PLoS ONE: Den Ekspression af ubiquitinligase SIAH2 (Syv in absentia Homolog 2) øges i Human Lung Cancer

Abstrakt

Mål

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Samlet 5-års overlevelse er vist en lille forbedring i de seneste årtier. Seven in absentia homologe (Siah) proteiner er E3 ubiquitin ligaser, som medierer proteasomalaktivitet proteinnedbrydning ved poly-ubiquitinering. Selvom Siah proteiner spiller en afgørende rolle i flere biologiske processer, deres rolle i human cancer forbliver kontroversiel. Formålet med undersøgelsen var at dokumentere SIAH2 ekspressionsmønster på forskellige niveauer (mRNA, protein niveau og immunhistokemi) i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) prøver sammenlignet med omkringliggende raske væv fra den samme patient, og at analysere association med klinisk-patologiske funktioner.

Materialer og metoder

et hundrede og halvtreds-to prøver fra en patient kohorte behandlet kirurgisk for primær lungecancer blev opnået for undersøgelsen. Fremkaldende og protein ekspressionsniveauer af SIAH2 blev analyseret og sammenlignet med klinik-patologisk variabler.

Resultater Salg

Den foreliggende undersøgelse er den første til at analysere SIAH2 ekspressionsmønsteret på forskellige niveauer (RNA, protein ekspression og immunhistokemi) i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Vi fandt, at SIAH2 proteinekspression signifikant forøget i human lunge adenocarcinom (ADC) og pladecelle lungecancer (SCC). Paradoksalt nok blev fundet ikke-signifikante ændringer på RNA-niveau, hvilket tyder på en post-traductional reguleringsmekanisme. Mere vigtigt blev øget korrelation mellem SIAH2 ekspression og tumorklassificering detekteret, hvilket antyder, at dette protein kan anvendes som prognostisk biomarkør at forudsige lungekræft progression. Ligeledes viste SIAH2 proteinekspression en stærk positiv korrelation med fluorodeoxyglukose (2-deoxy-2 (

18F) fluor-D-glucose) optagelse i primær NSCLC, som kan hjælpe klinikerne i stratificere patienter med øget samlede risiko for dårlig overlevelse. Derudover beskrev vi en omvendt korrelation mellem ekspression af SIAH2 og niveauerne af en af ​​dens substrater, serin /threonin kinase DYRK2.

Konklusioner

Vores resultater giver indsigt i den potentielle anvendelse af SIAH2 som en ny målsætning for lungekræft behandling

Henvisning:. Moreno P, Lara-Chica M, Soler-Torronteras R, Caro T, Medina M, Álvarez a, et al. (2015) udtryk for ubiquitinligase SIAH2 (Seven

in absentia

Homolog 2) øges i Human Lung Cancer. PLoS ONE 10 (11): e0143376. doi: 10,1371 /journal.pone.0143376

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Juli 6, 2015; Accepteret: November 4, 2015; Udgivet: November 18, 2015

Copyright: © 2015 Moreno et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Economía y Competitividad MICINN (SAF2010-17122) til MAC, Consejería de Salud (Junta de Andalucía) (PI-0650- 2010) til MAC, Consejería de Salud (Junta de Andalucía) (PI-0246-2013) til MAC, og Instituto de Salud Carlos III, Award nummer:. PIE14 /00005 (FLEXI-MET) til MAC

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser:. Siah, syv in absentia homolog; Ph.d.er, prolyl hydroxylaser; DYRK2, Dual-specificitet tyrosin- (Y) -phosphorylation reguleret kinase 2; SCC, pladecellekræft; ADC, Adenocarcinom; NSCLC, Ikke-småcellet lungekræft; PET /CT-scanninger, Positron emissions tomografi (

PET

) /computertomografi (CT) scanninger;

18FDG, 2-deoxy-2 – (

18F) fluor-D-glucose

Introduktion

Lungekræft fortsætter med at være den førende årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, tegner sig for næsten 1,4 millioner dødsfald om året [1]. I modsætning til bryst- eller prostatakræft, hvor overlevelse er forbedret betydeligt, samlet 5-års overlevelse for lungekræft har vist en lille forbedring i de sidste to eller tre årtier. Således er den relative 5-års overlevelse er 11-15% [2, 3], hvilket betyder, at 90% af patienterne vil dø af sygdommen.

