPK2 udtømte celler, der viste stærk PGE

2 og VEGF nedregulering, effektivt restaureret DCs modning.

Materialer og metoder

Etik Statement

undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Policlinico Umberto i, Sapienza-universitetet, Rom, Italien.

Celler, Kultur betingelse, Behandlinger, og konditioneret Media

Menneskelig RKO (tyktarmskræft) og stabilt HIPK2-forstyrret RKO-siHIPK2 [29] celler blev rutinemæssigt opretholdt i RPMI-1640 (Life-Teknologi-Invitrogen) medium, mens HCT116 (tyktarmskræft), 293 (humane embryonale nyre celler) og Doxyclyclin (Dox) -inducerbare MCF7 (brystkræft) (MCF7indsi /HIPK2) celler, der udtrykker HIPK2-interferens [30], blev rutinemæssigt opretholdt i DMEM (Life-Teknologi- Invitrogen) medium, alle indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin /streptomycin og glutamin, i 5% CO

2 befugtet inkubator ved 37 ° C. For zinktilskud blev subsammenflydende celler behandlet med 100 pM ZnCl

2 i 24 timer. Til inducerbar HIPK2 knockdown blev Dox (1 ug /ml) til MCF7indsi /HIPK2 celler hver 3 dage, indtil HIPK2 knockdown blev succesfuldt nået (sædvanligvis i ca. 5 dage). Efter HIPK2 knockdown var nået, blev cellerne dyrket uden Dox i yderligere 5 dage for reversion af HIPK2 udtynding.

For at opnå det konditionerede medium (CM), RKO siRNA kontrol og siHIPK2 udtømte celler blev podet ved 6 × 10

5/60 mm2 petriskål og dyrket indtil 60% sammenløb. Derefter blev mediet udskiftet, og supernatanterne (dvs. konditionerede medier) blev høstet 48 timer senere. ZnC

2 (100 mM) blev tilsat i 24 timer.

RNA Extraction og Reverse transskription (RT) -PCR Analyse

Celler blev høstet i TRIzol reagens (Invitrogen) og total RNA blev isoleret efter producentens anvisninger. cDNA blev syntesized fra 2 ug totalt RNA med MuLV revers transkriptase-kit (Applied Biosystems). Semikvantitative RT-PCR blev udført ved anvendelse af varm-Master Taq polymerase (Eppendorf) med 2 pi cDNA reaktion og gener specifikke oligonukleotider under betingelser med lineær forstærkning. PCR blev udført i to eksemplarer på to forskellige sæt af cDNA. PCR-produkter blev kørt på en 2% agarosegel og visualiseret ved ethidiumbromidfarvning under anvendelse af UV-lys. Husholdning β-actin eller 28S gener blev anvendt som intern standard. Densitometrisk analyse blev anvendt til at kvantificere specifikke mRNA-niveauer i forhold til intern standard. Viste data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

Western Immunoblotting

Total celleekstrakter blev fremstillet ved inkubering ved 4 ° C i 30 minutter i lyseringsbuffer (50 mmol /L Tris-HCI , pH 7,5, 150 mmol /l NaCl, 150 mmol /L KCI, 1 mmol /l dithiothreitol, 5 mmol /l EDTA, pH 8,0, 1% Nonidet P-40) plus en blanding af proteaseinhibitorer (Sigma Chemical Company) og phosphataseinhibitorer, og løses ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Proteiner blev overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i PBS og inkuberet med primære antistoffer, der genkender COX-2 (Cayman Chemical), β-catenin (Santa Cruz Biotechnology), cyclin D1 (M-20, Santa Cruz, venligst leveret af Marco Crescenzi ISS, Rom, Italien), monoklonalt muse-anti-HIF-1α (Novus Biologicals, UCS Diagnostic, Italien), p-STAT3 (Y705), total STAT3 (begge fra Cell Signaling Technology), og β-actin (Calbiochem). Sekundært antistof konjugeret til peberrod peroxidise (Bio-Rad) blev anvendt ved 1:5000. Immunreaktivitet blev detekteret ved forøget kemiluminescens-kit (ECL kit, Amersham Corporation).

