PLoS ONE: glykolytisk Skift i Reaktion på Betulinsyre i Non-Cancer Cells

Abstrakt

Den naturligt forekommende triterpenoid betulinsyre (BA) viser udtalt polypharmacology spænder fra anti-inflammatorisk anti-lipogene aktiviteter. De seneste oplysninger tyder på, at temmelig forskelligartede cellulære signalering begivenheder kan tilskrives den samme fælles opstrøms skifte i cellulære stofskifte. I denne undersøgelse undersøgte vi derfor de metaboliske forandringer som følge af BA (10 uM) administration, med fokus på cellulære glukosemetabolismen. Vi viser, at BA hæver satserne for cellulær glukoseoptagelse og aerob glykolyse i muse embryonale fibroblaster med samtidig reduktion af glukose oxidation. Uden at fremkalde tegn på synlig celledød BA fører til kompromitteret mitokondriefunktion, forøget ekspression af mitochondriale frakobling proteiner (UCP) 1 og 2, og lever kinase B1 (LKB1) -afhængig aktivering AMP-aktiveret proteinkinase. AMPK aktivering tegner sig for den øgede glukoseoptagelse og glykolysen, som igen er uundværlige for cellelevedygtighed på BA behandling. Samlet set viser vi for første gang en betydelig indvirkning på BA på cellulære bioenergetik som kan være en central formidler af de pleiotrope virkninger af BA

Henvisning:. Heiss EH, Kramer MP, Atanasov AG, Beres H, Schachner D, Dirsch VM (2014) glykolytisk Skift i reaktion på betulinsyre i ikke-kræftceller. PLoS ONE 9 (12): e115683. doi: 10,1371 /journal.pone.0115683

Redaktør: Mika Jekabsons, University of Mississippi, USA

Modtaget: 18 juni 2014 Accepteret: December 1, 2014; Udgivet: 22 December, 2014

Copyright: © 2014 Heiss et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Austrian Science Fund (tilskud nummer 23.317) til EHH Herzfelder ‘sche Familienstiftung til EHH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

betulinsyre (3β-3-hydroxy-lup-20 (29) -en-28-syre, BA) er et naturligt forekommende pentacyklisk triterpenoid med en mangesidet aktivitetsprofil. Flere undersøgelser viste, blandt andre antivirale, anti-proliferative, pro-apoptotiske, antiinflammatoriske, vasoprotective, samt anti-diabetiske og anti-lipogene ejendomme til BA og dets derivater både

in vitro

in vivo

[1] – [11]. I overensstemmelse med overflod af rapporterede bioaktiviteter er blevet foreslået flere molekylære mål, herunder den nukleare KB – [12], sterol regulatoriske element bindende protein – [7], og endotel NO syntase vej [5], mitokondrier permeabilitet overgang pore (MPTP) [13], diacylglycerolacyltransferase [14], den Tgr5 galdesyre receptor [6], lipaser [15] eller proteintyrosinphosphatase 1B [16].

det er for nylig blevet mere og mere klart, at den metaboliske program er ikke en passiv tilskuer, men en aktiv modulator af signaltransduktion og en celles fænotype [17]. En ændring i den metaboliske program kan påvirke på en gang flere og ved første øjekast uafhængige signalveje, f.eks ved at give eller begrænse pivotale substrater for anabolisme, cytobeskyttelse eller posttranslationelle modifikationer, og ses som en central opstrøms faktor for cellulær adfærd [18].

hypoteser, at nogle af de bioaktiviteterne udøvet af BA er en konsekvens af ændret bioenergetik vi satte os for at undersøge virkningen af ​​BA på glukosemetabolismen.