Helbredende-intent pulmonal resektion giver den bedste mulighed for helbredelse når tumorerne er lokaliseret i lungen [4]. Desværre har de fleste af patienterne til stede med en fremskreden sygdom (stadium III og IV), er systemisk behandling med kemoterapi og /eller strålebehandling den mest gavnlige behandlingsmodalitet. I det sidste årti er der blevet beskrevet adskillige nye molekylære terapeutiske mål, men deres effektivitet og klinisk virkning er fortsat uklart [5]. Tilsammen disse data understreger behovet for nye og mere effektive behandlingsformer.

Seven i abstentia homolog (Siah) proteiner RING (virkelig interessant nyt gen) finger E3 ubiquitin ligaser, der medierer proteasomalaktivitet protein nedbrydning af poly-ubiquitinering [6]. Strukturelt Siah familie præsentere en divergerende N-terminale domæne, et stærkt konserveret katalytisk RING domæne, to zinkfinger-domæner og et substrat-bindende domæne [7-9]. Mus udtrykker tre medlemmer af familien, Siah1a, Siah1b og Siah2. To Siah proteiner er blevet identificeret hos mennesker, SIAH1 og SIAH2 [10, 11], der kan udøve forskellige funktioner i cellulære processer, herunder cellecykluskontrol, DNA skade responset, tumorgenese og metastase [12]. Adskillige Siah substrater er blevet beskrevet til dato, herunder hypoxi-regulerende familie af prolyl hydroxylaser (PHD’ere), PML, TRAF2, PPAR, AKAP121, HDAC3, DCC, HIPK2 og DYRK2 [13-15]. Derfor Siah proteiner er centrale aktører i biologiske processer som DNA skade responset, hypoxi vej, østrogen signalering, inflammation, apoptose, og tumor undertrykkelse [12, 15].

rolle Siah proteiner i human cancer stadig kontroversielt . På nuværende tidspunkt er antallet af undersøgelser, der linker ekspressionen af ​​Siah med udviklingen af ​​human cancer er meget begrænset, præsentere modstridende beviser, der klassificerer Siah proteiner enten som et onkogen eller som en tumorsuppressor. På den ene side har adskillige grupper vist et onkogent rolle for Siah proteiner, især SIAH2, i bryst- [16-18], prostata [19, 20] og leverkræft [21]. Tværtimod har Siah proteiner (især SIAH1) vist sig at virke som en tumorsuppressor ved brystcancer [22], gastriske tumorer [23] og leverkræft [24]. Dette kunne forklares som en konsekvens af specificiteten af ​​hver underenhed til at nedbryde forskellige substrater. Således kan vi konkludere, at hver underenhed spiller en anden rolle i tumorigenese kontrol, som er blevet for nylig gennemgået af Wong SF og Møller A [25].

Hovedsagelig på grund af den onkogene rolle SIAH2 i nogle typer af kræft, målene i vores aktuelle undersøgelse var at dokumentere for første gang mønsteret for SIAH2 udtryk på forskellige niveauer (mRNA, protein-niveau og immunhistokemi) i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) prøver sammenlignet med omkringliggende raske væv fra samme patient, og analysere dens tilknytning til klinisk-patologiske træk. Desuden blev korrelationen med ekspressionen af ​​en SIAH2 substrat, serin /threonin-kinase DYRK2 (Dual specificitet tyrosin-phosphorylering-kinase 2) [26] også undersøgt.

Det nye ved dette arbejde er afhængig af analyse af SIAH2 ekspressionsmønster på forskellige niveauer (RNA, proteinekspression og immunhistokemi) i humant NSCLC sammenlignet med raske lunge fra den samme patient. De observerede resultater bebuder den mulige brug af SIAH2 som prognostisk biomarkør for lungekræft.