Transfektion og Plasmider

293 celler blev transficeret ved hjælp af N, N-bis- (2-hydroxyethyl) -2amino -ethanesulphonic syre-pufret salinr (BBS) version af calciumphosphat-proceduren [31], mens RKO og HCT116 blev transficeret ved hjælp af kationiske polymer LipofectaminePlus metode (Invitrogen), ifølge producentens instruktioner. Mængden af ​​plasmid-DNA blev udlignet i hver prøve ved at supplere med tom vektor og transfektionseffektiviteten blev visualiseret med anvendelse af et co-transficeret GFP ekspressionsvektor. Ekspressionsplasmiderne blev anvendt, var: den dominante negative form af HIF-1α uden DNA-bindende domæne og transaktiveringsdomænet (pCEP4-HIF-1α-DN) [32] (venligst tilvejebragt af BH Jiang, Nanjing Medical University, Kina), HIF-1α ekspressionsvektor (venligst stillet til rådighed af A. Farsetti, National Research Council, Rom, Italien) og HA-VHL ekspressionsvektor (venligst stillet til rådighed af WK Rathmell, University of North Caroline på Chapel Hill, USA).

RNA Interference

Celler blev udpladet ved semiconfluence i 35 mm skåle dagen før transfektion. Kontrol-siRNA og specifik siHIF-1α (Dharmacon), eller pSUPER-HIPK2 og kontrol pSUPER vektorer [29] blev transficeret natten ved hjælp LipofectaminePlus reagens (Invitrogen). 36 timer senere blev celler behandlet med 100 pM ZnCl

2 i 24 timer. Transfektionseffektiviteten blev visualiseret med anvendelse af et co-transficeret GFP ekspressionsvektor under et fluorescensmikroskop. Effektiviteten af ​​knockdown blev bekræftet ved RT-PCR-analyse.

ELISA Assay

Celler dyrket til subkonfluens i 60 mm petriskåle blev dyrket i 24 timer med 0,5% FBS før tilsætning af frisk medium med 10 % FEB i eller uden COX-2-selektiv inhibitor NS-398 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) ved 50 nM i 24 timer eller 100 uM ZnC

2 i 24 timer med. PGE

2 og VEGF detektion i celle- konditionerede medier blev bestemt tre gange ved enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) under anvendelse af henholdsvis prostaglandin E2 EIA kit (Cayman Chemical) og Quantikine human VEGF immunoassay kit (R Miltenyi Biotec) blev tilsat på dag 6 i 48 timer for at inducere DC’er modning

Analyse af DC Fænotype ved flowcytometri

. oprensede monocytter blev dyrket i 6 dage med GM-CSF og IL-4, med eller uden 20% (vol /vol) af konditioneret medium (CM) fra cancerceller ubehandlede eller behandlet med 100 pM zink i 24 timer eller med monoklonalt anti VEGF antistof (R 0,05) eller 1% (p 0,01).

(A) HIPK2 og COX-2-genekspression profil i primære tumorer.