Materialer og metoder

Cells, kemikalier og antistoffer

Vild type (WT) og isogene AMPKα

1 – /- mus embryonale fibroblaster (MEF) og WT og LKB1 – /- MEF var venlige gaver fra Benoit Viollet, INSERM Paris, Frankrig og Reuben Shaw, Scripps Institute, La Jolla, USA, rapporteret i [19] og [20] , henholdsvis. Murint 3T3-L1, C2C12, RAW 264.7-celler var fra LGC /ATCC (Wesel, Tyskland). Primære humane endotelceller (HUVEC) var fra Lonza (Braine-L’Alleud, Belgien). Betulinsyre (99% renhed) blev købt fra Biosolutions Halle GmbH (Halle, Tyskland). Tritium-mærket 2-deoxyglucose (DOG) blev leveret af NEN (Wien, Østrig). Den CellTiterGlo, den CaspaseGlo- og CytoTox96 ikke-radioaktive cytotoksicitetsanalyser kom fra Promega (Mannheim, Tyskland). MitoTracker Green og MitoSox Red blev indkøbt fra Invitrogen (Wien, Østrig). Særlige cellekultur plader, patroner, kalibrant løsning samt glycolyse og mitokondrie stress test kits blev bestilt fra Seahorse Biosciences. STO609 kom fra Calbiochem. Primær anti-AMPK (# 2532), anti-pAMPK (Thr172) (# 2535), anti-pACC (Ser79) (# 3661), anti-LKB1 (# 3047) anti-PDHE1 (# 2784) samt antistoffer rettet mod glycolytiske enzymer (glycolysen sampler kit) kom fra Cell Signaling Technology (Frankfurt am Main, Tyskland). De anti-Glut1 og GLUT3 antistoffer kom fra Millipore (Wien, Østrig) (# CBL242; # AB1344), anti UCP1 eller 2 antistoffer blev bestilt fra Abcam (Cambridge, UK) (# 10983, 77.363), anti-p -PDHE1 (Ser273) var fra Novus Biologicals (Cambridge, UK) (# NB11093479) og anti-actin antistof var fra mpbio (Eschwege, Tyskland) (# 69100). Sekundær peberrodsperoxidase (HRP) -coupled anti-kanin- og anti-mus antistoffer kom fra Cell Signaling Technology og mpbio henholdsvis og HRP-anti-gede-antistof var fra Santa Cruz (Heidelberg, Tyskland). Alle andre kemikalier var fra Sigma-Aldrich (Wien, Østrig). Alle testforbindelser eller inhibitorer blev opløst i DMSO, beskyttet mod lys så vidt muligt, alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C. Til cellebaserede forsøg blev slutkoncentrationen af ​​DMSO holdes konstant i alle prøver og aldrig oversteg 0,3% DMSO.

Dyrkning af celler

Bortset HUVEC-celler blev rutinemæssigt subdyrket i Dulbeccos modificerede essentielle medium ( DMEM, 4,5 g /l glucose fra Lonza) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (Invitrogen) og 2 mM glutamin (Lonza). HUVEC-celler blev dyrket i endotel-vækstmedium (EGM1) og supplerer leveres af Lonza. For differentiering af 3T3-L1-celler til modne adipocytter og C2C12 myoblaster til myotuber standardprotokoller blev anvendt som beskrevet andetsteds [21], [22]. Cellerne blev rutinemæssigt testet som mycoplasma-fri og holdes i kultur 11 passager (for primær HUVEC 5).

Bestemmelse af den cellulære glukoseoptagelse rate

Bestemmelse af den cellulære glukoseoptagelse sats blev udført som tidligere beskrevet [23]. Kort beskrevet blev celler fremstillet i 12-brønds plader. Efter behandling som angivet celler blev ækvilibreret i standard Krebs Ringer phosphat HEPES (KRPH) puffer indeholdende 0,2% bovint serumalbumin (BSA) i 20 minutter. Den glucoseoptagelse blev initieret ved tilsætning af 2-DOG tilsat 2-deoxy-D- (1H3) glucose (slutkoncentrationer 0,1 mM og 0,45 pCi /ml). Efter 15 minutter blev reaktionen stoppet ved tre hurtige vaske med iskold PBS. Den glucoseoptagelse blev bestemt ved væskescintillationstælling (Perkin Elmer, Brunn am Gebirge, Østrig) af cellelysater (lysis med 0,05 N NaOH i PBS), normaliseret til proteinindholdet vurderet af Rotiquant ™ (Carl Roth, Karlsruhe, Tyskland) proteinanalyse og optagelse tid (for at få inkorporeret radioaktivitet pr mg protein og minut) og korrigeret for den ikke-transporter-medieret glukoseoptagelse (som ikke inhiberes af co-behandling med cytochalasin B (10 uM) under optagelsen procedure). Oligomycin A (2 pM, 4 h) tjente som positiv kontrol for øget basal glukoseoptagelse.