Materiale og metoder

Patienter og prøver

Lunge vævsprøver fra patienter behandlet kirurgisk for primær lungekræft blev opnået på University Hospital Reina Sofia (Cordoba, Spanien) fra januar 2011 til december 2012. den indsamling, brug og opbevaring af vævsprøver blev godkendt af den etiske og kliniske Komité Universitetshospital Reina Sofia Research. Alle patienter underskrev en skriftligt informeret samtykke dokument, der angiver deres frivillige donation. Sideløbende hermed blev prospektivt indsamlet clinicopatological data, herunder: demografiske data, co-morbiditet, historie neoplasmer, tumorstørrelse, SUV (max) af tumor (maksimal standardiseret optagelse værdi, som mål for

18FDG optagelse), pTNM, tumor kvalitet, og udvikling af metastaser under opfølgning. Vævsprøver blev straks nedfrosset med RNAlater

® (Sigma, St. Louis-MO, USA) og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion og protein-analyse blev udført. De resterende prøve var formalin-fikseret og paraffin-indstøbt for konventionelle diagnostiske undersøgelser og immunhistokemisk analyse. Alle prøver, der indgår i denne undersøgelse blev histologisk revideret og klassificeret som adenocarcinom (n = 36) eller skællede-cellet lungekræft (n = 40). Desuden blev tilstødende normale lungevæv også taget fra alle patienter. Ingen af ​​patienterne havde modtaget kemoterapi eller strålebehandling før operationen. Humane biologiske prøver anvendte indsamles, lagres og forvaltes af Cordoba node tilhører Biobank af den andalusiske Health Service (Servicio Andaluz de Salud-SAS).

Histologisk analyse

immunhistokemisk farvning blev udført på formalinfikserede, paraffinindlejrede humane lunge tumorer. Farvning af cancerceller blev scoret og sammenlignet med perifere normale lungevæv. Fem-mikrometer sektioner fra tumor prøver blev forberedt til væv dias. Snit blev deparaffinised i xylen og rehydreret i en gradueret ethanolserie og destilleret vand. Farvning med hematoxylin-eosin (H Abgent, San Diego, Calif) ved 1 : 50-fortynding blev udført natten over ved 4 ° C. Antigen-genvinding for de dele, der skal farves med anti-Siah mAb eller det polyklonale anti-DYRK2 antistof blev udført ved at inkubere objektglassene i 1 mM EDTA, pH 8,0 i en 98 ° C-100 ° C damper i 30 minutter. SIAH2 IHC-farvning blev bedømt som følger: 0, ingen farvning eller svag cytoplasmatisk farvning i mindre end 10% af tumorcellerne; 1+, svag cytoplasmatisk farvning i mere tan 10% af tumorcellerne; 2+, svag eller moderat cytoplasmatisk farvning i mere end 10% af tumorcellerne; 3+, mere end 10% af stærk cytoplasmatisk farvning. Som tidligere rapporteret, var 0 eller 1+ farvningsintensitet betragtes som DYRK2 negative, hvorimod 2+ eller 3+ blev betragtet som DYRK2 positiv.

mRNA udvinding og qPCR

Total RNA blev ekstraheret fra væv opbevaret i RNAlater

® ved hjælp af RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol, og behandlet med 1 pi (1unit /pl) DNAse-1 (Sigma, USA). Total RNA koncentration og integritet blev analyseret ved anvendelse Experion

® automatiseret elektroforese station (Bio-Rad, CA, USA). Alle de analyserede prøver viste en RIN værdi (RNA Integrity Number) højere end 9. Revers transkription blev udført med iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Real-time PCR blev anvendt med GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) i et iCYCLER detektionssystem (Bio-Rad). Forstærkningsprofilen bestod af en initial denaturering i 5 minutter ved 95 ° C og derefter 40 cykler 30 s ved 95 ° C, annealing i 10 sekunder ved en temperatur på 61,4 ° C (SIAH2 genet) eller 56 ° C (DYRK2 genet) , 30 sekunder ved 72 ° C for forlængelse og et denatureringstrin på 1 minut ved 97 ° C. Amplifikationseffektiviteter blev valideret og normaliseret mod β-actin og HPRT, og fold ændring i genekspression blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔΔCt metode. Følgende primere blev anvendt:

SIAH2-forward: 5′-CTATGGAGAAGGTGGCCTCG-3 ‘

SIAH2-vendegear: 5′-CGTATGGTGCAGGGTCAGG-3′

DYRK2 frem: 5′-GTGGTCAAGGCCTACGATCACA-3 ‘

DYRK2-reverse: 5′-CCGCAGGTGTTCCAGGATTC-3′

HPRT-forward: 5′-ATGGGAGGCCATCACATTGT-3 ‘

HPRT-vendegear : 5′-ATGTAATCCAGCAGGTCAGCA-3 ‘

β-actin-forward: 5′-GCTCCTCCTGAGCGCAAG-3′

β-actin-vendegear: 5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3 ‘

Western blotting og antistoffer

i alt protein ekstrakter fra lungekræft prøver og matchede tilstødende normale lunge blev udvundet fra RNAlater

® bevaret væv. Membraner blev først inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer (anti-SIAH2: sc-5507, fortynding 1: 500, Santa Cruz, anti-DYRK2: AP7534a, fortynding 1: 500, Abgent; anti β-actin: klon C4, fortynding 1: 1000, Santa Cruz). Vaskede membraner blev derefter inkuberet med passende sekundære antistoffer koblet til peberrodsperoxidase. SIAH2 protein signalintensiteter på western blots blev analyseret og kvantificeret ved hjælp ImageJ v1.45 software (https://rsbweb.nih.gov/ij/), efter normalisering til p-actin signalintensiteter.

BEAS-2B squamous-celledifferentiering model

BEAS-2B-celler blev erhvervet fra Sigma (Sigma;. European Collection of cell Cultures, Salisbury, UK 95.102.433) og holdt i serumfrit LHC-9-medium (Life Technologies, Carlsbad, CA , USA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. Pladecellekræft differentiering først opnås efter dyrkning i LHC-9 medium beriget med 10% FBS i 7 dage.

Statistisk analyse

Pearsons chi-square test og Fishers eksakte test blev anvendt til at vurdere forskelle mellem kategoriske variabler. Uparret t-test blev anvendt til sammenligning af middelværdier mellem to kvantitative variable fra normalfordelte data, og Mann-Whitney-test for ikke-normalfordelte data. Kruskal-Wallis test blev anvendt til variabler med mere end to kategorier. Lineær regression analyser blev udført for at vurdere forholdet mellem to kontinuerte variabler. Kontinuerlige variabler er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. Kategoriske variable udtrykkes som tællinger og proportioner. Forskelle med p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af SPSS (SPSS 20,0 til Mac: SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

mRNA ekspressionen af ​​SIAH2 ændres ikke i human lungecancer

syvtiseks kirurgisk resektion humane lungecancer prøver med matchede prøver af tilstødende normale lungevæv blev undersøgt (n = 36 ADC, n = 40 SCC). De klinisk-patologiske karakteristika hele patientens kohorten er opsummeret i tabel 1. Ændringer i ekspressionen af ​​SIAH2 i tumorprøver sammenlignet med normale lunge- prøver blev udtrykt som en fold-ændring. Som vist i figur 1, blev fundet små forskelle i SIAH2 genekspression i både ADC og SCC prøver, men ikke signifikant.

Totalt RNA blev ekstraheret fra væv, integritet evalueret (alle prøverne indeholdt viste en RIN over 9 ) og ændringer i ekspressionen af ​​SIAH2 i tumorprøver sammenlignet med normale lunge prøver fra den samme patient analyseret af qPCR og udtrykt som en fold-ændring. Amplifikationseffektiviteter blev valideret og normaliseret mod β-actin og HPRT, og fold ændring i genekspression blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔΔCt metode. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SD.