box plots

repræsentere HIPK2 (

venstre panel

) og COX-2 (

højre panel

) mRNA-niveauer i prøver af 1) tyktarm, 2) endetarmen, og 3 ) colonadenocarcinom primære tumorer. * P 0,001. (B) Delvis kvantitativ RT-PCR-analyser af HIPK2 og COX-2-genekspression i RKO-celler stabilt forstyrret for HIPK2 funktion (siHIPK2) eller med ikke-mål-RNA interferens (siRNA). 28S blev anvendt som intern kontrol. (C) repræsentant RT-PCR-analyse af HCT116 celler transficeret med pSUPER-HIPK2 (siHIPK2) eller pSUPER kontrol (siRNA) vektor til 48 timer. 28S blev anvendt som intern kontrol. (D, venstre panel) Repræsentant RT-PCR-analyser af MCF7-indsi /HIPK2 celler behandlet med Dox (DOX +) i 5 dage (for HIPK2 knockdown) og derefter dyrket uden Dox (DOX-) for yderligere 5 dage (for HIPK2 nyttiggørelse) . (D, højre panel) Densitometrisk analyse af HIPK2 og COX-2-niveauer (som i det venstre panel) blev udført, og normaliserede værdier til 28S mRNA niveauer blev plottet. * P = 0,001. (E) Total celleekstrakter fra RKOsiHIPK2 og kontrol siRNA celler blev analyseret ved Western immunblotting at vurdere COX-2 protein niveauer. β-actin blev anvendt som protein lastning kontrol.

Resultater og Diskussion

negativ korrelation mellem lav HIPK2 og High COX-2 Expression Niveauer i kræftceller

Til få indblik i den

in vivo

forhold mellem COX-2 og HIPK2 vi udført en

i-silico

co-ekspression analyse at sammenligne forskellige microarray undersøgelser af forskellige normale og tumor colon væv fra Oncomine integrerede kræft database forskning værktøj (https://www.oncomine.org). Analyser af datasæt opnået fra prøver af normale væv og primære kolon adenokarcinomer afslørede en omvendt korrelation mellem HIPK2 og COX-2-ekspression. Således HIPK2 ekspression var høj i normale væv og væsentligt reduceret i kolon adenokarcinomer, mens COX-2-ekspression var lav i normale væv og forøget betydeligt i kolon adenokarcinomer (fig. 1a). Dernæst forsøgte at undersøge, om HIPK2 spillet en rolle i COX-2 regulering. Som afbildet i fig. 1B, øget COX-2-ekspressionsniveauer blev observeret i RKO coloncancerceller stabilt forstyrret for HIPK2 funktion (siHIPK2) [29], sammenlignet med kontrol siRNA celler. Tilsvarende omvendt korrelation mellem lav HIPK2 og høje COX-2-niveauer blev fundet i HCT116 colon cancerceller gennemgår forbigående HIPK2 tømt af siRNA (Fig. 1C), hvilket indebærer en rolle for HIPK2 i COX-2-mRNA-ekspression i cancerceller. For yderligere at bekræfte dette resultat, tog vi fordel af Dox-inducerbare MCF7 brystkræftceller (MCF7indsi /HIPK2), hvor Dox behandling inducerer HIPK2 nedregulering [30], at opnå væsentlige lignende resultater. Således Dox behandling (Dox +) reducerede HIPK2 mRNA-ekspression som signifikant korreleret med COX-2-opregulering, som også fremgår af den densitometriske analyse (fig. 1D). Efterfølgende reversion af HIPK2 tømt af Dox fjernelse (Dox -), gendannes de COX-2 genekspressionsniveauer lighed med udgangs COX-2 niveauer af kontrolceller, som også fremgår af densitometriske analyser (Fig 1D.). Dernæst viste Western immunoblotting forøget COX-2-proteinniveauer i RKO HIPK2-udtømte celler, sammenlignet med kontrol siRNA celler (Fig. 1E). Disse resultater viser for første gang, en omvendt korrelation mellem HIPK2 og COX-2-ekspression i colon cancerceller som blev intriguingly bekræftet ved at probe det Oncomine datasæt af normale og cancer væv, hvilket indikerer, at dette kan være en typisk cancer signatur. Endvidere kan der også tages virkningen af ​​COX-2-opregulering i brystcancerceller efter HIPK2 inhibering i betragtning.