Vurdering af potentielle cytotoksicitet via bestemmelse af frigivet lactatdehydrogenase (LDH), ATP-niveauer, caspase spaltning og biomasse

MEF’er blev dyrket i plader med 96 brønde (podningsdensitet 2,5 x 10

4 celler /brønd). Efter behandling som angivet bestemt vi udgivelsen af ​​LDH (foranstaltning for membran integritet), ATP-niveauer (foranstaltning for celle levedygtighed) og caspase spaltning (foranstaltning for apoptose induktion) med CytoTox96 Non Radioaktivt cytotoksicitetsanalyse, den CellTiterGlo Selvlysende Cell Levedygtighed Assay og CaspaseGlo 3/7 Luminescent Assay hhv. Alle sæt blev udført ifølge de tilvejebragte protokoller. Biomasse blev farvet ved at hælde medium og inkubering vedhæftede celler med krystalviolet-opløsning (0,5% (w /v) krystalviolet /20% (v /v) MeOH) i 5-10 minutter. Efter grundig vask trin med postevand (for at slippe af med overskydende farvestof) og tørring af bundne farvestof blev opløst med en alkoholisk citratopløsning (0,05 M citrat /50% (v /v) EtOH) og kvantificeret ved absorbanslæsninger på 595 nm. Absorbans og luminescens blev overvåget i et Tecan (Grödig, Østrig) Sunrise og GeniosPro pladelæser hhv. Triton (1%), staurosporin (1 uM) eller en kombination af oligomycin A (2 uM) og HUND (10 mM) tjente som positive kontroller for de respektive analyser.

Nuclear faktor E2-relateret faktor 2 ( Nrf2) -afhængig reportergenassay

Nrf2-afhængigt reportergen assay var baseret på luciferaseekspression udløst af den aktiverede antioxidant responselementet (ARE) af murin glutathion

S

transferase og udført som tidligere beskrevet [24]. CDDO-IM, en syntetisk triterpenoid (100 nM), tjente som positiv kontrol og blev venligst stillet til rådighed af Michael Sporn, Geisel School of Medicine ved Dartmouth, Hanover, NH, USA.

Ekstracellulær flux analyse til bestemmelse af glykolytisk og respiratoriske kapacitet

MEF blev podet i passende collagen-coatede 24-brønds cellekulturer plader (fra Seahorse Biosciences; København, Danmark) celledensitet 2,7 x 10

4 celler /brønd). Efter behandling som angivet celler blev holdt i serumfrit medium (DMEM plus 2 mM glutamin, 0 mM glucose, 0 (glycolyse stresstest) eller 2 (mitokondrie stresstest) mM pyruvat, pH 7,35-7,40) ved 37 ° C og omgivende CO

2 i en time, før de blev udsat for glykolysen (udlæsning: ekstracellulær forsuring rate (ECAR) i mph /min) og mitokondrie (udlæsning: ilt forbrug sats (OCR) i pmol O

2 /min) stresstest . Passende testkit kom fra Seahorse Biosciences, blev udført i henhold til fabrikantens anvisninger og analyseret på en Seahorse 24XF

e ekstracellulære flux analysator og Wave software (www.seahorsebio.com). Optimeret inhibitorkoncentrationer for MEF var 2 uM oligomycin A, 1,5 uM carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP), 1 uM rotenon A, 1 pM antimycin A, og 100 mM 2-DOG. Normalisering til celle masse blev rutinemæssigt udført af krystalviolet farvning efter analysen for at tage højde for potentielle forskelle i celle nummer.

Bestemmelse af den ekstracellulære laktat som markør for glycolyse

MEF blev udarbejdet i 24-brønds plader. Efter behandling som angivet celler blev vasket med PBS og derefter inkuberet med standard Krebs Ringer phosphat HEPES (KRPH) puffer suppleret med 0,2% BSA og 10 mM glucose i 2 timer. Derefter supernatanter blev analyseret for deres lactat indhold via et enzym-koblet fluorescens assay, og celler blev lyseret og et proteinindhold på bestemtes. Kort beskrevet et volumen supernatant (som regel fortyndet 1:20) blev blandet med et volumen assaybuffer (KRP puffer med 10 pM Amplex Red, 1 U /mL lactatoxidase og 2,5 U /ml peberrodsperoxidase), inkuberet i 10 minutter og derefter læse i en flourimeter ved en excitationsbølgelængde på 535 nm og emissionsbølgelængde på 590 nm. Parallel overvågning af opløsninger med kendte koncentrationer af laktat lettet en endelig udlæsning af mol laktat /g protein * min.