SIAH2 protein niveauer er overudtrykt i menneskelig lungekræft

Vi næste undersøgt, om SIAH2 proteinekspression ændres i human lungekræft. Til dette formål blev totale proteiner ekstraheret fra de samme 76 lungekræft prøver, der anvendes ovenfor, og SIAH2 proteinekspression i lungekræft væv sammenlignet med normale lungevæv blev undersøgt ved Western blot. SIAH2 proteinekspression i lungekræft prøver blev sammenlignet med den for den tilsvarende raske væv efter normalisering til actin signalintensiteter, og udtrykt som relativ OD ekspression (repræsentant gel i S1 Fig). Som vist i figur 2, fandt vi, at SIAH2 proteinekspression blev signifikant forøget i både ADC og SCC prøver sammenlignet med normalt lungevæv (Fig 2A og 2B). Endvidere efter at have analyseret gange induktion af SIAH2 i tumorprøver sammenlignet med normale lunge prøver fra den samme patient, blev den højeste SIAH2 proteinekspression fundet i ADC, hvori ekspressionen blev øget med 4 gange sammenlignet med SCC, som viste en 2 fold stigning i SIAH2 proteinniveauer (fig 2C).

(A, B) Total proteiner blev ekstraheret fra ADC eller SDC prøver og den tilsvarende normale lungevæv, SIAH2 proteinekspression analyseret ved Western blot og båndene kvantificeres ved densitometri efter normalisering til actin signalintensiteter. Resultaterne er udtrykt som relativ OD ekspression og repræsenterer middelværdien ± SD. **

s

0,001. (C) Fold induktion repræsentation af SIAH2 i tumorprøver sammenlignet med normale lunge prøver fra den samme patient. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SD. (D) Resultater fra 16 patienter (8 ADC og 8 SCC) udvalgt til at repræsentere en række differentiel mRNA-ekspression mellem normalt lungevæv (N) og tumor (T). SIAH2 proteinekspression blev analyseret ved immunoblots (øvre panel) og mRNA-ekspression af qPCR (nederste panel). Data er gennemsnit ± SD af n = 3 eksperimenter. **

s

0.001 og ***

s

0,0001.

På grund af forskellen i induktionen observeret mellem SIAH2 mRNA og protein niveauer, besluttede vi at analysere mere detaljeret en række 16 prøver (8 ADC og 8 SCC). Disse prøver blev udtaget til en bred vifte af SIAH2 mRNA differentiel ekspression mellem tumor og normalt væv. Som vist i figur 2D, i de fleste tilfælde SIAH2 proteinekspression er forhøjet i tumorer uanset mRNA-ekspression. Disse resultater klart fremgå, at der findes en ændring eller ændring i kontrolmekanismerne på post-transkriptionel niveau i tumorceller i forhold til sundt væv.

SIAH2 udtryk øges i høj kvalitet lungecarcinomer

for at teste, om SIAH2 ekspression kunne korreleres med lunge carcinogenese, besluttede vi at evaluere SIAH2 ekspression og dens lokalisering mønster i lungekræft ved immunhistokemi i den komplette patient kohorte. Vi observerede, SIAH2 ekspression var meget påviselig i både hovedtyper af human lungecancer, bliver udtrykket overvejende nukleare (figur 3). Moderat til stærk homogen farvning blev identificeret i lungekræft prøver sammenlignet med normalt lungevæv, som viste isolerede og lejlighedsvis cellulære farvning.

Repræsentative billeder af lunge tumor og tilstødende normalt væv farvet med SIAH2 antistof og hematoxylin-eosin (HE ) (x100).

For yderligere at undersøge, om endogen SIAH2 proteinekspression ændrer sig med lunge tumor aggressivitet, vi analyserede SIAH2 udtryk i forskellige humane lungekræft, herunder veldifferentieret ADC, dårligt differentieret ADC og SCC. Som vist i figur 4, den procentdel af tumorceller, som udtrykte SIAH2 forøget med den histologiske tumorklassificering, er højest i ringe differentierede lungekræft prøver. Desuden blev en forskel på SIAH2 udtryk mellem SCC og ADC opdaget, med SCC er mere intensivt farvet for SIAH2 forhold til ADC.