(A) repræsentant RT-PCR analyse af kontrol- RKO-siRNA og RKO-siHIPK2 celler transficeret med HIF -1α dominant negativ (HIF-1αDN) i 36 timer. COX-2 og VEGF-mRNA-niveauer er vist. β-actin blev anvendt som intern kontrol. (B) RT-PCR-analyser af RKO-siHIPK2 celler blev transficeret med specifikke siRNA for HIF-1α knockdown eller kontrol siRNA. Efter transfektion totalt RNA blev ekstraheret og RT-PCR blev udført for at vurdere HIF-1α, COX-2 og VEGF ekspressionsniveauer. β-actin blev anvendt som intern kontrol. Et repræsentativt eksperiment ud af tre uafhængige forsøg blev vist. (C, venstre panel) RT-PCR-analyser af RKO-siHIPK2 celler transficeret med VHL ekspressionsvektor (+) eller med tom vektor (-). Efter transfektion totalt RNA blev ekstraheret og RT-PCR blev udført for at vurdere COX-2 og VEGF ekspressionsniveauer. β-actin blev anvendt som intern kontrol. (C, højre panel) Densitometrisk analyse af COX-2 og VEGF-niveauer (som i det venstre panel) blev udført, og normaliserede værdier for p-actin mRNA niveauer blev plottet. * P = 0,001. (D) 293-celler blev transficeret med HIF-1α ekspressionsvektor (+) eller med tom vektor (-). Efter transfektion totalt RNA blev ekstraheret og RT-PCR blev udført for at vurdere HIF-1α, COX-2 og VEGF ekspressionsniveauer. β-actin blev anvendt som intern kontrol. Et repræsentativt eksperiment ud af tre uafhængige forsøg blev vist.

Styrkelse af COX-2 ekspression i HIPK2 Knockdown celler via HIF-1α

En af de mekanismer, der forbedrer COX-2 transskription er gennem HIF-1-aktivitet [20]. HIPK2 knockdown inducerer HIF-1-aktivitet, set som forøget VEGF gentransskription og angiogenese, ved derepressing HIF-1α promotor transkription [6]. For at undersøge, om HIF-1α er involveret i COX-2-ekspression, blev udført flere genetiske tilgange. RKO stabilt blandede sig for HIPK2 funktion (siHIPK2) var hovedsageligt brugt og transfektionseffektiviteten blev overvåget med brug af en cotransficeret GFP vektor hele eksperimenterne. At undersøge virkningen af ​​HIF-1α på COX-2 gentransskription, vi først udført tab-af-funktion eksperimenter med en dominant negativ HIF-1α (HIF-1αDN) konstruktion uden DNA-binding og transaktivering domæne, som inhiberer HIF-1 aktivitet [32]. RT-PCR-analyse viste, at HIF-1αDN ekspression markant reduceret niveauerne af COX-2 i RKO-siHIPK2 celler (Fig. 2A), hvilket tyder HIF-1 transkription-afhængige COX-2 regulering. Denne virkning blev parallel med den ene observeret på HIF-1 målgen VEGF (fig. 2A). Derefter, HIF-1α depletion i RKO-siHIPK2 celler efter specifikt siRNA interferens viste, at HIF-1α nedregulering inhiberes kraftigt både COX-2 og VEGF-genekspression (fig. 2B). Som en yderligere fremgangsmåde til at inhibere HIF-1-aktivitet, overudtrykkes vi von Hippel-Lindau (VHL) protein, der har vist sig at inhibere HIF-1-aktivitet ved at målrette HIF-1α til proteasomalaktivitet nedbrydning [33]. Som vist i fig. 2C, VHL overekspression i RKO-siHIPK2 celler induceret effektiv COX-2 samt VEGF nedregulering, som det fremgår af densitometrisk analyse. Endelig yderligere at bekræfte virkningen af ​​HIF-1 i COX-2 regulering, transficerede vi HIF-1α ekspressionsvektor i 293-celler at observere, at der var en signifikant forøgelse af både COX-2 og VEGF-mRNA-ekspression, sammenlignet med kontrolceller (fig . 2D). Tilsammen disse resultater giver stærke beviser for, at COX-2 opregulering efter HIPK2-knockdown, afhang, al fald delvist, på HIF-1-aktivitet som bekræftet af effekten observeret på HIF-1- målgen VEGF.