Flow-cytometrisk bestemmelse af mitokondrie indhold og mitokondrie reaktive ilt arter (ROS) produktion

MEF blev dyrket i 12 eller 6- brønde (podningsdensitet 1,5 × 10

4 eller 3 × 10

4 celler per brønd) og behandlet som angivet. Til bestemmelse af de mitochondriale indhold celler blev farvet med 50 nM MitoTracker Green (Invitrogen) i 20 minutter og derefter analyseret i den grønne kanal (FL1, ex 488 nm; em 530/30 nm) af FACS Calibur (BD Biosciences, Schwechat, Østrig). Den vilkårlige gennemsnit af grøn fluorescens blev taget som mål for mitokondrie indhold efter korrektion for autofluorescens [25], [26]. Valinomycin tjente som kontrol for den potentielle-uafhængighed MitoTracker Green signal. Til bestemmelse af mitokondrielle ROS produktionsanlæg celler blev inkuberet med 5 uM MitoSox Rød (Invitrogen) i 10 minutter og derefter analyseret for deres autofluorescens-korrigerede rød fluorescens (FL2-kanalen, ex 488 nm; em 585/42 nm) i flowcytometeret. Den vilkårlige gennemsnit af rød fluorescens blev taget som udlæsning for produceret mitokondrie ROS. Antimycin A (2 uM) tjente som positiv kontrol i dette assay.

Protein ekstraktion, SDS-polyacrylamid-elektroforese og immunoblotanalyse

MEF’er blev fremstillet i 6-brønds plader og behandles som anført. Immunoblotanalyse herunder protein udvinding, gel køre, overførsel, immundetektion og densitometrisk evaluering blev udført som beskrevet andetsteds [23]. Til påvisning af GLUT1 og 3 prøver blev ikke kogt før elektroforese for at forhindre aggregering og præcipitation. Til påvisning af proteiner af lignende størrelse (f.eks phosphorylerede form i forhold til samlet protein) to identiske membraner ud af de samme proteinekstrakter blev fremstillet og evalueret for at undgå potentielle artefakter eller tvetydige signaler på grund af ufuldstændig stripping.

Statistik

til statistiske analyser blev udført eksperimenter mindst tre gange (n≥3, uafhængige forsøg (biologiske gentagelser)). Bar grafer skildrer middelværdi + SD. To grupper blev sammenlignet ved anvendelse af Students t-test blev flere grupper analyseret ved én-eller to-vejs ANOVA afhængigt af antallet af variabler i de undersøgte datasæt efterfulgt af Dunnetts eller Bonferroni post hoc test. Alle statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism. Forskelle med p-værdier. 0,05 blev betragtet som signifikant og er udpeget med *

Resultater

BA stiger cellulære glukoseoptagelse

Først vurderede vi den cellulære glukoseoptagelse sats efter behandling med BA i forskellige celletyper, herunder primære humane endotelceller (HUVEC), udødeliggjorte murine makrofager (RAW264.7), differentieret muse myo (C2C12) – og adipocytter (3T3-L1) samt murine embryonale fibroblaster (MEF). Vi konsekvent observeret en forøget basal glucoseoptagelse i alle celletyper med ca. 50 til 100% (Fig 1A.) Med BA ved en koncentration på 10 uM (quasi-optimal koncentration for alle brugte cellelinier som bestemt ved koncentration-respons eksperimenter; S1 fig.). Oligomycin A, en inhibitor af mitokondriel ATP syntase, blev anvendt som positiv kontrol. Disse resultater foreslog en generel og celle-typen uafhængig stigning af glukose inkorporering af BA. Tilsætning af mættende koncentrationer af insulin til differentierede adipocytter og myocytter, to store insulinfølsomme glucose bortskaffelse celletyper, ført til øget cellulær glukoseoptagelse oven på BA virkning (fig. 1B), der peger på et insulin-uafhængig virkning af BA.

(A) Forskellige celletyper (differentierede adipocytter (3T3-L1), differentierede myorør (C2C12), endotelceller (HUVEC), makrofager (RAW264.7) og murine embryonale fibroblaster (MEF)) blev behandlet med 10 uM BA (+) eller 0,1% DMSO (-) i 16 timer før deres cellulære glukoseoptagelse blev bestemt som beskrevet. Oligomycin A (OL, 2 pM i 4 timer) tjente som positiv kontrol for øget basal glukoseoptagelse. Søjlediagrammet viser glucoseoptagelse satser i forhold til middelværdien af ​​den respektive DMSO-kontrol (n = 3 (det vil sige tre uafhængige forsøg, der hver i triplikat); * p 0,05 vs DMSO ctrl, ANOVA). (B) De opdelte adipocytter (venstre) og myocytter (højre) blev behandlet med BA (10 uM) i 16 timer forud for serumudsultning og insulin-stimulering (15 min; 3T3-L1 15 nM insulin; C2C12: 100 nM insulin). Derefter cellulær glukoseoptagelse blev bestemt. Søjlediagrammer skildre glucoseoptagelse satser i forhold til middelværdien af ​​den respektive ustimulerede vehikelkontrol. (N = 3 (dvs. tre uafhængige forsøg, hver i tre eksemplarer), middelværdi + SD, * p 0,05 vs ustimuleret DMSO ctrl, ° p 0,05 vs insulin-stimuleret DMSO ctrl, to-vejs ANOVA, Bonferroni). Oligomycin A (OL, 2 uM i 4 timer) fungerede som positiv kontrol for øget basal glukoseoptagelse.