Repræsentative billeder af immunhistokemisk analyse af SIAH2 i normal lunge, godt og dårligt differentieret adenocarcinom og skællede cellecarcinom. Lejlighedsvis nukleare positivitet i normal lunge, moderat farvning i godt differentieret adenocarcinom og stærk farvning i dårligt differentieret adenocarcinom og pladecellekræft (HE: hæmatoxylin-eosin) (x100)

associering mellem SIAH2 udtryk og klinisk-patologisk. funktioner

for at vurdere den biologiske betydning af SIAH2 udtryk i human lungecancer, vi undersøgte forholdet mellem forskellige klinisk-patologiske karakteristika (S1 tabel) og ændringer i SIAH2 ekspressionsniveauerne (mRNA og protein) i tumorer i forhold til raske lungevæv . IHC data blev ikke medtaget, fordi SIAH2 udtryk var positiv i alle tumorer. Den syvende udgave af TNM klassifikation for lungekræft (Lung Cancer Staging Project, International Association for Study of Lung Cancer-IASLC) [27] blev anvendt til iscenesættelse. Det er bemærkelsesværdigt, at SIAH2 proteinekspression viste en stærk korrelation med SUV (max) i den primære NSCLC (

s

= 0,014). Desuden øger tumor størrelse korreleret med høj optagelse af

18FDG i PET /CT scanninger (

s

= 0,012) (figur 5).

(A) positiv sammenhæng mellem SIAH2 proteinekspression og 18FDG optagelse (målt som maksimal standardiseret optagelse værdi-SUVmax) i primær NSCLC (

s

= 0,014), r2 = 0,13). (B) positiv sammenhæng mellem stigende tumorstørrelse og 18FDG optagelse på PET /CT-scanninger (

s

= 0,012, r2 = 0,12).

DYRK2 proteinekspression reduceres i human lunge cancer

Næste, besluttede vi at korrelere SIAH2 udtryk med nogle af sine substrater. Vi analyserede derefter de mulige virkninger af den tidligere demonstreret gensidig regulering mellem SIAH2 og DYRK2 i human lungecancer [26] ved immunhistokemi. DYRK2 spiller en vigtig rolle på den DNA-skader-signalvejen og dens lunge udtryk er ikke blevet dybt undersøgt endnu. DYRK2 ekspression blev bestemt i den fuldstændige patient kohorte og repræsentative billeder er vist i fig 6A. Vi observerede en signifikant stigning i DYRK2 ekspression i raske lungeprøver sammenlignet med tilsvarende lungekræft prøver, hvilket antyder, at SIAH2 overekspression er associeret med reduceret ekspression af dens substrater.

(A) Repræsentative billeder af adenocarcinom eller pladecellecarcinom, og tilstødende normalt væv farvet med DYRK2 antistof (x100). (B) BEAS-2B-celler blev dyrket med eller uden serum i 7 dage, lyseres og proteinekspression blev evalueret ved immunblot med de angivne antistoffer (øvre felt) og mRNA-ekspression ved qPCR (nederste panel). Repræsentant blot ud af tre uafhængige forsøg, og de holdninger og molekylvægte (i kDa) er angivet.

Endelig besluttede vi at evaluere de førnævnte resultater ved hjælp af en

in vitro

differentiering model af progenitorceller til lungecarcinom. Derfor undersøgte vi SIAH2 og DYRK2 protein og mRNA ekspressionsniveauer i humane bronchiale epitelcellelinie BEAS-2B. En omvendt ekspression mellem SIAH2 og DYRK2 proteinekspression blev fundet, hverken under normale epitelceller eller når den udsættes for pladedifferentiering (Fig 6B), uden at overholde væsentlige ændringer på mRNA-niveauet. Derfor har vi observeret, at DYRK2 ekspression blev signifikant reduceret i squamous fænotype sammenlignet med normale epitelceller. Tværtimod SIAH2 niveauer steg betydeligt efter fænotype pladedifferentiering. Disse resultater ved hjælp af en

in vitro

differentiering model styrke associering mellem SIAH2 proteinekspression og lungecarcinom observeret i humane prøver, som også er forbundet med en reduceret ekspression af substrater såsom DYRK2.

diskussion

Aktuel litteratur indeholder modstridende oplysninger med hensyn til den rolle, Siah i kræft progression. Derfor er det af afgørende betydning at studere hver enkelt formular separat for at diskriminere deres dominerende rolle på udviklingen af ​​forskellige neoplasmer. Ikke desto mindre har data fra

in vitro

undersøgelser, dyremodeller eller patientkohorter demonstreret en dominerende rolle SIAH2 som et onkogen i solide tumorer og leukemogenesis [12, 19, 28-30]. Vores resultater understøtter denne hypotese, fremhæver, at den observerede stigning i SIAH2 udtryk afhænger af den histologiske tumor klasse.