(A) 293-celler blev transficeret med HIF-1α ekspressionsvektor (+) eller med tom vektor (-). HIF-1a-transficerede celler blev behandlet med ZnC

2 (100 uM). 24 timer efter behandling blev celler opsamlet i delt i to for både RNA og protein analyser. RT-PCR blev udført for at vurdere COX-2 og VEGF ekspressionsniveauer (øvre panel). 28S blev anvendt som intern kontrol. Total celleekstrakter blev analyseret ved immunblotting (I.B.) for at vurdere HIF-1α proteinniveauer. L.C. (Lastning kontrol). (B) RKO-siHIPK2 celler blev behandlet med ZnC

2 (100 uM) i 24 timer. Efter transfektion totalt RNA blev ekstraheret og RT-PCR blev udført for at vurdere COX-2 og VEGF ekspressionsniveauer. β-actin blev anvendt som intern kontrol. Et repræsentativt eksperiment ud af tre uafhængige forsøg blev vist. (C) Total celleekstrakter fra RKOsiHIPK2 ubehandlet eller behandlet med ZnC

2 (100 uM) i 24 timer blev analyseret ved Western immunblotting at vurdere COX-2-proteinniveauer. β-actin blev anvendt som protein lastning kontrol.

Zink nedregulerer COX-2 Expression Niveauer i HIPK2 udtømte Celler

Vi har tidligere vist, at zink-ioner tilskud i konstitutivt hypoxiske prostatacancerceller eller i angiogene glioblastomceller nedregulerer HIF-1α ekspression dermed inhibere HIF-1-aktivitet [8]. Dette fund var næste underbygget af et genom-dækkende analyser, hvor zink faktisk modvirker genekspressionsprofilerne induceret af hypoxia-aktiverede HIF-1 [34]. Her vi først overudtrykt HIF-1α i 293-celler og analyseret mRNA-niveauer ved semikvantitativ RT-PCR før og efter zink behandling. Som vist i fig. 3A, HIF-1-induceret COX-2 og VEGF-genekspression blev effektivt inhiberet af zink behandling. HIF-1α overekspression og dets nedregulering efter zink behandlinger, som tidligere rapporteret [8], blev vist ved Western immunoblotting (I.B.) (fig. 3A, nedre panel). Derefter, zink behandling af RKO-siHIPK2 celler viste signifikant reduktion af både COX-2 og VEGF-mRNA-genekspression med RT-PCR-analyse (fig. 3B). Følgelig Western immunoblotting bekræftet COX-2 nedregulering i HIPK2 udtømte celler efter zink behandling (fig. 3C). Af note, har i vore hænder zink behandling (100 uM i 24 timer) påvirker ikke cellernes levedygtighed (data ikke vist). Fordi COX-2 ofte er opreguleret i tumorer, der fører til tumor aggressivitet og dårlig prognose [14], rettet mod COX-2 kan være et vigtigt skridt i kræftbehandling. Således har COX-2 selektive hæmmere vist potente antitumor effekt i flere forskellige dyremodeller for kolorektal cancer; i aftale, sletning af COX-2 gen resulterer i et markant fald af adenom byrde i både små og tyktarmen i

Apc

Δ716

mutant mus og i

Apc

min

mus [35]. Alligevel selektive COX-2-hæmmere viste sig at være yderst effektive i forebyggelsen polyp gentagelse kan de forbundne negative kardiovaskulære bivirkninger ved disse lægemidler påvirker passende randomiserede kliniske forsøg [36], [37]. Derfor er det obligatorisk at udvikle nye tilgange til at målrette COX-2-funktionen. I denne henseende kan anvendelsen af ​​zink i nedregulere HIF-1-induceret COX-2-ekspression repræsenterer et interessant udgangspunkt for at overvinde de negative virkninger af mindst nogle specifikke COX-2-inhibitorer; desuden ved at handle på HIF-1-aktivitet zink kan påvirke flere sammenkoblede signalveje. Endelig, uanset om zink kan hæmme COX-2 også uafhængigt af HIF-1 skal yderligere belyst.