BA ikke inducerer celledød i MEF

Som øget glukoseoptagelse kan indikere cellulær stress og cytotoksicitet, og BA er blevet vist at udøve pro-apoptotiske virkninger i forskellige (kræft) celletyper, vi næste afgøres, om den observerede forhøjede glukoseoptagelse er forbundet med efterfølgende celledød. Vi behandlede MEF, den celletype, der er valgt til alle yderligere undersøgelser, med 10 pM BA i 48 timer og bestemmes den relative frigivelse af lactatdehydrogenase (LDH; forholdet mellem ekstracellulært og total) som udlæsning til celledød og membran disintegration (figur 2A.) , aktivering af caspaser som udlæsning til apoptose induktion (fig. 2B), ATP-niveauer som tegn på generel cellelevedygtighed (fig. 2C) og binding af krystalviolet så simpelt biomasse farvning (fig. 2D). BA på 10 uM og 30 uM inducerede ikke nogen væsentlige ændringer i forhold til DMSO-behandlede kontrol celler. Således observerede øget glukoseoptagelse på BA eksponering er usandsynlig på grund af forestående celledød. Desuden har BA ikke udløse aktivering af transkriptionsfaktoren nuklear faktor E2 relateret faktor 2 (Nrf2) som vist i en Nrf2-afhængigt reportergen assay. Nrf2 aktivering er kendt som indikator for et cellulært stress respons ved eksponering for xenobiotika (S2 Fig.). Manglen på toksicitet op til koncentrationer på 30 uM kunne også bekræftet for endotelceller, adipocytter og myocytter (S3 Fig.), Og støtter det generelle begreb af kræft-selektive toksicitet BA.

MEF blev behandlet med BA (10 uM og 30 uM) i 48 timer, før de blev underkastet bestemmelse af membranintegritet (% LDH-frigivelse) (A), potentiale proapoptotiske hændelser (aktivering af caspase 3/7) (B), af ATP-niveauer (C ) og biomasse (D). Søjlediagrammer skildre samling af tre uafhængige forsøg (udtrykt som fold af DMSO middelværdi i B, C og D), hver i fire eksemplarer (middelværdi + SD, * p 0,05, ANOVA, Dunnetts slutværdierne versus DMSO ctrl). Staurosporin (Stauro, 1 uM i 6 timer), triton (1% i 1 time) eller en kombination af oligomycin A (OL; 2 uM) og hund (10 mM; 5 h) tjente som positive kontroller i assayene

BA hæver aerob glykolyse

Næste vi var interesserede i stofskiftet af den indtagne glukose. Den glycolytiske sats blev undersøgt ved hjælp af ekstracellulær flux analyse. Vi observerede, at BA-behandlede celler viste en signifikant højere ekstracellulær forsuring rate (ECAR) ved tilsætning af glucose end deres vehikelbehandlede modparter (fig. 3A og B). I en supplerende analyse bestemme ekstracellulære laktat niveauer konsekvent overvåget vi forhøjet laktat produktion af BA-behandlede celler (S4 Fig.). Disse resultater indikerer en højere glykolytisk sats i BA-behandlede celler og udelukkede en påvirkning af en formodet membranøs V-ATPase til den observerede forsuring. Den maksimale glykolytisk kapacitet (ECAR efter oligomycin tilføjelse og hæmning af mitokondrie ATP produktion) er sammenlignelig mellem DMSO og BA-behandlede celler. Derfor BA-behandlede celler besidder en signifikant nedsat glykolytisk ekstra kapacitet (ΔECAR