Betydningen af ​​den rolle, SIAH2 i tumorigenese er blevet valideret i forskellige undersøgelser, der forsøgte at modulere både dens overflod og dets aktivitet. Schmidt RL og kolleger [31], konstrueret mutant Siah1 /2 proteiner med inaktiveret E3-ligaseaktivitet og derfor blokerede selv-ubiquitinering og substrat nedbrydning. De fandt, at nedsat Siah funktion øget celle apoptose og havde hæmmende virkning på tumorvækst, konkluderede, at Siah medierer oncogene Ras-medieret tumorigenese i kræft i bugspytkirtlen. Den samme gruppe offentliggjorde det første værk, der analyseres i detaljer rolle Siah proteiner i lungekræft [32]. Forfatterne viste, at SIAH2 spiller en kritisk patogen rolle i human lungekræft og derfor åbnet en mulighed for at inhibere Siah handling som ny anticancer mål. Selvom konklusionerne hovedsageligt var baseret på human cellelinje eksperimenter, en foreløbig tilgang med menneskelig lungekræft prøver viste en stærk sammenhæng mellem øget Siah proteinekspression og tumorcelleproliferation. Den største ulempe ved denne undersøgelse er, at hvis ikke skelne mellem de to medlemmer af familien, SIAH1 og SIAH2. Endvidere er detaljeret SIAH2 ekspression på forskellige niveauer mangler.

I en anden undersøgelse om den rolle, SIAH1 og SIAH2 i en syngen model af brystcancer [33], forfatterne bemærkede, at blokade af Siah-substratbindingssted resulterede i reduceret tumorvækst og angiogenese. Disse resultater er også i overensstemmelse med dem, der rapporteres af Qi J og kolleger [34] i en mus SW1 melanom model. Hæmning af SIAH2 aktivitet gennem et RING mutant, dominant-negative form for SIAH2 reducerede tumorigenese, mens blokade af SIAH2-substrat bindingssted reduceret metastaser, men ikke har en indvirkning på tumordannelse. Den samme gruppe undersøgte bidrag SIAH2 i TRAMP model af neuroendokrin prostatacancer [19]. Vigtigere, genetisk knockout af Siah2 svækket udviklingen af ​​neuroendokrine prostatacarcinom. Desuden blev både hyppigheden og størrelsen af ​​metastatiske læsioner væsentligt reduceret. I tråd med denne iagttagelse, i en brystkræft model forfatterne fandt, at tabet af SIAH2 forsinket tumor debut, reducerede stromal infiltration, øget tumor perfusion gennem normaliseret tumorvaskulatur, nedsat produktion af proangiogene vækstfaktorer og i sidste ende førte til en øget følsomhed til kemoterapi [28].

for nylig, Muller og kolleger har vist, hvordan SIAH2 accelererer proteasomalaktivitet nedbrydning af Tyk2, hvilket fører til STAT3 inaktivering i lungekræft celler [35]. De viste også en omvendt korrelation mellem ekspression af begge proteiner i NSCLC prøver fra forskellige patientkohorter. Desuden har de også vist sig, at SCC viste signifikant højere niveauer af SIAH2 sammenlignet med ADC. Disse resultater er overensstemmende med dem, der opnås i det foreliggende arbejde, hvori den immunhistokemiske analyse viste en højere SIAH2 ekspression i SCC prøver sammenlignet med ADC prøver. Disse resultater fremhæver ikke kun betydningen af ​​SIAH2 udtryk, men også udtryk for nogle af sine substrater, der spiller afgørende roller i reguleringen af ​​kræft cellevækst og carcinogenese. Vi havde tidligere demonstreret en gensidig regulering mellem DYRK2 og SIAH2, hvorved SIAH2 formidler DYRK2 ubiquitinering og styrer sit udtryk som reaktion på hypoxi [26]. DYRK2 er medlem af en evolutionært bevaret familie af dobbelt specificitet tyrosinphosphorylering-regulerede kinaser (DYRKs), som spiller en vigtig rolle i DNA beskadigelse-signalvejen og celleproliferation. Selv rolle DYRK2 i kræft progression fortsat uklart, har en lavere udtryk i invasive tumorer blevet beskrevet [36]. Vi viste, hvordan stigningen i SIAH2 udtryk derfor undertrykker DYRK2 udtryk. Disse resultater tyder på muligheden for, at akkumuleringen af ​​SIAH2 kunne omvendt korreleret med ekspressionen af ​​vigtige proteiner, der styrer tumorudvikling og invasion, som DYRK2 eller STAT3, påpege SIAH2 som et potentielt terapeutisk mål.