(A) PGE

2 produktionen blev analyseret ved ELISA i RKO-siRNA kontrol celler ubehandlet og i HIPK2 udtømte celler (siHIPK2) før og efter ZnC

2 behandling (100 uM i 24 timer), og efter behandling med COX-2 specifikke inhibitor NS-398 (50 nM) i 24 timer. PGE

2-produktion blev afbildet som pg /10

6 celler. Kolonner, gennemsnit af to uafhængige forsøg udført i to eksemplarer ± standardafvigelse. * P 0,001. (B) Total celleekstrakter fra RKO-siRNA kontrolceller ubehandlet og HIPK2 depleteret celler (siHIPK2) før og efter ZnC

2 behandling (100 uM i 24 timer) blev analyseret ved Western immunblotting at vurdere COX-2, β- catenin, og cyclin D1 proteinniveauer. β-actin blev anvendt som protein loading kontrol. (C) VEGF-produktion blev analyseret ved ELISA i RKO-siRNA kontrolceller og i HIPK2 udtømte celler (siHIPK2) før og efter ZnC

2 behandling (100 uM i 24 timer). VEGF-produktion blev afbildet som pg /10

6 celler. Kolonner, gennemsnit af to uafhængige forsøg udført i to eksemplarer ± standardafvigelse. * P. 0,001

Zink Forhindrer PGE

2 signalveje i HIPK2-udtømte celler

Efter at have fastslået, at zink kan nedregulere COX-2 niveauer i HIPK2 udtømte celler, vi siden søgte at evaluere PGE

2 modulation. ELISA-assay viste, at den relevante mængde PGE

2 produceret af HIPK2 forarmet sammenlignet med kontrolceller, som tidligere rapporteret [10], blev signifikant inhiberet af zinktilskud (fig. 4A). Interessant, zink-induceret PGE

2-inhibering var så effektiv som den specifikke COX-2-inhibitor NS-398 (fig. 4A). Efter aftale, viste western immunoblotting kraftig reduktion af COX-2 protein niveauer efter zink behandling (fig. 4B), som rapporteret ovenfor. Endvidere er de forøgede niveauer af β-catenin og dens target cyclin D1 i HIPK2 udtømte celler, som tidligere rapporteret [3], [4], blev markant inhiberet af zink behandling (fig. 4B), som parallelt ovennævnte PGE

2-inhibering. Dette er et interessant korrelation, fordi PGE

2 er blevet vist at aktivere β-catenin som transkriptionsfaktor at inducere ekspressionen af ​​adskillige gener, herunder COX-2 og cyclin D1, genererer en positiv autoregulatorisk løkke, der favoriserer tumorprogression [12 ], [38].

(A) Lysmikroskopi viser kontrol differentieret DC’er (Mock, panel 1) og hæmning af differentierede DC’er morfologi under tilstedeværelse af CM for siRNA kontrol (panel 2) eller HIPK2 depleteret celler ( siHIPK2) (panel 3); denne inhibering ikke finde sted, hvis DC’er hvor dyrkes i nærvær af CM af zink-behandlede siHIPK2-CM (felt 5) sammenlignet med CM af zink-behandlede siRNA kontrolceller (panel 4). Et repræsentativt eksperiment ud af tre uafhængige forsøg blev vist. Mikrofotografi forstørrelse, 10 ×. (B) Analyse af overflade- DC’er modning markører, CD80 og CD86, ved hjælp af flowcytometri. DC Mock: styre modne DC’er; DC + siRNA-CM: DC’er modning i nærvær af CM for siRNA kontrolceller; Som vist i fig. Som vist i fig.