maksimumstemperatur- ECAR

basal) (fig. 3B). Disse data viser, at BA driver celler mod fuld udnyttelse af deres glykolytisk potentiale i unåde af glukose oxidation (fig. 3C). En observeret øget phosphorylering af pyruvatdehydrogenase E1 (PDHE1) yderligere hentydet til et glycolytisk switch ved BA behandling. Phosphorylering gør PDHE1 mindre aktive og forstyrrer oxidativ decarboxylering af pyruvat til acetyl-CoA begunstige pyruvat reduktion til lactat (fig. 3D). Dog vil der blive behov for yderligere forsøg for at entydigt vurdere, i hvilket omfang PDHE fosforylering bidrager næsten maksimal glykolyse i BA-behandlede celler. Ekspressionsniveauet af adskillige undersøgte glycolytiske enzymer blev ikke ændret (S5 fig.), Som imidlertid ikke udelukker en ændret enzymatisk aktivitet på grund af covalent eller allosterisk modifikation. Udtrykket af glukose transportør GLUT1 blev ophøjet på BA behandling i 16 timer mens niveauerne af GLUT3 ikke blev ændret (fig. 3E). GLUT2 /4 var ikke påviselige i vores MEF.

MEF blev behandlet med 10 pM BA eller DMSO (0,1%) i 16 timer, før de blev udsat for en glycolyse stresstest som beskrevet under “Materialer og metoder”. I (A) den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) er afbildet ved at udsætte celler successivt til glucose (10 mM), oligomycin A (2 uM) og deoxyglucose (DOG, 100 mM) (gennemsnit + SD; kompileret rådata fra tre uafhængige forsøg med fire tekniske replikater hver). I (B) disse data analyseres med hensyn til basal (glykolytisk ECAR efter glukose tilføjelse), maksimal (glykolytisk ECAR efter oligomycin) og skåne (maksimal minus basal aktivitet) glykolytisk aktivitet (gennemsnit + SD, * p 0,05, t-test , DMSO vs. BA). Kvantificering baseret på værdien ved det endelige tidspunkt for hver behandling tilstand. I (C) værdier af OCR og ECAR (DMSO og BA-behandlede celler (16 h)) efter tilsætning af glucose blev plottet mod hinanden for at visualisere skiftet fra glucose oxidation til glycolyse. Den observerede skift ved tilsætning af oligomycin A føjes til plottet som reference. (D) MEF blev behandlet med DMSO (0,1%, D) og 10 uM BA for de angivne tidsperioder før totale cellelysater blev underkastet immunoblot analyser for pPDHE1 (Ser273) og total PDHE1 (molekylvægt 43 kDa). Repræsentative blots ud af tre forsøg er vist. Grafen nedenfor afbilder kompileret densitometriske værdier af pPDHE /PDHE (n = 3; middelværdi + SD; * p 0,05; t-test; DMSO vs BA ved hvert tidspunkt). (E) MEF blev behandlet med 10 pM BA eller DMSO (0,1%) i 16 timer, før de blev udsat for immunoblotanalyse for GLUT1 (-50 kDa), GLUT3 (~55 kDa) og actin (42 kDa). Repræsentative blots ud af tre uafhængige forsøg er vist. Grafen nedenfor afbilder kompileret densitometriske værdier af GLUT1 /actin og GLUT3 /actin henholdsvis (n = 3; middelværdi + SD; * p 0,05; t-test; DMSO vs BA ved hvert tidspunkt)

.

BA forringer mitokondrie funktion

som øget aerob glykolyse kan kompensere for en forringet ATP produktion ved oxidativ fosforylering vi næste undersøgt mitokondrie funktion efter BA behandling. Vi observerede øget produktion af mitokondrie ROS (Fig. 4A) og forhøjet ekspression af frakobling proteiner UCP1 og UCP2 i BA-behandlede MEF (fig. 4B). Det samlede mitokondrie indhold forblev upåvirket (fig. 4C). Ændret mitokondrie funktion blev bekræftet i et mitokondrie stresstest og ekstracellulær flux analyse. Celler udviste en let nedsat basal oxygenforbrugshastighed (OCR), et reduceret kobling af oxygenforbrug til mitokondrisk ATP-produktion (Δ (OCR

basal-OCR

oligomycin), formindsket maksimal respiration (OCR efter bortledning af protongradienten af FCCP), en reduceret respiratorisk uudnyttet kapacitet (Δ (OCR