I den første gang nogensinde, vurderet vi SIAH2 udtryk på forskellige niveauer i primær lungekræft i forhold til tilstødende normale lungevæv. Vi fandt en tendens til en induktion af SIAH2 genekspression i SCC sammenlignet med tilstødende normale lungevæv, men ikke signifikant. Tværtimod har vi ikke finde forskelle i SIAH2 genekspression i ADC prøver. Dette er i skarp kontrast til SIAH2 proteinekspression undersøgt ved Western blot, som blev signifikant forøget i både ADC og SCC prøver sammenlignet med normale lungevæv. Disse resultater peger klart på den mulige eksistens af en eller anden ændring på post-transkriptionel niveau i tumorceller sammenlignet med raske væv. Til dato, SIAH2 fosforylering er måske den vigtigste mekanisme kontrol over SIAH2 selv-ubiquitinering og nedbrydning [26, 37, 38]. Ændringer eller ændringer i ekspressionen af ​​disse kinaser i stand til at phosphorylere SIAH2 i tumorceller kunne være en af ​​de underliggende mekanismer, der er ansvarlige for denne forskel mellem mRNA og protein udtryk.

De har også skiller sig ud, at den højeste SIAH2 proteinekspression var findes i ADC histologi forhold til SCC histologi ved analyse ved western blot, eftersom analysen gennem immunohistokemi viste forskellige resultater. Men disse resultater parallelt en tidligere undersøgelse, der viser en højere ekspression af SIAH2 i SCC sammenlignet med det analyserede ved immunhistokemi i tre forskellige kohorter [35] ADC. Tumor størrelse er en velkendt prognostisk faktor i NSCLC, og er forbundet med FDG optagelse i PET /CT-scanninger. Efter aftale, fandt vi en stærk sammenhæng mellem øget tumor størrelse og

18FDG optagelse målt som SUV (max), og kan være nyttige til at forudsige NSCLC patient prognose. Endnu vigtigere, viste SIAH2 proteinekspression en stærk korrelation med

18FDG optagelse, som kan hjælpe klinikerne i stratificere patienter med øget samlede risiko for dårlig overlevelse.

Konklusioner

Vores resultater indikerer en vigtig associering mellem ekspressionen af ​​SIAH2 og lungekræft, som også er forbundet med den histologiske tumorklassificering,

18FDG optagelse og med et fald i ekspressionen af ​​SIAH2 substrater såsom DYRK2. Disse resultater understreger den mulige anvendelse af SIAH2 som diagnostisk og prognose markør i lungekræft. Specifikt vores fund antyder, at analysen af ​​SIAH2 kunne forbedre diagnosticering af lungecancer og kunne uddybe den nuværende viden om dens prognose. Desuden kunne det endda blive en mulig terapeutisk mål for NSCLC.

Støtte Information

S1 Fig. Repræsentativ gel af SIAH2 proteinekspression i lungekræft prøver sammenlignet med den tilsvarende raske væv efter normalisering til actin signalintensiteter.

Værdierne nedenfor gelerne indikerer SIAH2 og actin protein signalintensiteter (kvantificeret ved anvendelse ImageJ). SIAH2 relativ OD udtryk i tumor prøve i forhold til normalt væv blev beregnet efter normalisering til actin signalintensiteter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0143376.s001

(TIFF)

S1 Table.