maksimal-OCR

basal)), samt en øget proton lækage (Δ (OCR

oligomycin – OCR

a + R) ), når de behandles med BA i 16 timer (fig. 4E og F). Disse data indikerer, at behandling med BA forstyrrer mitokondriefunktion imidlertid mildt som nogen nedgang i cellelevedygtighed udløses af BA (se fig. 2). Tidsforløb eksperimenter viste, at ukoblet respiration (tydelig i faldet i OCR anvendes til ATP-produktion i S6A fig.) korrelerede med den tidsafhængige induktion af UCPs (S6B fig.). de spørgsmål, om UCP induktion udgør den observerede afkobling, eller om BA selv som temmelig hydrofobe molekyle med en pKa værdi på 5,5 er en svag afkobler brug for yderligere undersøgelse. Især ved korte inkubationer med BA (1-3 h) basal OCR tendens til at blive øget i forhold til DMSO kontrolceller som forventet for ukoblet mitokondriel respiration (S6A Fig.). Den senere reduktion af OCR set i BA-behandlede celler kan skyldes stadig undvigende adaptive eller yderligere mekanismer udløses af triterpenoid såsom spredning af mitochondriemembranpotential over tid eller en svækket elektronstrøm gennem den respiratoriske kæde.

(A) MEF blev behandlet med 10 pM BA eller 0,1% DMSO i 16 timer, før de blev udsat for flowcytometrianalyse af det mitokondrielle ROS produktion med anvendelse af MitoSox Red og antimycin (2 pM, 1 h), som positiv kontrol . (N = 3 (hver to eller tre gange); middelværdi + SD, * p 0,05, t-test). (B) MEF blev behandlet med DMSO eller 10 uM BA i 16 timer før totale cellelysater blev underkastet western blot-analyse for UCP1, UCP2 (bånd ved ~25-35 kDa) og actin (42 kDa) som ladningskontrol. Repræsentative blots af tre uafhængige forsøg er afbildet. Grafen nedenfor afbilder kompileret densitometriske værdier af UCP1 /actin og UCP2 /actin henholdsvis (n = 3; middelværdi + SD; * p 0,05; t-test; DMSO vs BA). (C) MEF blev behandlet med 10 pM BA eller 0,1% DMSO i 16 timer, før de blev udsat for flowcytometrianalyse af det mitokondrielle indhold ved hjælp MitoTracker Green. Valinomycin (200 nM, 16 h), en kendt disruptor af mitochondriemembranpotential tjente som kontrol for den potentielle-uafhængig signal af MitoTracker Green. MEF blev behandlet med 10 pM BA eller DMSO (0,1%) i 16 timer, før de blev udsat for en mitokondrisk stresstest som beskrevet under Materialer. I (D) den gennemsnitlige oxygenforbrugshastigheden (OCR) af tre uafhængige forsøg er afbildet ved eksponering af celler successivt til oligomycin (2 uM), FCCP (1,5 uM) og antimycin A + rotenon (A + R; 1 + 1 uM). I (E) disse data analyseres med hensyn til forbrug ilt sats under basale betingelser, iltforbrug for ATP syntese, maksimal respirationsfrekvens, reservedele respiratorisk kapacitet og proton lækage (gennemsnit + SD, * p 0,05, t-test, DMSO vs . BA).

BA aktiverer AMP-aktiveret protein kinase (AMPK)

Reduceret mitokondriefunktionen har været forbundet med aktivering af AMPK (revideret i [27]), en central metaboliske mester hub. AMPK aktivering kan desuden forklare en kompenserende øget glukoseoptagelse og glykolytisk sats [28], [29]. Vi undersøgte derfor, om BA fører til aktiverede AMPK. Brug af immunoblotanalyse vi observeret en forbigående boost af AMPK phosphorylering på threonin 172, indikerer forhøjet AMPK aktivitet i BA behandlede versus kontrolceller (fig. 5A). AMPK aktivering blev yderligere bekræftet ved forøget phosphorylering af acetyl-CoA-carboxylase (ACC) i serin 79, en fælles nedstrøms mål for AMPK. Anvendelsen af ​​isogene WT MEF og AMPK knockout modstykker afslørede, at øget glukoseoptagelse, forøget ekspression af glucosetransporter GLUT1 og forhøjet glucosemetabolisme via glycolyse var afhængig af tilstedeværelsen af ​​AMPK (fig. 5B, C, D). Imidlertid BA inducerede en sammenlignelig reduktion af mitokondriefunktion (fx reduktion af maksimal respiration med ca. 40% i forhold til DMSO-kontrol) i både WT og AMPK – /- MEF. Denne konstatering er tilføjet mitokondriel dysfunktion opstrøms for AMPK aktivering (fig. 5E) er i overensstemmelse med den observerede aktivering af AMPK, induktion af GLUT1, en forhøjet glucoseoptagelse og en forøget glycolytiske sats ved mild FCCP-indførte afkobling (S7 Fig.). Notatet AMPK – /- celler viste en generelt lavere ilt forbrug end WT MEF formentlig dels på grund af deres reducerede antal mitokondrier (S8 Fig.). Sammenligning WT og celler deficiente i lever kinase B1 (LKB1), AMPK kinase reagerer på en ændret AMP /ATP-forhold [30], foreslog LKB1 som den største AMPK kinase involveret: LKB1 – /- celler udviste formindsket AMPK phosphorylering i upon BA behandling (fig. 5F).

(A) MEF blev behandlet med DMSO (0,1%) eller BA (10 uM) for de angivne tidsperioder. Totale cellelysater blev underkastet immunoblotanalyse for pAMPK (Thr172) og total AMPK (60 kDa) (venstre felt) eller pAMPK (Thr172), pACC (Ser79) (~245 kDa) og actin (42 kDa) (højre panel). Repræsentative blots ud af tre uafhængige forsøg er afbildet. Graferne nedenfor skildre kompileret densitometriske værdier af pAMPK /AMPK eller pACC /actin henholdsvis (n = 3; middelværdi + SD, * p 0,05; t-test; DMSO vs BA ved hvert tidspunkt). WT og AMPK – /- MEF blev behandlet med DMSO eller BA (10 uM) i 16 timer. Så de cellulære glucose optagelseshastigheder (B) blev vurderet (n = 3 (i tre kopier); middelværdi + SD, * p 0,05, ANOVA, Dunnetts post-test vs DMSO ctrl), samt ekspressionsniveauerne af GLUT1 (50 kDa), AMPK (60 kDa) og actin (42 kDa) ved Western blot-analyse (C). En repræsentativ blot er afbildet af tre uafhængige forsøg. Grafen nedenfor afbilder kompileret densitometriske værdier af GLUT1 /actin, henholdsvis (n = 3; middelværdi + SD; * p 0,05; t-test; DMSO vs BA). I blev (D) celler underkastet bestemmelse af den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) som beskrevet i fig. 3. Repræsentative resultater af tre uafhængige forsøg (med tre tekniske replikater hver) er vist (middelværdi + SD, * p 0,05, t-test). (E) WT og AMPK – /- MEF blev behandlet med DMSO (0,1%) eller BA (10 uM) i 16 timer, før de blev udsat for en mitokondrie stresstest og ekstracellulære flux analyse. Indsamlede data af tre uafhængige forsøg er afbildet (middel + SD). (F) WT og LKB1 – /- MEF blev behandlet med BA (10 uM) for de angivne tidsperioder før totale cellelysater blev underkastet immunoblotanalyse for pAMPK (Thr172), AMPK (60 kDa), LKB1 (-50 kDa ) og actin (42 kDa). Repræsentative blots ud af tre uafhængige forsøg er afbildet. Nedenstående graf afbilder kompileret densitometriske værdier af pAMPK /AMPK henholdsvis (n = 3; middelværdi + SD, * p 0,05; ANOVA, Dunnett (vs 0 h behandling med BA)

Disse data. viste, at BA let nedsat mitokondriefunktionen, udløste AMPK aktivering via LKB1 som igen fremkaldte øget glukose indtag og skiftede cellulære glukosemetabolismen fra oxidation til aerob glykolyse.

BA gør celler afhængige af glukose

Nysgerrig ved konstateringen af, at BA driver celler ind forøget glycolytiske aktivitet vi næste testede, om BA afsmeltet celler glucose afhængig. til dette vurderede vi cellelevedygtighed (ATP-niveauer og biomasse) i MEF behandlet med vehikel eller BA i fravær og nærvær af glucose i 48 timer . for glucose-berøvet celler tilsat vi mannitol som osmotisk balance. DMSO-behandlede kontrolceller klaret godt med glucose depletion som tydeligt ved uændret biomasse og ATP-niveauer i forhold til “plus glucose” tilstand. i fravær af glucose disse celler viste endda en reproducerbar tendens til forhøjede ATP-niveauer, hvilket kan forklares ved tvungen mitokondrie oxidation af substrater (f.eks fedtsyrer, som findes i serum) med højere ATP udbytte end glukose.